Extracto
pancreático adenocarcinoma ductal (PDAC) es altamente resistente a los regímenes de quimioterapia actuales, en parte debido a alteraciones en el tumoral p53 vía supresora. p63 p53 homólogo es un factor de transcripción esencial para el desarrollo y la diferenciación de las superficies epiteliales. Sin embargo, su función en el cáncer es controversial y su papel en PDAC no se conoce. Descubrimos que ΔNp63α era la variante de p63 se expresa predominantemente en líneas celulares de cáncer de páncreas. ΔNp63α proteínas y los niveles de mRNA fueron altas en T3M4, BxPC3 y cáncer de páncreas células COLO-357 y la baja en las células PANC-1 ASPC-1 y. La sobreexpresión de ΔNp63α en las células PANC-1 y desmontables shRNA mediada por células T3M4 indicó que ΔNp63α promovido dependiente de anclaje e independientes del crecimiento, la motilidad y la invasión, y una mayor resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino. Epidérmico receptor del factor de crecimiento (EGFR) vías de señalización contribuyen a la agresividad biológica del PDAC, y hemos encontrado que los efectos de motogénica ΔNp63α fueron aumentados en presencia de EGF. La expresión ectópica de ΔNp63α resultó en la regulación positiva de EGFR y β1-integrina en las células PANC-1. Por el contrario, ΔNp63α caída tuvo un efecto contrario en las células T3M4. ΔNp63α potenció la activación mediada por EGF de ERK, Akt y la señalización de JNK. inmunoprecipitación de la cromatina y los ensayos de reportero funcionales demostraron que ΔNp63α activa la transcripción EGFR. 14-3-3σ la transcripción también fue regulada positivamente por ΔNp63α y hemos demostrado anteriormente que 14-3-3σ contribuye a la quimio-resistencia en líneas celulares de cáncer de páncreas. Por el contrario desmontables, shRNA mediada de 14-3-3σ llevó a la derogación de los efectos ΔNp63α sobre la proliferación celular y la invasión. De este modo, p53 homólogo ΔNp63α aumenta el potencial oncogénico de células de cáncer pancreático a través de trans-activación de EGFR y 14-3-3σ
Visto:. Danilov AV, Neupane D, Nagaraja AS, Feofanova EV, Humphries LA, DiRenzo J, et al. (2011)
DeltaNp63alpha-
mediada por la inducción del factor de crecimiento epidérmico promueve el crecimiento celular del cáncer pancreático y quimiorresistencia. PLoS ONE 6 (10): e26815. doi: 10.1371 /journal.pone.0026815
Editor: Toru Ouchi, Universidad de Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 7 Julio, 2011; Aceptado: 3 de octubre de 2011; Publicado: 28 Octubre 2011
Derechos de Autor © 2011 Danilov et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por un Departamento de Medicina Premio junior Faculty (Dr. Danilov), un Premio Norris Cotton Cancer Center de Prouty Proyecto piloto (Dr. Danilov), un Premio de la Fundación Hitchcock (Dr. Danilov), y por el Instituto Nacional del cáncer de subvención CA- R37-075059 (Dr. Korc). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Estudios en la enfermedad humana demuestran que la mayoría de los tumores establecidos llevan más de un defecto genético. adenocarcinoma ductal (PDAC) Resultados de páncreas de la acumulación sucesiva de mutaciones de genes [1]. La activación de mutaciones en K-oncogén Ras y la inactivación de los supresores de tumor CDKN2A, p53 y SMAD4 están implicados en el desarrollo y progresión PDAC [2]. modelos de ratones genéticamente modificados han apoyado la hipótesis de "doble golpe", donde la introducción de cualquiera de los alelos mutantes de p53 o supresión bialélicas INK4a /Arf en ratones resulta en la progresión de las lesiones neoplásicas intraepiteliales pancreáticas con la invasión y metástasis locales [3], [4]. mutaciones de p53 se encuentran en 60 a 70% de PDAC. Por el contrario, p63, un miembro de la familia ancestral de p53, rara vez se encuentra mutado en el cáncer.
Seis variantes de p63 se generan a través de la transcripción a partir de dos promotores diferentes y empalme alternativo. Isoformas transcritos a partir de P1 contienen un dominio trans-activación de longitud completa (TAp63α, β y γ). La transcripción a partir P2 genera variantes amino-terminal truncado (ΔNp63α, ß y?), Cuyo papel exacto en el cáncer no está claro. La variante ΔNp63 se sobreexpresa en una variedad de cánceres humanos, incluyendo tumores de origen de células escamosas (cabeza y cuello, pulmón), mama y vejiga [5]. En la cabeza y el carcinoma de células escamosas del cuello y las células de cáncer de mama "triple negativo", ΔNp63 suprime la apoptosis dependiente de p73-y por lo tanto promueve la supervivencia del tumor [6], [7]. Por el contrario, regulación a la baja de ΔNp63α en líneas celulares de carcinoma urotelial promueve la invasividad del cáncer [8], lo que sugiere que la variante Delta N puede funcionar de una manera específica del tipo celular.
El papel de p63 en PDAC es poco conocida. Aquí se demuestra que la variante ΔNp63α se expresa en niveles variables en líneas celulares PDAC, y aportar pruebas de que ΔNp63α promueve el crecimiento de células de cáncer de páncreas, la migración, la invasión y la quimio-resistencia. A través de la activación transcripcional directa, ΔNp63α conduce a la sobre regulación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y 14-3-3σ, sensibilización de las células cancerosas a EGF y la mejora de su potencial oncogénico.
Métodos
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer de páncreas humanos ASPC-1, BxPC3 y PANC-1; células de riñón embrionarias humanas HEK293 y células de carcinoma de pulmón humano H1299 fueron adquiridos de American Type Culture Collection (Manassas, VA). líneas celulares de cáncer de páncreas humano COLO-357 y T3M4 fueron un regalo de Dr.R.Metzgar (Duke University, Durham, Carolina del Norte). Las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI o DMEM (HEK293) suplementado con 10% de suero bovino fetal, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (medio completo).
Plásmido construcciones
el (p53RE)
plásmido 5-tk-luciferasa ratón ΔNp63α plásmidos de expresión y humanos y se informó anteriormente [9]. plásmido de expresión TAp63α fue adquirido de Applied abierto (Huntsville, AL). PBV-14-3-3σ promotor BDS 2 3 × (sitio de unión de p53) plásmido -luc se obtuvo de Addgene (Cambridge, MA). promotor pGL3-EGFR (sitios de unión de p53) -luc plásmido fue un regalo del Dr. L. Pirisi [10]. modificaciones de la secuencia dentro de una codificación de un dominio de unión al ADN del plásmido de expresión ΔNp63α humana y dentro de EGFR promotor sitio de unión a p53 1 se introdujeron usando el Quick-Change sitio mutagénesis dirigida Kit (Stratagene, La Jolla, CA).
Immunoblotting
Las células se lisaron en tampón RIPA (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1% NP-40, 1 mM NaF, 1 mM de fosfato de sodio, NaVO3 1 mM, 1 nM EDTA, 1 nM EGTA, complementado con cóctel inhibidor de proteasa (Roche, Indianapolis, IN) y 1 mM de PMSF). Las proteínas se analizaron por inmunotransferencia como se describe anteriormente [11]. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: p63 (4A4; Millipore, Billerica, MA; 1:500); TAp63γ (Li et al, 2006;. 1:1,000), 14-3-3σ (Abcam, Cambridge, MA; 1:500), ERK-2 (C-14; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 1: 10.000), p53 (DO-1; Santa Cruz Biotechnology; 0,4 mg /ml), EGFR (Calbiochem; 1:2,000), poli escindido (ADP-ribosa) polimerasa (PARP), se escindió de la caspasa-3, ERK-1/2 , fosfato ERK1 /2 [/Y204 T202], Akt, fosfo-Akt [S473] (Tecnología de Señalización celular, Danvers, MA; 1:1,000), JNK activa (Promega, Madison, WI), rábano picante anti-conjugado con peroxidasa anticuerpos de ratón y anti-conejo (BioRad; 1:5,000).
reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)
El ARN total fue aislado utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA ). El ADNc se sintetizó a partir de 1 g de ARN mediante cebado hexámeros aleatorios usando el kit de superíndice III RT (Invitrogen, Carlsbad, CA). Semi-RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando adelante y cebadores específicos para p63 isoformas inversa tal como se publicó anteriormente [12]. Se utilizaron las siguientes condiciones de ciclado de PCR: 94 ° C durante 3 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 40 segundos, 55 ° C durante 40 seg, y 72 ° C durante 1,5 min; y 72 ° C durante 4 min.
Para el análisis de ΔNp63 y TAp63 transcripción expresión cuantitativa en tiempo real PCR (Q-PCR) se realizó en un Detector de Secuencia 7300 usando PCR Universal Master Mix de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA), de ADNc y de genes plantilla sondas específicas (Hs00978339_m1 [ΔNp63]; Hs00978349_m1 [TAp63]; Applied Biosystems). Todas las muestras se analizaron por duplicado.
transfecciones transitorias, infección y luciferasa ensayos adenovirales
células PANC-1 y T3M4 fueron transfectadas transitoriamente con ExGen 500
vitro
reactivo de transfección en ( Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), utilizando la misma cantidad de plásmido experimental o de control. Las células se incubaron durante 48 horas y la expresión de proteínas se verificó mediante inmunotransferencia. Los adenovirus de control y ΔNp63α expresan se utilizaron como se describe [13]. células ASPC-1 y Panc-1 fueron infectados con adenovirus a una MOI de ~ 5 en medio completo durante 24 horas.
Para los ensayos de luciferasa, PANC-1 células fueron co-transfectadas con el plásmido de control o experimental y la luciferasa reportero construir (promotor PBV-14-3-3σ BDS 2 × 3 (sitio de unión de p53) -luc, o pGL3-EGFR promotor-luc) junto con pCMVβ vector (Clontech Laboratories, Mountain View, CA). La cantidad de ADN por transfección se mantuvo constante mediante el uso de vacío vector pcDNA3.1. Las células se recogieron 48 horas después de la transfección y luciferasa Los ensayos se realizaron utilizando el sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega). unidades de luz relativas se determinaron utilizando un luminómetro (LMaxII
384, Molecular Devices, Sunnyvale, CA) para la luciferasa de luciérnaga. β-galactosidasa se determinó la actividad usando un método colorimétrico para normalizar la eficiencia de transfección [14].
Lentiviral shRNA de genes mediada por el silenciamiento
Lentivirus que contiene shRNA orientación-α específica, TAp63 específica, todas las isoformas de p63 y Control SH fueron descritas anteriormente [15]. 14-3-3σ-focalización y control basado en Lentivirus shRNA también fueron descritos por nosotros previamente [11]. partículas lentivirales se produjeron mediante cuatro sistema de transfección de plásmidos [11]. Desmontables de isoformas p63 y 14-3-3σ en T3M4 y células Panc-1 se confirmó por transferencia de Western y Q-PCR.
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5 -diphenyltetrazolium bromuro (MTT) ensayo de
las células se sembraron en placas de 96 pocillos (3.000 células por pocillo, 6 pocillos por muestra) y se cultivaron en ausencia o presencia de 10 mg /ml de cisplatino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) durante 48 horas. Se añadió MTT (Sigma-Aldrich) a una concentración final 0,55 mg /ml. Después de 4 horas de incubación adicional, la absorbancia a 570 nm se determinó usando un lector de precisión de microplacas Emax (Molecular Devices). Hemos observado anteriormente que en líneas celulares de cáncer de páncreas el ensayo MTT se correlaciona con el crecimiento celular como se determina en una duplicación y [
3H] ensayos de incorporación de timidina [16].
ensayos de agar blando
ensayos de agar blando se establecieron en placas de doce pocillos, cada pocillo que contiene una capa inferior de 0,5% de agar noble Difco (BD Biosciences), una capa media de 0,3% de agar incluyendo 1500 células, y una capa superior de 0,3% de agar. Las placas se incubaron durante 14 días. A continuación, 150 ml de 5 mg /ml de solución de MTT se añadieron a cada pocillo. Después de la incubación a 37 ° C durante 4 horas placas fueron fotografiados y se contaron las colonias.
Ensayos
migración celular y la invasión
motilidad celular se evaluó en
in vitro
curación de heridas y en ensayos de migración Transwell. Para heridas ensayos de curación, las células se hicieron crecer hasta la confluencia en placas de cultivo tisular de 6 pocillos, y privadas de suero durante 12 horas. La monocapa de células resultante se rascó con una punta de pipeta 10 l generar dos heridas paralelas y se incubó durante 18 horas en medio libre de suero (SF; 0,1% de albúmina de suero bovino) en la ausencia o presencia de 1 nM EGF (Millipore). Se tomaron fotografías de cada pocillo a cuatro lugares marcados bajo 40 aumentos a las cero y 18 horas después de la herida. El área de la herida de imágenes emparejados se midió usando el software ImageJ (Institutos Nacionales de la Salud). Para los ensayos de migración Transwell, células se suspendieron en 100 l de medio SF y se coloca sobre el compartimento superior de las cámaras Transwell (8 micras de tamaño de poro, Corning Incorporated, Corning, NY). Para ensayos de invasión, las células se suspendieron en 500 l de medio SF y se colocan en compartimiento superior de las cámaras Transwell recubiertas con Matrigel (8 micras de tamaño de poro, BioCoat Matrigel Invasión Chambers; BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ). En ambos ensayos Transwell, el compartimiento inferior se llenó con 750 l de medio SF en la ausencia o presencia de 1 nM EGF. Después de 18-20 h, las membranas fueron fijadas en metanol, se tiñeron con azul de toluidina (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) y se contaron usando un microscopio de luz.
reticulación de formaldehído, la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) y la amplificación por PCR
para la reticulación de ADN-histona, 2 × 10
6 células se incubaron con 1% de formaldehído en medio completo durante 10 minutos. Las células se lavaron dos veces en PBS enfriado con hielo y se lisaron en tampón de lisis SDS (Millipore) completa con cóctel inhibidor de la proteasa (Roche). Proteína lisados se sometieron a ultrasonidos para producir fragmentos de cromatina de ~ 500 pb como se evaluó por electroforesis en gel de agarosa. Después de pre-compensación, los lisados de proteínas se incubaron a 4 ° C durante la noche con 2 g p63α anticuerpos (H-129, Santa Cruz) o con IgG de conejo como anticuerpos de control de isotipo específico (Santa Cruz). Los inmunocomplejos se lavaron y el ADN fue purificado utilizando el kit de ensayo ChIP (Millipore) y QiaQuick PCR Purification Kit (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las condiciones de PCR y cebadores para los sitios de unión de consenso 14-3-3σ 1 y 2 se informó anteriormente [17]. Los siguientes cebadores y condiciones de PCR se utilizaron para el sitio de unión de EGFR promotor p53: cebador directo 5 'GGCCGCTGGCCTTGGGTC 3'; cebador inverso 5 'GCCGTGCGCGGTGGTTG 3'; 1 ciclo de 94 ° C durante 5 min, 43 ciclos de 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 50 seg, seguido de 1 ciclo de 72 ° C durante 10 min. PCR se realizó usando el kit HotStarTaq de la polimerasa (Qiagen), con el uso de Q-Solution en el ensayo de EGFR PCR.
inducida por cisplatino apoptosis
se incubaron las células del cáncer pancreático para 24 h en medio completo en ausencia o presencia de 5 o 10 mg /ml de cisplatino para el 2 h inicial, 6 h o toda la 24 h. Se recogieron tanto las células flotantes y adherentes y se sometieron a inmunotransferencia.
Resultados
ΔNp63α expresión en líneas celulares de cáncer de páncreas
Se encontró que p63 se expresó diferencialmente en líneas celulares de cáncer de páncreas . los niveles de proteína p63 fueron más altos en las células T3M4 y BxPC3, intermedio en COLO-357 y por debajo del nivel de detección en las células PANC-1 (Fig. 1A) ASPC-1 y. Puesto que el anticuerpo p63 (clon 4A4) reconoció los seis isoformas conocidas de p63, se compararon los niveles de p63 mRNA de transcripción en las líneas celulares anteriores. Todas las líneas celulares expresaron niveles bajos de TAp63 mRNA (Fig. 1B). Por el contrario, las transcripciones de ARNm ΔNp63 fueron relativamente elevados en BxPC3, COLO-357, y las células T3M4 (fig. 1B).
Un
, los niveles de proteína de p63, 14-3-3σ, TAp63γ y p53 en líneas celulares de cáncer de páncreas.
B Opiniones, la expresión de ARNm de TAp63 y ΔNp63 isoformas de p63 en líneas celulares de cáncer de páncreas. El ARN total aislado a partir de líneas celulares PDAC fue inverso-transcrito y se sometió a PCR en tiempo real con sondas específicas para Delta n y TA isoformas de p63. Los resultados fueron normalizados a 18S niveles, y se expresaron como media de dos experimentos independientes realizados por duplicado en los que se obtuvieron resultados similares.
C
, la expresión del ARNm de p63 variantes de corte y empalme en líneas celulares de cáncer de páncreas. Los niveles se normalizaron a la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) valores.
A fin de dilucidar si una variante de corte y empalme particular de p63 se expresa en líneas celulares de cáncer de páncreas, se emplearon semi-cuantitativos RT-PCR con cebadores específicos de variantes de corte y empalme p63 (Tabla S1). Se confirmó que las transcripciones de ARNm TAp63α se expresaron en niveles relativamente bajos y similares en todas las cinco líneas de células. Por el contrario, las transcripciones de ARNm ΔNp63α solamente se expresaron en BxPC3, COLO-357, y las células T3M4, mientras que ΔNp63γ mRNA fue apenas detectable en BxPC3 y T3M4 células (Fig. 1C). Aunque p63α se pueden detectar en un ensayo de PCR específico, la detección aislada de transcritos de ARNm p63β es poco fiable ya que su extremo C-terminal no es única (Fig. S1). En nuestros experimentos, la expresión de mRNA transcrito ΔNp63β correlacionada con la expresión ΔNp63α, probablemente debido a la amplificación no específica de ΔNp63α. Dado que se detectó la migración de proteína p63 en ~68 kDa y proteína ΔNp63β migra a ~52 kDa [18] - [20], llegamos a la conclusión de que era ΔNp63α la variante de p63 se expresa predominantemente en células de cáncer de páncreas
efectos oncogénicos. de ΔNp63α en las células de cáncer de páncreas
Para estudiar los efectos biológicos de ΔNp63α en PDAC, manipulamos su expresión en células PANC-1 y T3M4, que tenían los niveles endógenos de bajo y alto de ΔNp63α, respectivamente (Fig. 1) . células PANC-1 se transfectaron transitoriamente con un vector ΔNp63α que expresan (PANC-1ΔN), un vector TAp63α que expresan (PANC-1TA), o el control plásmido. Se utilizó lentiviral mediada shRNA para regular a la baja isoformas del gen p63 en células T3M4. Dos secuencias diferentes shRNA, uno complementarios a una secuencia dentro de un dominio de unión al ADN de p63 (sh DBD) y dirigidos por tanto, todas las isoformas de p63, y otro complementario a una secuencia dentro del dominio alfa motivo estéril (SAM) y dirigidos tanto TAp63α y ΔNp63α ( p63α sh) se determinaron para reducir los niveles de proteína y ΔNp63α de transcripción en células T3M4 (Fig. 2A). Mientras shRNA dominio de dirección de trans-activación (sh TAp63) resultó en niveles TAp63 transcripción reducidos, esto no se tradujo en un cambio apreciable en el total de los niveles de proteína p63 (Fig. 2A), lo que confirma nuestra observación de que la variante ΔNp63α predomina en líneas celulares de cáncer de páncreas .
Un
, células T3M4 se infectaron con virus que expresan GFP, o-p63 específicos shRNA complementarias para DBD, TA y alfa-específica dominios de p63. De células enteras lisados de proteínas se sometieron a inmunotransferencia (panel superior). Se aisló el ARN total, transcrito de forma inversa y se sometió a PCR en tiempo real con sondas específicas para Delta n y TA isoformas de p63. Los resultados se normalizaron a los niveles de 18S (panel inferior). Derribo de las isoformas de p63 se controló de forma rutinaria durante los experimentos posteriores.
B Opiniones, ΔNp63α estimula el crecimiento independiente de anclaje de células PANC-1 en el ensayo de agar blando (paneles de la izquierda e inferior) y la proliferación celular en el ensayo de MTT (panel derecho). células PANC-1 se transfectaron transitoriamente con el vector, TAp63α o vector de control ΔNp63α-expresión. Cell se sembraron en agar blando a una densidad de 1.500 /pocillo de una placa de 12 pocillos, cuatro pocillos por muestra. Se contaron las colonias después de 14 días de incubación. Para MTT Se sembraron células de ensayo en placas de 96 pocillos, seis pocillos por muestra. MTT se añadió después de la incubación durante 48 h. Los datos son la media ± DE de cuatro experimentos independientes. *, P & lt; 0,001 en comparación con el control.
C
, regulación a la baja de ΔNp63α frena la proliferación de las células T3M4 en un ensayo clonogénico. Reconstitución de ΔNp63α restaura parcialmente la capacidad proliferativa. Las células se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de 500 células /pocillo. 14 días más tarde, las placas se fijaron en 03:01 metanol: ácido acético glacial y se tiñeron con 2% de cristal violeta. Los datos son la media ± SE de tres experimentos independientes realizados por triplicado. *, P & lt; 0,01 en comparación con el control (ctrl sh).
D-F
, Efecto de p63 sobre la motilidad celular medida en ensayos de curación de heridas en PANC-1 (
D
) y las células T3M4 (
E, F
). Las células se incubaron en condiciones libres de suero (SF) en la ausencia o presencia de 1 nM EGF durante 18 h después de hacer un rasguño. Se realizó un análisis cuantitativo de las imágenes. La expresión ectópica de ratón en células SH ΔNp63α p63α T3M4 resultó en una restauración parcial de la motilidad celular (
F
); correspondientes niveles de proteína ΔNp63α se muestra a continuación. Los datos son la m ± SE de al menos tres experimentos independientes. Representante imágenes muestran (ampliación × 40). *, P & lt; 0,001 en comparación con el control (ctrl sh).
G y H
, Efecto de ΔNp63α sobre la invasión de Matrigel en cámaras. PANC-1 (
G
) o T3M4 (
H
) las células se sembraron en cámaras de Matrigel (5 × 10
4 /ml) y se incubaron en ausencia (SF) o presencia de 1 nM EGF durante 18 horas. Efecto se normalizó a la invasión de control en condiciones de SF. *, P. & Lt; 0,001 en comparación con el control (ctrl sh) guía empresas
Dado que el crecimiento independiente del anclaje es una característica de las células malignas, se estudió si ΔNp63α tiene un efecto sobre el crecimiento independiente de anclaje y la proliferación celular en PDAC. PANC-1ΔN, pero no las células PANC-1TA exhiben una mayor formación de colonias en ensayos de agar blando y el aumento de la proliferación celular en ensayos de MTT (Fig. 2B). Dado que las células T3M4 son incapaces de formar colonias en agar blando, la proliferación se estudió en un ensayo clonogénico. En comparación con las células de control, la proliferación de las células T3M4 se redujo en respuesta a shRNAs que se dirigen a la DBD o el C-terminal-α específica y sin cambios en respuesta a sh TAp63 (Fig. 2C). la sobreexpresión transitoria de ratón ΔNp63α cDNA, que lleva una mutación silenciosa en la región objetivo por el shRNA-α específica, dio lugar a un rescate parcial de la capacidad proliferativa de las células SH p63α T3M4, en comparación con las células transfectadas con el vector de control (Fig. 2C ).
ΔNp63α es conocido para regular el programa de adhesión en las células epiteliales mamarias y queratinocitos [15]. Dada la importancia de la adhesión celular en la invasión tumoral y la progresión, se estudiaron los efectos de ΔNp63α en la motilidad y capacidad invasiva de las células del cáncer pancreático. En los ensayos de curación de heridas, las células PANC-1ΔN demostrado una mayor motilidad de las condiciones SF, mientras que la sobreexpresión de TAp63α no tuvo ningún efecto (Fig. 2D). Puesto que la activación de la vía del EGFR se asocia con un aumento de la agresividad del tumor y la disminución de la supervivencia en PDAC [21], hemos tratado de determinar el efecto del EGF sobre la motilidad. estimulación de EGF mejorado la migración en PANC-1ΔN y control de las células (Fig. 2D). Del mismo modo, las células que expresan T3M4 p63α sh, sh, pero no TAp63, exhibieron una reducción de la motilidad tanto al inicio del estudio y en presencia de EGF (Fig. 2E). sobreexpresión transitoria de ΔNp63α ratón en células que expresan T3M4 p63α sh dio lugar a un rescate parcial de la motilidad fenotipo (Fig. 2F). La manipulación de los niveles de expresión ΔNp63α no tuvo efecto sobre la invasión de células de cáncer pancreático en cámaras de Matrigel en las condiciones SF (Fig. 2G, H). Sin embargo, la estimulación con EGF condujo a un aumento espectacular de la capacidad invasiva de las células Panc1-Delta n (Fig. 2G). En consonancia con las conclusiones anteriores, mediada por la supresión del shRNA ΔNp63α, pero no TAp63, redujo significativamente la capacidad de las células para invadir T3M4 través de Matrigel en respuesta a la estimulación de EGF (Fig. 2H).
En conjunto, nuestros resultados indican que ΔNp63α mejora la capacidad de formación de colonias, proliferativa e invasiva de las células de cáncer de páncreas.
ΔNp63α regula al alza EGFR y sensibiliza a las células de cáncer de páncreas a los efectos de EGF
en comparación con el páncreas normal, EGFR proteínas y mRNA se expresan a niveles elevados en el cáncer de páncreas [22]. la expresión de EGFR mRNA predice una menor supervivencia y la mala respuesta a la quimioterapia en pacientes con PDAC [23]. En nuestro trabajo, ΔNp63α potenció drásticamente la motilidad celular y el cáncer de páncreas capacidades invasivas en presencia de EGF. Para explicar este fenómeno, se estudió el efecto de ΔNp63α en los niveles de EGFR. Se determinó que la expresión de ingeniería de ΔNp63α en las células PANC-1 una mayor expresión de EGFR, mientras que ectópico TAp63α no tuvo ningún efecto (Fig. 3A). En consonancia con esta observación, se encontró que los niveles de EGFR se redujeron en células T3M4 en respuesta a la supresión mediada por shRNA de ΔNp63α (Fig. 3B), la documentación de este modo una correlación directa entre la expresión de EGFR ΔNp63α y en líneas celulares de cáncer de páncreas. Para estudiar los efectos de la sobreexpresión ΔNp63α sobre la señalización de EGFR, se evaluó la activación de las quinasas corriente abajo a la estimulación de EGF. El tratamiento de células Panc1-Delta n con EGF resultó en una mayor fosforilación de ERK, Akt y JNK (Fig. 3C). En estas células, las tres quinasas exhiben una mayor nivel de activación a incluso a los 10 minutos después de la estimulación de las células, y la actividad de ERK persistieron durante 60 minutos.
Un
, la expresión ectópica de resultados en ΔNp63α aumento de la expresión de EGFR y β1-integrina en las células PANC-1. Después se incubaron las células durante 48 horas, el total de los lisados de proteínas se sometieron a inmunotransferencia. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes.
B Opiniones, regulación a la baja de ΔNp63α en T3M4 células da lugar a disminución de expresión de EGFR y β1-integrina. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes.
C
, PANC-1ΔN y control de las células PANC-1 fueron estimulados con EGF durante los períodos de tiempo indicados. Proteína lisados se sometieron a inmunotransferencia. Se muestra una imagen representativa de tres experimentos independientes.
A continuación, se emplea un inhibidor de la tirosina quinasa de afirmar que los efectos de ΔNp63α fueron mediadas a través de la vía del EGFR. Erlotinib es un inhibidor reversible de la señalización EGF, que se asocia con el sitio de unión a ATP del receptor. La incubación de células PANC-1 con erlotinib 1 M atenuó la mejora mediada por ΔNp63α de la formación de colonias, la motilidad y la invasión (Fig. S2), excluyendo así la posibilidad de un efecto no específico. Por el contrario, los niveles de proteína p63 no fueron afectadas cuando las células se incubaron con EGF o erlotinib (datos no mostrados).
informes anteriores sugirieron que ΔNp63α es capaz de regular las proteínas de adhesión celular en las células epiteliales mamarias [15]. Desde las interacciones de células tumorales mediada por la integrina con la matriz extracelular juegan un papel crítico en la determinación del fenotipo invasivo en PDAC, se investigó si ΔNp63α tuvo un efecto sobre la expresión de integrina en las células de cáncer de páncreas. La expresión ectópica de ΔNp63α en las células PANC-1 aumentó la expresión de β1-integrina, mientras que la expresión de α3- y a5 integrinas se mantuvo sin cambios (Fig. 3A). Por el contrario, la supresión mediada por shRNA de ΔNp63α condujo a una disminución en β1-integrina en las células T3M4 (Fig. 3B).
Por lo tanto, ΔNp63α contribuye a la potencial oncogénico de células de cáncer pancreático, al menos en parte, a través de la regulación positiva de EGFR y β1-integrina.
ΔNp63α contribuye a la resistencia a la quimioterapia en las células de cáncer de páncreas
Desde PDAC es notablemente resistente a los agentes de quimioterapia, se estudió el papel de ΔNp63α en resistencia a la quimioterapia. Se ha demostrado previamente que el cisplatino induce la degradación de ΔNp63α través de la estimulación de I? B quinasa [24]. De acuerdo con estos datos, la incubación de líneas celulares de cáncer pancreático con 10 g /ml de cisplatino resultó en la degradación de ΔNp63α endógeno. Este efecto de cisplatino fue evidente después de 6 horas de incubación y fue acompañado por aumento de la apoptosis en todas las líneas celulares ensayadas (Fig. 4A). Luego investigó si la expresión ectópica de ΔNp63α contribuiría a la resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino en PDAC. células PANC-1 se incubaron durante 24 horas en medio completo suplementado con 5 mg /ml de cisplatino durante 2, 6, o 24 horas. células PANC-1ΔN mostraron una atenuación suave de la apoptosis en comparación con las células de control, tal como se manifiesta por una disminución de PARP y la escisión de la caspasa (Fig. 4B). Esta disminución en la apoptosis inducida por cisplatino en correlación con un aumento en la viabilidad de las células PANC-1ΔN como se determina en un ensayo MTT, mientras que las células PANC-1TA mostraron una supervivencia ligeramente reducida (Fig. 4C). Por el contrario, las células que expresan T3M4 p63α sh se sensibilizaron a la apoptosis inducida por cisplatino, tal como se demuestra por un aumento de la escisión de PARP y la caspasa (Fig. 4D). Por lo tanto, ΔNp63α atenúa la sensibilidad de las células de cáncer de páncreas a cisplatino.
Un
, Efecto de cisplatino en ΔNp63α en PDAC. Las células se incubaron con 10 mg /ml de cisplatino durante los primeros 6 o 24 horas completas. La apoptosis se evaluó mediante el control de la escisión de PARP.
B-D
, Efecto de ΔNp63α sobre la apoptosis inducida por cisplatino en PANC-1 (
B, C
) y las células T3M4 (
D
). Las células se incubaron con 5 mg /ml de cisplatino durante los períodos de tiempo indicados. Las células se sedimentaron después de 24 h de incubación, las proteínas aisladas y se ejecutan en gel SDS-PAGE. La apoptosis se evaluó mediante el control de PARP y la caspasa-3 de escisión. Se muestra una imagen representativa de al menos tres experimentos independientes. células PANC-1 se incubaron con 10 mg /ml de cisplatino durante los primeros 12 horas o 48 horas completas. ensayo de MTT se realizó como se describe en materiales y métodos. Los datos son la media ± SE de tres experimentos independientes.
ΔNp63α regula al alza 14-3-3σ en líneas celulares de cáncer de páncreas
A continuación se estudiaron los mecanismos de quimio-resistencia ΔNp63α mediada en PDAC . Hemos demostrado anteriormente que 14-3-3σ mejora notablemente la resistencia a la apoptosis inducida por cisplatino en líneas celulares de cáncer de páncreas [11]. Westfall et al. demostró que ΔNp63α actúa como un represor transcripcional del promotor 14-3-3σ en los queratinocitos epidérmicos humanos [25]. Por el contrario, se observó que la expresión de ΔNp63α correlacionada con la expresión de la proteína 14-3-3σ en las células de cáncer de páncreas (Fig. 1A). Además, silenciando ΔNp63α fue acompañado de una reducción en el nivel de proteína en las células 14-3-3σ T3M4 (Fig. 2A). 14-3-3σ es un objetivo transcripcional de p53, sin embargo BxPC3, se sabe que las células PANC-1 y T3M4 para llevar a p53 mutante cuya actividad transcripcional es defectuosa [26], mientras que COLO-357 células expresan bajos niveles de proteína p53 (Fig. 1A) . Por lo tanto, la expresión 14-3-3σ es poco probable que sea dependiente de p53 en PDAC.
Para determinar si ΔNp63α modula la expresión 14-3-3σ en las células de cáncer de páncreas, introdujimos ΔNp63α ADNc través de la infección por adenovirus en ASPC- 1 y PANC-1 en las células, que expresan bajos niveles de 14-3-3σ y ΔNp63α. Se observó un aumento en los niveles de proteína 14-3-3σ en las células que sobreexpresan ΔNp63α en comparación con las células de control infectadas (Fig. 5A). Este incremento mediada por ΔNp63α en 14-3-3σ no se asoció con alteraciones de los niveles de proteína de las otras isoformas 14-3-3 (Fig. 5A). Por el contrario, la manipulación de 14-3-3σ niveles en células T3M4 PANC-1 y no tenía un efecto sobre ΔNp63α (Fig. 5B y 5C).
A, células ASPC-1 y PANC-1 eran infectados con adenovirus que contenían el vector vacío o de larga duración ΔNp63α, y todo lisado de proteína celular se preparó 48 horas después de la infección y se sondearon con anticuerpos anti-ΔNp63α y 14-3-3σ y otras isoformas 14-3-3.
B Opiniones, sobreexpresión de 14-3-3σ no tuvo ningún efecto sobre los niveles de ΔNp63α. células PANC-1 fueron transfectadas con un vector vacío (Sham) o con el ADNc 14-3-3σ humano de longitud completa que fue etiquetada con HA.
C
, el silenciamiento 14-3-3σ no afecta ΔNp63α.