Extracto
Antecedentes
A pesar de la intensa investigación en detección temprana del cáncer, hay una falta de biomarcadores para el confiable la detección de tumores malignos, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). cambios de metilación del ADN son comunes y relativamente estable en varios tipos de cánceres, y se pueden utilizar como biomarcadores de diagnóstico o pronóstico.
Métodos
Se realizó la metilación del ADN de perfiles de muestras de 48 pacientes con estadio I NSCLC y 18 que coinciden con las muestras de pulmón libres de cáncer utilizando microarrays que cubren las regiones promotoras de más de 14.500 genes. Se correlacionaron los cambios de metilación de ADN con los niveles de expresión génica y se realizó un análisis de supervivencia.
Resultados
Hemos observado hipermetilación de 496 GPC en 379 genes y la hipometilación de 373 GPC en 335 genes en NSCLC. En comparación con muestras de adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas muestras tenían 263 GPC en 223 genes y 513 hypermethylated CpG en 436 genes hypomethylated. 378 de 869 (43,5%) sitios CpG que discriminan las muestras de NSCLC y de control mostraron una correlación inversa entre CpG metilación sitio y los niveles de expresión génica. Como resultado de un análisis de supervivencia, hemos encontrado 10 GPC en 10 genes, en la que el nivel de metilación es diferente en diferentes grupos de supervivencia.
Conclusiones
Hemos identificado un conjunto de genes con metilación alterada en el CPNM y encontró que una minoría de ellos mostró una correlación inversa con los niveles de expresión génica. También encontramos un conjunto de genes que asocian con la supervivencia de los pacientes. Estos candidatos marcadores recién identificados para la detección molecular de NSCLC necesitarán un análisis adicional con el fin de determinar su utilidad clínica
Visto:. Lokk K, Vooder T, R Kolde, Välk K, T Vosa, Roosipuu R, et al. (2012) metilación marcadores de la etapa inicial de células no pequeñas cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (6): e39813. doi: 10.1371 /journal.pone.0039813
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 6 de Noviembre de 2011; Aceptado: 28-may de 2012; Publicado: 29 Junio 2012
Derechos de Autor © 2012 Lokk et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyado por la Unión Europea a través del Fondo Europeo de Desarrollo regional, Centro de Excelencia en Genómica y proyectar 245536 OpenGene. El apoyo adicional se obtuvo a partir de Estonia Ministerio de Educación y Ciencia SF0180142s08 núcleo subvención, subvenciones de la Fundación de Ciencias de Estonia 7473, 9293 y la Universidad de Tartu Fondo de Desarrollo de Proyecto de Genómica. LM ha sido apoyado por la Unión Europea a través del Fondo Social Europeo, comunión MJD71. NT ha sido apoyada por la beca de la Fundación Alexander von Humboldt. KL, MK y NT han recibido becas de viaje de la Fundación Kristjan-Jaak. Página Web de proyecto OpenGene: www.geenivaramu.ee/opengene/. Página Web de la Fundación de Ciencias de Estonia: www.etf.ee. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en el mundo. eventos epigenéticos son temprano y frecuente en la carcinogénesis [1], [2], [3], lo que hace que la metilación del ADN de un biomarcador atractivo para el cáncer. eventos epigenéticos también podrían proporcionar un enlace tratable entre el genoma y el medio ambiente, con el epigenoma que sirve como un registro de eventos de la vida bioquímica relevantes, por ejemplo, el tabaquismo [4].
El cáncer de pulmón se divide morfológicamente a células no pequeñas y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC y SCLC). CPNM representa alrededor del 80% de los cánceres de pulmón y es una entidad clínica heterogénea con los principales subtipos histológicos, como el carcinoma de células escamosas (SCC), adenocarcinoma (AC) y el carcinoma de células grandes [5]. Una característica común de los diferentes subtipos de NSCLC es el algo más lento el crecimiento y la propagación en comparación con SCLC, lo que permite la erradicación quirúrgica en sus primeras etapas. Sólo una pequeña fracción de los casos son diagnosticados con NSCLC actualmente en estadios clínicos I a IIb, en que la extirpación quirúrgica es el tratamiento de elección.
El enfoque biomarcador impulsada en fases preinvasoras podría ayudar a diagnosticar o descartar el cáncer de pulmón. marcadores actuales, incluyendo el carcinoma de células escamosas de antígeno, antígeno carcinoembrionario, citoqueratina 19 antígeno fragmento de 21-1 y enolasa neuronal específica, se mostró falto de potencia de diagnóstico satisfactorio. En un estudio reciente, sólo el 37,3% de los cánceres de pulmón en etapa temprana podría ser diagnosticada utilizando los ensayos de combinación de los marcadores tumorales antes mencionados [6].
Nuestro estudio tiene como objetivo la identificación de todo el genoma de ADN biomarcadores candidatos a base de metilación en las primeras etapas del NSCLC. la metilación del ADN se produce ampliamente en el contexto de dinucleótidos de citosina-guanina (CpG) [7]. Ricas en CpG tramos cortos (islas CpG) son generalmente ubicados en la región promotora de los genes y, normalmente, se mantienen en el estado desmetilado [8]. En el cáncer, las islas CpG localizadas en la zona promotora de los genes supresores de tumores y genes "casa de mantenimiento" se convierten en hypermethylated, que puede conducir a una disminución de la expresión de estos genes. Al mismo tiempo, el genoma es desmetilado a nivel mundial, que a su vez puede conducir a la activación de oncogenes [9], [10]. La metilación de CpG costas de la isla - regiones con menor densidad de CpG dentro de aproximadamente 2 kb de islas CpG - También está estrechamente asociado con la inactivación transcripcional [11]
Recientemente, se ha hecho un progreso significativo en la metilación del ADN en todo el genoma. análisis. Los métodos incluyen la conversión de bisulfito del ADN, inmunoprecipitación o purificación por afinidad de ADN metilado seguido por el análisis de microarrays o secuenciación de alto rendimiento [12]. Se ha demostrado que en términos de precisión, los métodos basados en bisulfito realizan un poco mejor que los métodos basados en el enriquecimiento y no requieren una corrección estadística para CpG sesgo [13].
Hemos realizado un ADN de todo el genoma estudio de la metilación de la etapa I NSCLC para obtener una visión de las primeras etapas de las alteraciones epigenéticas en cáncer de pulmón e identificar potenciales biomarcadores de diagnóstico o pronóstico. En nuestro estudio hemos utilizado los BeadChips HumanMethylation27 (Illumina, Inc) que permiten comparaciones cuantitativas rentables a través de muchas muestras.
Resultados
El análisis de metilación de CpG
En general, nos detectan 496 GPC en 379 genes y 373 hypermethylated GPC en 336 genes hypomethylated en CPNM (Figura S1, el cuadro S1). Un mapa de calor de los 100 genes metilados más diferente en comparación con CPNM muestras de control se muestra en la Figura 1.
niveles de metilación del ADN se muestran para los 100 sitios CpG con los valores más altos Beta Delta (FDR corregida) de ADN metilación entre el tejido de cáncer y tejido pulmonar normal. Los valores beta-metilación se representan como la fila Z-score. Un mapa de calor se ha generado mediante análisis de agrupamiento jerárquico no supervisado 2D. El color rojo indica alta metilación y azul indica baja metilación respecto a la fila significa.
En comparación con las muestras de CA, las muestras tenían SCC 263 GPC en 223 genes y 513 hypermethylated CpG en 436 genes hypomethylated (figura S2, Mesa S2).
Dos muestras de ADN (ID 33 y 107) fueron procesadas por duplicado como un control interno de la reproducibilidad de la prueba. coeficiente de correlación de Pearson para ambos duplicados fue 0,998. los niveles de metilación determinados por el ensayo Infinium se validaron utilizando secuenciación de Sanger de ADN con bisulfito convertido durante 11 CpG (seis GPC de NSCLC en comparación con el análisis de muestras de control y cinco GPC de análisis de supervivencia). La correlación media entre los dos métodos fue del 83% (rango de 48,9%; 97,4%). (Figura S3)
Los sitios CpG analizadas mediante ensayo HumanMethylation27 se encuentran a menos de 1,5 kb aguas arriba a 1 kb aguas abajo de la SAT de su genes respectivos. Se encontró una diferencia significativa en la ubicación de hypermethylated vs. hypomethylated CpG relación con el SAT más cercano (p = 0,0001, Welch muestra de dos t-test). CpG hypermethylated se localizan preferentemente en los DST, 3 'abajo de la SAT o en las islas CpG. Por el contrario, hypomethylated CpG se encuentran con frecuencia en 5 'aguas arriba de la respectiva DST o en costas de la isla CpG [11] (Tabla 1, Figura 2).
' medido CpG distancia del sitio de inicio de transcripción (TSS) . a) distancia de TSS, de todas las GPC de la matriz de metilación. b) Distancia de TSS de las GPC hypermethylated (línea de puntos) y la distancia de TSS de las GPC hypomethylated (línea continua). En el eje x, la distancia de TSS se mide en pb-s, y en el eje y N representa el número de GPC.
Diferentes CpG de
,
PABPC5
y
TP73
eran o hiper o hypomethylated en el CPNM. En el
TP73
gen, el sitio CpG hypermethylated en la muestra tumoral se encuentra aguas arriba de la SAT de la isoforma ARNm de longitud completa. Hypomethylated
TP73
CpG se encuentran cerca de la DST de las isoformas más cortas. Hypermethylated CpG de la
HSPA12B
y
PABPC5
se ubicaron en sus 5 'islas CpG, mientras que los CpG hypomethylated estaban ubicados aguas arriba, fuera de las islas CpG.
microarrays de expresión génica de validación por QRT-PCR
configuración de arrays de expresión génica y los resultados se presentan en el reciente documento [14]. 10 genes y ocho pares de muestras se utilizaron para validar los resultados de microarrays, utilizando la tecnología de QRT-PCR. Todos los genes mostraron la misma dirección de sobre o subexpresión en las muestras de cáncer de pulmón, usando ambas tecnologías (Figura 3). Siete genes mostraron una correlación significativa entre la expresión de tapa cambios determinados por QRT-PCR y microarrays (p & lt; 0,05, R & gt; 0,7). (Figura S4)
En el eje Y se muestra log2fold- promedio cambiar determinada por Illumina matriz y qRT-PCR (8 pares de muestras). Las barras de error indican el error estándar de la media (SEM).
La metilación relacionados con cambios de expresión génica
Mediante un análisis de correlación de Pearson, hemos sido capaces de determinar la correlación inversa esperada entre el diferencial los niveles de metilación y los valores de expresión génica de 378 (43,5%) de los 869 CpG metilados diferencialmente entre NSCLC y muestras de control. En diferentes grupos histológicos hemos sido capaces de encontrar 337 de 780 CpG (43,2%), los niveles de metilación de los cuales se correlacionaron inversamente con los niveles de expresión génica.
Se realizó un análisis de qPCR de los diferentes
TP73
isoformas para poner a prueba si la metilación diferencial al lado de la DST de diferentes isoformas afecta su nivel de expresión. El análisis qPCR no reveló una diferencia estadísticamente significativa (p-valor de 0,36, prueba t pareada) entre los niveles de expresión de las dos isoformas en las muestras tumorales.
Ingenuity Pathway Analysis
realizado
in silico
análisis e interacción funcional de los genes diferencialmente metilado usando el software Ingenuity Pathway Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA), y encontraron 78 genes de la red elegibles y 451 funciones /Rutas genes elegibles. Mediante la inclusión de las interacciones directas e indirectas conocidas, la red de genes lo más prominente representado estaba relacionada con el factor de necrosis tumoral (TNF, la Figura S5). La mayor parte de los genes (n = 22) en la red fueron hypomethylated, pero algunos genes (n = 7) también fueron hypermethylated.
metilación del ADN relacionada con la conducta de fumar
Sobre la base de paquete de tabaco -años de datos, nos preguntamos si el tabaquismo afecta los patrones de metilación del ADN en un tumor. Se excluyó un paciente que carecía de datos fumadores. El análisis de regresión lineal se realizó utilizando el paquete Bioconductor Limma. Análisis dentro de las muestras tumorales no mostró genes diferencialmente metiladas relacionados con la medida del consumo de tabaco. Comparando el número limitado de los no fumadores (n = 3, 6,4%) con los fumadores (n = 44, 93,6%) se encontraron cuatro CpG sitios diferencialmente metilado en tres genes (p & lt; 0,05, FDR ajustados), que son todos hypomethylated en el grupo de los fumadores:.
CXorf38
,
MTHFD2
y
TLL2
alterada metilación y la supervivencia a largo plazo
Se realizaron dos tipos de análisis de supervivencia para encontrar posibles marcadores de metilación de pronóstico. Los pacientes sólo con un máximo de un mes de supervivencia después de la cirugía (n = 2) fueron excluidos para evitar cualquier posible confusión influencia de complicaciones postoperatorias.
En primer lugar, se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier en cada uno de los sitios CpG dividiendo los valores beta que en los grupos de bajos, medios y altos de metilación. Nosotros sólo le ofrecemos resultados donde todos los grupos eran más grandes que cinco pacientes. Como resultado, encontramos 10 CpG en 10 genes, con diferencias de nivel de metilación en diferentes grupos de supervivencia (Figura 4). Los pacientes con un nivel de metilación medio de
UGT1A7, GPR171, P2RY12, FLJ35784
y
C20orf185
tuvo mejor supervivencia que los pacientes con metilación de alto nivel. Los pacientes con un nivel de metilación medio de
CLEC11A
y
GRIK3
tenían una mejor supervivencia en comparación con la metilación de bajo nivel. Los pacientes con un nivel bajo de metilación
CYP1A1
y
INGX
tenido una mejor supervivencia que aquellos con la metilación de nivel medio. Los pacientes con un alto nivel de metilación de
PIK3R5
tuvo mejor supervivencia que aquellos con la metilación de nivel medio.
Se realizó una prueba de supervivencia en cada uno de los sitios CpG. Los valores de metilación se dividen en 3 grupos: bajo (0-0,25), medio (0,25-0,75) y alta (0,75-1). Como resultado, hemos encontrado 10 sitios CpG cuyo nivel de metilación difiere en diferentes grupos de supervivencia. El eje x muestra la supervivencia en años, y el eje y muestra la supervivencia global.
En segundo lugar, se realizó el análisis de metilación diferencial mediante la combinación de análisis de riesgos proporcionales de Cox y Wilcoxon la suma de rangos. Encontramos 18 CpG en 15 genes en pacientes con 1 a 24 meses de supervivencia (n = 12) frente a los pacientes con 60 meses y una supervivencia más larga (n = 15), p & lt; 0,05, y la diferencia de metilación de corte aplicada. A partir de los genes diferencialmente metilado,
DXS9879E gratis (
LAGE3
),
RTEL1
y
MTM1
fueron hypermethylated, y
SCUBE3
,
SYT2
,
KCNC3
,
KCNC4
,
GRIK3
,
CRB1
,
Socs2
,
ACTA1
,
ZNF660
,
MDFI
,
ALDH1A3
y
SRD5A2
fueron hypomethylated en el grupo con peor supervivencia (Figura S6).
Discusión
Hemos realizado un estudio de la metilación del ADN en todo el genoma en 48 pacientes con CPNM en estadio I y 18 macroscópicamente muestras de control sin cáncer mediante el uso de análisis de conglomerados para buscar genes que distinguen entre el cancerosos y el tejido pulmonar normal y se comparó los niveles de metilación de estos genes con sus niveles de expresión. Además, se realizó un
in silico
análisis funcional y la interacción de los genes metilados de forma diferente utilizando el software IPA. Se utilizó regresión lineal para encontrar genes relacionados con el tabaquismo, y se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para identificar la metilación diferencial de los genes relacionados con la supervivencia de los pacientes
.
Como resultado, se detectaron 496 GPC en 379 genes y hypermethylated 373 GPC en 336 genes que fueron hypomethylated en el CPNM. no se obtuvo una separación perfecta de los de control de muestras de tejido de pulmón a partir de muestras de NSCLC, como una muestra de pulmón normal agrupado junto con las muestras de cáncer y seis muestras de cáncer (una en duplicado) mostraron patrones de metilación algo parecido al tejido de pulmón libres de tumor. Ya que utilizamos muestras tumorales no disecados, este hallazgo puede ser al menos parcialmente causada por el efecto de confusión de tejido no neoplásico presente en estas muestras. El examen patológico de las muestras de NSCLC con perfiles de metilación del ADN similares a las muestras de pulmón normales reveló ya sea bajo contenido de tumor (10 a 30%) o una composición muy heterogénea de células tumorales en las muestras. Por tanto, estas muestras de cáncer de co-agrupación y muestras de pulmón sin cáncer fueron excluidos de los nuevos análisis.
Nuestro primer objetivo fue identificar los genes que participan en los eventos tempranos en la metilación específica del tumor. Como resultado, nuestra proyección descubrió algunos marcadores de metilación conocidos, algunos de los cuales tienen actividad supresora de tumores:
CDKN2A
,
MGMT
,
GATA4
,
HOXA7
,
Hoxa9
,
RUNX3
,
SFRP1
. La mayoría de los genes identificados son nuevos marcadores de metilación para NSCLC, aunque algunos de ellos han sido descritos como metilado en otros tipos de cáncer.
LGALS12
es un supresor tumoral candidato que es capaz de detener el ciclo celular e inhibir la proliferación de varias líneas celulares de cáncer [15]. En el cáncer de mama,
LGALS12
se ha encontrado regulado por disminución en el tejido maligno [16].
El segundo objetivo de nuestro estudio fue correlacionar los cambios en el nivel de metilación con los datos de expresión génica. Utilizando el análisis de Pearson, hemos sido capaces de encontrar la correlación inversa esperada entre los niveles de metilación y los valores de expresión de genes para 378 de 869 sitios CpG (43,5%). Se encontró que los valores más altos de correlación inversa entre los CpG hypermethylated y los valores de expresión para el
AGER gratis (-0.78),
EPOR gratis (-0,65) y
AQP1 gratis (-0.63) genes. La distancia media de los SAT de genes correlacionados inversamente era -65 pb (rango -1498; 917 pb) en comparación con -158 pb (rango -1474; 818 pb) de las GPC se correlacionaron positivamente (p-valor de 0,02, estudiantes t-test). La gama de CpG está probablemente afectada por el hecho de que microarray Infinium HumanMethylation27 de Illumina cubre CpG que se encuentran predominantemente en el entorno de las regiones promotoras y no en el cuerpo gen o 3'UTR. Acuaporina 1 (
AQP1
) ha informado de que se hypermethylated y downregulated en NSCLC [17].
AGER
, que codifica un receptor de la superfamilia de las inmunoglobulinas, se ha informado de que se downregulated en NSCLC [18]. Se encontró que los valores de correlación inversa más altos para los sitios CpG hypomethylated y los valores de expresión de
MB gratis (-0.63),
ADA gratis (-0,60) y
MAGEA6 gratis (-0,60) genes. La mioglobina (
MB
) se asocia con la progresión tumoral y ayuda a superar la hipoxia en las células del cáncer [19]. Hipermetilación y /o la regulación a la baja de algunos de los genes identificados en nuestro estudio (por ejemplo,
ALDH1A2
,
HOXA5
,
MT1E
,
SOX17
) tienen ha informado en otros tipos de cáncer [20], [21], [22], [23], pero todavía no en el cáncer de pulmón. Es la hipótesis de que
RASSF1
actúa como un supresor de tumores en la progresión del cáncer de pulmón [24]. Entre los genes regulados positivamente y hypomethylated, el gen más frecuentemente reportado fue
SERPINB5 gratis (Maspin). La sobreexpresión de
SERPINB5
se ha asociado con la progresión del cáncer y un mal pronóstico en el cáncer de pulmón [25].
Podemos suponer que los genes con una correlación inversa tienen una probabilidad más alta de ser regulada por metilación . Sin embargo, muchos genes probablemente se convertirá en metilada aleatoriamente durante la carcinogénesis, y esto no significa necesariamente tener un efecto sobre el estado de equilibrio los niveles de expresión génica.
En el caso de los diferentes grupos de histología, hemos sido capaces de encontrar una correlación inversa entre la diferencialmente metilado sitios CpG y los valores de expresión de genes para 337 de 780 sitios CpG (43,2%). Los valores más altos fueron correlación inversa para
ACOX2 gratis (-0.75),
CULO gratis (-0,70) y
SLC39A4 gratis (-0.68), que no se han asociado con NSCLC subtipos histológicos antes. De los genes inversamente correlacionados, se ha informado de que
pIgR
,
MUC1
y
FOLR1 ¿Cuáles son downregulated en SCC en comparación con AC [26], [27], [ ,,,0],28], que es coherente con nuestros resultados.
Análisis utilizando software IPA reveló que las funciones dominantes de los genes diferencialmente metiladas eran de señalización de célula a célula y la interacción, la replicación y reparación del ADN, el crecimiento celular y la proliferación, muerte de las células, el cáncer, la respuesta inflamatoria, etc. una serie de funciones de los genes, tales como el crecimiento celular, la proliferación y la muerte celular, son directamente involucrados en la progresión del cáncer, pero el sistema inmunitario también juega un papel importante en la lucha contra las células cancerosas. También es bien sabido que las deficiencias en las vías de reparación del ADN y el control de daños son responsables de la mayoría o incluso todos los cánceres humanos. Después de incluir las relaciones indirectas conocidas, la red de genes reveló más prominente estaba relacionado con
TNF gratis (Figura S5).
TNF
tiene un doble papel en la biología del tumor. Es una citocina con propiedades contra el cáncer bien conocidos, pero también puede promover el desarrollo y progresión del cáncer [29]. hypomethylated genes en el
TNF
red eran citoquinas (
CCL3, CCl4, CCL7, CCL8, CCL22, IL21, IL17A, EBI3
) que puede estimular o inhibir el crecimiento tumoral y la progresión. El
TNF
red también incluye el conocido gen antiapoptótico potente
BCL2
, que también fue hypomethylated sobre todo en nuestras muestras de NSCLC.
ALDH1A3 gratis (aldehído deshidrogenasa 1 familia, miembro de A3) indirectamente regulada por
TNF
juega un papel en la desintoxicación de aldehídos generados por el metabolismo del alcohol y la peroxidación lipídica. La hipometilación de este gen se ha relacionado con un peor pronóstico en nuestro estudio de cohortes (Figura S6).
Hemos encontrado que
TP73
tenía tres CpG metilados diferencialmente, dos de los cuales fueron hypomethylated en los tejidos tumorales y situado cerca de la SAT de sus isoformas más cortas. El CpG hypermethylated se encuentra aguas arriba de la SAT de la isoforma ARNm de longitud completa. Se midió la expresión de diferentes isoformas mediante el análisis de qPCR, pero no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p-valor de 0,36, emparejado t-test) en las muestras tumorales, aunque la isoforma larga se expresa a un nivel ligeramente inferior a la isoforma corta . Se realizó un análisis de Kaplan-Meier de supervivencia para los sitios CpG, para los que hemos dividido sus valores de metilación en 3 grupos: bajo (0-0,25), media (0,25-0,75) y alta (0,75-1). Como resultado, encontramos 10 CpG en 10 genes cuyo nivel de metilación difiere en los diferentes grupos de supervivencia (Figura 4).
UGT1A7
es una enzima implicada en el metabolismo de los (pre) carcinógenos presentes en el humo del tabaco. Precarcinogens y sus metabolitos se consideran para jugar un papel importante en la carcinogénesis de los cánceres relacionados con el humo del tabaco [30]. Se ha demostrado que los polimorfismos en el gen UGT1A7 están asociados con cáncer de pulmón, lo que sugiere que estos polimorfismos reducen la actividad enzimática [31]. Un alto nivel de metilación podría también afectar a
actividad UGT1A7
y causar un mal pronóstico para los pacientes con CPNM.
CYP1A1 gratis (que pertenece a la superfamilia del citocromo P450) cataliza muchas reacciones implicadas en el metabolismo de fármacos, también la conversión de hidrocarburos aromáticos policíclicos en metabolitos reactivos y desintoxicaciones de carcinógenos ambientales. Se ha demostrado que
CYP1A1
se hypermethylated en muestras de cáncer de pulmón en comparación con las muestras de pulmón normal, y esto se asoció con una reducción de los niveles de ARNm [32]. En nuestro estudio, los niveles de metilación se asociaron con una pobre supervivencia de pacientes con cáncer de pulmón que apoya la hipótesis de que
CYP1A1
puede tener papel protector en la progresión del cáncer. Otros genes que se encuentran en el análisis de supervivencia no han sido reportero de estar involucrados en la supervivencia de cáncer de pulmón de pacientes
.
El uso de un tipo diferente de análisis de supervivencia, donde el análisis de metilación diferencial se realizó mediante la combinación de análisis de riesgos proporcionales de Cox y la de Wilcoxon la suma de rangos, hemos sido capaces de analizar 12 pacientes con una supervivencia de menos de 24 meses y 15 pacientes que sobrevivieron 60 meses o más después de la cirugía. Este análisis de los diferentes grupos de supervivencia reveló 15 genes diferencialmente metilado.
RTEL1
, el regulador de alargamiento de los telómeros helicasa 1, parece ser el más interesante funcionalmente uno de estos. Esta es una ADN helicasa dependiente de ATP requerido para suprimir inapropiado recombinación homóloga, por lo tanto juega un papel central en la reparación del ADN y en el mantenimiento de la estabilidad genómica.
fue encontrado RTEL1
ser hypermethylated en nuestro grupo pobre supervivencia.
La comparación de los no fumadores (n = 3, 6,4%) con los fumadores (n = 44, 93,6%), cuatro diferencialmente metilado se encontraron CpG sitios relacionados con tres genes, hypermethylated en el grupo de los no fumadores:
CXorf38, MTHFD2
y
TLL2
. Missing diferencia estadísticamente significativa en los niveles de metilación entre los diferentes niveles de consumo de tabaco podría indicar una escasa fiabilidad de los datos de los paquetes-año 'obtenidos.
MTHFD2
se ha demostrado que tienen una mayor expresión en los fumadores, lo que favorece el crecimiento rápido de las células. [33].
TLL2
es una metaloproteasa dependiente de zinc. Se requiere la expresión de metaloproteinasas de la transformación celular, y esto se correlaciona con la progresión tumoral [34].
Mediante la comparación de los cambios en todo el genoma de la metilación del ADN de las células normales y cancerosas de pulmón, hemos sido capaces de obtener una perspectiva de la complejidad del programa metilación requerido para que las células se convierten completamente maligno. Como resultado, encontramos un panel de genes que distinguen células de NSCLC de células pulmonares normales adyacentes y también carcinoma de células escamosas de adenocarcinoma. El análisis reveló un conjunto de sitios CpG metilados diferencialmente que parecen regular la expresión génica y otro conjunto que había afectado a la supervivencia de los pacientes. Estos marcadores de metilación recién identificados son candidatos para la detección molecular adicional de NSCLC. Con el fin de confirmar estos marcadores de NSCLC carcinogénesis, se necesitan estudios y validaciones adicionales. A partir de los resultados de nuestro trabajo y de los resultados anteriores, podemos suponer que las alteraciones en la metilación del ADN es un evento temprano en el CPNM.
Materiales y Métodos
Ética Declaración
La Ética Comité de Estudios Humanos de la Universidad de Tartu, ha aprobado el estudio y un consentimiento por escrito fue obtenido de los sujetos de estudio.
muestras
se analizaron Unión Internacional para el control del cáncer (UICC) CPCNP en estadio I muestras [35] de 48 pacientes y muestras de control macroscópicamente libre de cáncer "normales" pulmón de 18 pacientes. Todas las muestras habían sido aislados durante la cirugía de pulmón en el Hospital de la Universidad de Tartu, Estonia. Los pacientes con adenocarcinoma (n = 6, 12,5%) y su subtipo carcinoma bronquioloalveolar (n = 10, 20,8%) se analizaron como un grupo (n = 16, 33,3%). El 32 (66,7%) restante de los pacientes analizados tenía carcinoma de células escamosas. El rango de edad en el grupo de estudio fue de 41-80 años (media de edad en los hombres n = 40, 66,2 años y en las mujeres n = 8, 65,5 años) (Tabla S3). Los pacientes no sufren ninguna quimioterapia preoperatoria o radioterapia.
En la cirugía, las muestras de tejido de tamaño apropiado (1-2 cm
3) fueron cortadas de tejido pulmonar tumoral y morfológicamente libres de tumor. Una mitad de cada muestra se fijó en formalina y se utiliza para el examen patológico. La otra mitad de cada muestra fue congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 ° C hasta su uso. Se obtuvieron muestras de control en un lugar distante del tumor extirpado y se confirmó que libres de tumor por el mismo patólogo.
Extracción de ADN y bisulfito Modificación
Se extrajo el ADN de 50 mg de tumor y búsqueda de tejido pulmonar libre de tumor con el Dneasy® Blood & amp; kit Tissue (Qiagen GmbH., Hilden, Alemania) y con el kit de tejido NucleoSpin® (Macherey-Nagel GmbH., Düren, Alemania). rendimiento de ADN y la pureza se determinaron utilizando el espectrofotómetro NanoDrop® ND1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA). De cada muestra, 500 ng de ADN genómico fue modificada utilizando el kit DNA EZ metilación ™ (Zymo Research, Orange, CA) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante bisulfito.
metilación Validación por Sanger Secuenciación
para la validación del chip de metilación se eligieron 11 genes, cinco de ellas eran genes de análisis de supervivencia y los seis restantes eran genes que distinguían entre el cáncer y el tejido normal (cebadores utilizados en el estudio mostraron en la Tabla S4). Los cebadores para PCR de ADN tratado con bisulfito fueron diseñados utilizando MethPrimer [36]. Una PCR 20 l se llevó a cabo en 80 mM Tris-HCl (pH 9,4-9,5), 20 mM (NH4) 2SO4, tampón de PCR Tween-20 al 0,02%, MgCl2 3 mM, 1X de betaína, 0,25 mM mezcla de dNTP, 2 unidades de Taq Hot-iniciar polimerasa, 50 pmol del cebador directo, 50 pmol del cebador inverso, y 20 ng de ADN genómico tratado con bisulfito. condiciones de los ciclos de PCR fueron 95 ° C 15 min para la activación de la enzima, 95 ° C 30 seg, 62 ° C 45 seg, 72 ° C 120 s durante 17 ciclos, Touchdown por -0.5 ° C para cada ciclo y 95 ° C 30 seg, 52 ° C 30 seg, 72 ° C 120 s durante 21 ciclos. La secuenciación se realizó como un servicio por el Fondo para el núcleo del estonio Biocenter. Se analizaron las huellas de secuenciación con el software Mutación Surveyor (SoftGenetics, State College, PA, EE.UU.) y el software de cálculo estadístico R (http://www.r-project.org/).
La extracción de RNA y Análisis de Expresión Génica
la descripción detallada del proceso de extracción de RNA y análisis de la expresión génica se da en el artículo reciente [14].
se han usado 10 genes y ocho pares de muestras (muestras tumorales y normales adyacentes) para validar los datos de microarrays. Para RT-PCR cuantitativa (qPCR), los ADNc se sintetizaron a partir de 700 ng de RNA total usando el kit de primera hebra de ADNc Synthesis (Fermentas, Vilnius, Lituania) y oligo dT de acuerdo con el protocolo del fabricante. reacciones por triplicado qPCR se realizaron en placas de 384 pocillos usando mezcla SYBR Green ROX (ABGene, Epsom, Reino Unido o Fermentas, Vilnius, Lituania) y el Sistema de detección de secuencias ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA). Los datos fueron analizados utilizando el SDS 2.2.2 (Applied Biosystems) y el software de cálculo estadístico R (http://www.r-project.org/).
La media geométrica de la expresión de dos genes de referencia (
EDS
y
S18RNA
) se utilizó como referencia. Expresión veces el cambio entre la muestra normal y el tumor se calcularon utilizando el método 2
-ΔΔCt. correlación de Pearson análisis se utilizaron para evaluar la conformidad entre los cambios veces identificados por QRT-PCR y la serie de experimentos.
Además, QRT-PCR se utilizó para determinar el
TP73
nivel de expresión. Los cebadores utilizados para la
TP73
qPCR amplificaciones se enumeran en la Tabla S5.
Análisis de metilación del ADN
El análisis de metilación se realizó utilizando Infinium® HumanMethylation27 REVB BeadChips (Illumina Inc.). El ensayo cubre 27.578 GPC en 14.495 genes localizados predominantemente en las islas CpG en regiones promotoras proximales, entre 1,5 kb aguas arriba y aguas abajo 1 kb de los sitios de inicio de transcripción (TSS). Una isla CpG en este ensayo se define como una secuencia de nucleótidos de (1) 200 pb o más de longitud, (2) 50% o mayor en GC-por ciento, y (3) 0,60 o mayor en la proporción de los sitios CpG observado durante sitios esperados CpG en la región [10]. El HumanMethylation27 BeadChips también cubre los sitios CpG en las regiones reguladoras de 1.000 genes del cáncer conocidos, 150 genes diferencialmente metilado en varios tipos de cáncer y 110 genes miARN.