Extracto
Antecedentes
Una serie de estudios han explorado la asociación entre metilo enetetrahydrofolate reductasa (MTHFR) C677T polimorfismo y la susceptibilidad a cáncer de cuello uterino y de la neoplasia intraepitelial cervical (NIC). Sin embargo, los resultados siguieron siendo controvertido. Para llenar este vacío, decidimos llevar a cabo un meta-análisis de todos los estudios publicados disponibles.
Métodos
búsquedas bibliográficas electrónicas del PubMed, EMBASE y bases de datos Medline se llevaron a cabo hasta el 30 de abril 2012.-los efectos fijos o de efectos aleatorios modelo fue utilizado para calcular los OR agrupados para diferentes modelos genéticos.
resultados
Un total de 12 estudios de casos y controles fueron finalmente identificados. No se encontró correlación estadística entre las variantes C677T y el cáncer de cuello uterino en la población global. Sin embargo, los análisis de subgrupos en las mujeres blancas apuntan a un efecto protector significativo para los individuos homocigotos o heterocigotos para el alelo T (para CT vs CC: OR = 0,72, IC del 95%: 0,59 a 0,88; TT vs CC: O = 0,69, IC del 95% = 0,49-0,97; para CT + TT vs CC: OR = 0,71, IC del 95%: 0,59 a 0,86). variantes C677T se asociaron con CIN ni tampoco combinado estratificada entre la población en general.
Conclusiones
Este meta-análisis sugiere que las mujeres blancas con genotipos C677T mutantes podrían tener un menor riesgo de cáncer de cuello uterino, sin embargo, que carecen de suficiente solidez estadística. Se necesitan más investigaciones para obtener más información sobre el papel de este polimorfismo en la carcinogénesis cervical
Visto:. Luo YL, YE P, Zhang QH, Hu TT, Luo MH, Li MQ, et al. (2012) metilentetrahidrofolato reductasa C677T polimorfismo y la susceptibilidad al cáncer de cuello uterino y de la neoplasia intraepitelial cervical: Un meta-análisis. PLoS ONE 7 (9): e46272. doi: 10.1371 /journal.pone.0046272
Editor: Xiao-Ping Miao, MOE clave Laboratorio de Medio Ambiente y Salud, Escuela de Salud Pública, Tongji Medical College, Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, China
Recibido: 17 de mayo de 2012; Aceptado: 28 Agosto 2012; Publicado: 28 Septiembre 2012
Copyright: © Luo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer cervical es el segundo lugar al cáncer de mama como el. la mayoría de los cánceres comunes en la incidencia y la mortalidad entre las mujeres en todo el mundo, lo que representa más de 471.000 nuevos casos y 250.000 muertes en el mundo cada año [1], [2]. La neoplasia intraepitelial cervical (CIN) se estima que tiene al menos 600.000 nuevos casos por año [3], que hacen (pre) enfermedad cervical neoplásica una importante amenaza para la salud pública y la carga pesada para la sociedad, sobre todo en algunos países con alta prevalencia, como la India [4], Corea [5] y América [6].
observaciones epidemiológicos han implicado que la infección con ciertos tipos oncogénicos del virus del papiloma humano (VPH) es una de las principales causas de la neoplasia cervical [7]. Sin embargo, todavía hay enormes variaciones entre individuos contribuyen al proceso neoplásico de cuello uterino en las mujeres infectadas con VPH, lo que indica que la infección por VPH por sí sola no puede ser la única culpable.
Además de la infección por VPH, una variedad de factores socioeconómicos factores que tradicionalmente no se asocian con enfermedades de transmisión sexual han sido identificados, tales como el hábito de fumar [8] y las deficiencias de micronutrientes como la vitamina C [9] y ácido fólico [10]. Entre los cuales los roles de folato en la carcinogénesis humana y en los tratamientos de cáncer se han discutido ampliamente. Los impactos de la concentración de folato de células rojas en la neoplasia cervical hace mucho tiempo también se han investigado y una hipótesis de que las mujeres con niveles de folato de células rojas menor eran más posible a asociarse con tipos de alto riesgo de infección por VPH o la carcinogénesis cervical, se han establecido con carácter general a través de caso -control [11] -. [13] o de la sección transversal [14] diseños, estimulando de este modo mucho interés científico en la posible influencia de los polimorfismos en las coenzimas de folato en las lesiones cervicales
el C677T (rs1801133) es el más mutación sin sentido común localizada en el gen que codifica la reductasa de la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Hasta la fecha, un número de estudios han explorado la asociación entre el polimorfismo C677T y la susceptibilidad de cáncer de cuello uterino y CIN [15] - [26]. resultados controvertidos, sin embargo, existían entre las mujeres afectadas. A lo mejor de nuestro conocimiento, no hay conclusiones confirmados se han elaborado en relación con este tema asociación genética. Para llenar este vacío, decidimos llevar a cabo un meta-análisis de todos los estudios publicados disponibles.
Métodos
Estudios de Identificación
Los artículos elegibles hasta el 30 de abril de 2012 se identificaron mediante la búsqueda en las bases de datos bibliográficas electrónicas (PubMed, Embase y Medline). Las palabras clave y estrategias de búsqueda se utilizan de la siguiente manera: ( "lesión intraepitelial escamosa" O "neoplasia intraepitelial cervical" O "cáncer de cuello uterino") y ( "metilentetrahidrofolato reductasa" O MTHFR). También se examinaron las listas de referencias de las revisiones o artículos originales sobre este tema para garantizar que los artículos pertinentes, pero previamente omitidas adicionales fueron incluidos en los procesos seleccionados. Si los datos superpuestos se presentaron en varias publicaciones, sólo se incluyó el estudio más reciente, más grande o completa. No hay restricciones de idiomas publicados se establecieron en este meta-análisis
Criterios de inclusión
Los estudios se incluyeron cumplir con los siguientes requisitos:. (1) Los estudios de casos y controles originales; (2) la exploración del polimorfismo C677T MTHFR y la susceptibilidad al cáncer cervical o CIN; (3) se registraron todas las distribuciones genotípicas en ambos grupos de casos y controles; (4) las distribuciones alélicas en el grupo de control se ajustaban al equilibrio de Hardy-Weinberg (HWE) [27]
Extracción de los datos
Para cada estudio, los datos fueron extraídos por dos autores independientes:. Primera el nombre del autor, año de publicación, país, grupo étnico, tipo de sujetos de control, estadio de las lesiones neoplásicas cervicales, tamaño de la muestra de casos y controles y las distribuciones de cada genotipo. Una vez que la extracción de datos fue completa, se exigió a los conflictos no solucionados de resolver. Si no se pudo llegar a un consenso, un tercer autor fue consultado y la decisión final fue tomada por la mayoría de los votos. Diferentes razas /etnias se clasificaron siguiendo la Oficina de Estándares de Gestión y Presupuesto (OMB) para recoger datos sobre la raza y la etnicidad (1997 revisión) [28].
Métodos estadísticos
El de bondad de ajuste
χ
2
prueba se utilizó para evaluar la desviación de HWE en los controles, la significación estadística se definió como
P Hotel & lt; 0,05. Las estimaciones individuales y de resumen se obtuvieron mediante el cálculo de los coeficientes de crudo ratio (OR), así como su intervalo de confianza del 95% (IC) y la correspondiente
valor de p gratis (
siendo P
valor significativo si & lt; 0,05). Los OR agrupados se estima que para el modelo de co-dominante (CT vs CC; TT vs CC)., Modelo dominante (CT + TT vs CC) y el modelo recesivo (TT vs CC + CT)
la heterogeneidad entre los estudios se evaluó mediante el cálculo de la
Q
estadística con
r
-1 (
r
es el número de estudios analizados) grados de libertad (
df
) [29]. Se utilizó el modelo de efectos fijos (método de Mantel-Haenszel) [30] para calcular las RUP combinados con
P Hotel & gt; 0,10 para
Q
estadística. De lo contrario, se utilizó el modelo de efectos aleatorios (método de DerSimonian-Laird) [31].
Por otra parte, la trama de la Begg embudo [32] y la prueba de regresión lineal de Egger [33] se utilizaron para evaluar el posible sesgo de publicación . Se realizaron análisis de sensibilidad para ver si alguna exclusión de los estudios podría afectar los resultados iniciales. Los datos fueron importados en STATA 10.0 (Stata Corp, College Station, Texas) para llevar a cabo todos los análisis estadísticos.
Resultados
Selección de los estudios incluidos
Este meta-análisis es guiada por la declaración PRISMA (Protocolo S1). Una serie de 57 estudios fueron cedidas de forma preliminar en base a los términos de búsqueda. Abierto abstracta filtrada y textos completos de tasación de estos artículos, un total de 12 artículos cumplieron los criterios de inclusión para el análisis detallado (Figura 1, Lista de verificación S1). La lista completa de los 57 documentos está disponible de los autores, bajo petición.
Descripción de las características de los estudios
Los artículos incluidos se presentan en Inglés excepción de una en español [21 ]. La mayoría de las 12 investigaciones se llevaron a cabo en Europa [17], [20], [24] y de Asia [18], [19], [22], [23], [25] poblaciones. Los controles se derivan de los participantes en los hospitales a excepción de Zoodsma et al. [20] y Mostowska et al. [24], donde los sujetos fueron reclutados, respectivamente, de un programa organizado de cuello uterino basado en la población de cribado y no relacionados voluntarias sanas que eran de la misma zona de los casos. La fuente de ADN para la determinación del genotipo era principalmente de muestra de sangre a excepción de tres estudios [15], [17], [23], donde se utilizó tejido cervical. Las características seleccionadas de todos los estudios incluidos se describen en la Tabla 1.
En cuanto a cáncer de cuello uterino, 10 estudios fueron elegibles con un tamaño total de la muestra de 1749 casos y 2451 controles. Con respecto a CIN, se combinaron 7 estudios para el análisis (1223 casos y 2005 controles), todos los cuales informó que CIN se confirmó histológicamente. Las distribuciones de genotipo C677T en pacientes con cáncer cervical o CIN y los controles se resumen en la Tabla 2, Tabla 3, respectivamente.
Síntesis cuantitativa
Para todos los estudios incluidos, la distribuciones alélicas de C677T en el grupo control fueron consistentes con HWE en el nivel de 0.05 (Tabla 2-3), lo que sugiere que se habían evitado efectos evidentes de la selección natural y la migración en el equilibrio genético. Los principales resultados del meta-análisis se resumen en la Tabla 4.
No se observó significación estadística en el polimorfismo C677T y el cáncer de cuello de útero para la población en general en todos los contrastes genéticos (TC vs. CC: O = 0,82, IC 95% 0,63 a 1,06; TT vs CC: OR = 0,95; IC del 95%: 0,76 a 1,19; CT + TT vs CC: OR = 0,84, IC del 95%: 0,64 a 1,11; TT vs TC + CC: OR = 1,05, IC 95% 0,85 a 1,28). Digno de mención, sin embargo, la heterogeneidad significativa entre los estudios individuales se observó en modelo de co-dominante (CT vs CC:
P
h
= 0,01) y el modelo dominante (CT + TT vs CC:
P
h
= 0,00), lo que hace análisis necesarios estratificado.
Como blancos y asiáticos poblaciones estaban involucrados en la mayoría de los estudios, también se realizaron análisis de subgrupos para reducir la heterogeneidad introducida por los diferentes grupos de etnia . Los resultados para la población asiática se replican como asociación no significativa. Cuando clasificamos más el grupo asiático de acuerdo a ciertos países, los resultados de Corea y la India siguieron siendo nula asociación, aunque con un número finito de estudios. En cuanto a la población blanca, el modelo de co-dominante, así como modelo dominante resultaron ser de significación estadística, con una OR de 0,72 (IC 95% 0,59-0,88), (IC del 95%: 0,49 hasta 0,97) 0,69 y 0,79 ( IC 95%: 0,59 a 0,86), respectivamente, indicó una disminución del riesgo de cáncer de cuello de útero para los individuos homocigotos o heterocigotos para el alelo T entre las mujeres blancas.
con respecto a la NIC, las RUP agrupados no mostraron ninguna asociación estadística entre el polimorfismo C677T y el riesgo de CIN (TC vs. CC: OR = 1,15, IC del 95%: 0,98 a 1,35; TT vs CC: OR = 1,14; IC del 95%: 0,90 a 1,45; CT + TT vs CC: OR = 1,14, IC del 95%: 0,98 a 1,33; TT vs TC + CC: OR = 1,04, IC 95% 0,84 a 1,29). A medida que las lesiones CIN se podrían dividir en lesiones de bajo y alto grado (CIN I y CIN II /III, respectivamente) y la mayor parte de los estudios individuales han definido estas dos categorizaciones, estaban disponibles para realizar un subanálisis para CIN datos. homogeneidad de sonido se observó en dos subgrupos, y asociaciones no correlacionadas también se replica (Tabla 4). Los resultados de los subgrupos basados en el origen étnico no eran factibles para sólo papeles limitados siempre y cuando los datos necesarios.
El sesgo de publicación
En cuanto a cáncer de cuello uterino, las formas de los gráficos en embudo no reveló ningún signo de asimetría obvia . Además, los resultados de la prueba de Egger no sugirieron ningún sesgo de publicación (TC vs. CC:
P
= 0,55; TT vs CC:
P
= 0,54; CT + TT vs CC :
P
= 0,60; TT vs TC + CC:
P
= 0,36). Del mismo modo, ningún sesgo de publicación significativo fue demostrado en relación con CIN (TC vs. CC:
P
= 0,11; TT vs CC:
P
= 0,71; CT + TT vs CC:
P
= 0,17; TT vs TC + CC:.
P
= 0,97)
análisis de sensibilidad
Para toda la población, no había ninguna salida extraordinaria de las RUP iniciales cuando las estimaciones combinadas se volvieron a calcular al omitir un estudio a la vez, y no se observó asociación no significativa consistente a través de todas las comparaciones genéticas en el cáncer de cuello de útero y los estudios CIN, lo que indica que los resultados generales fueron lo suficientemente robusta (datos no mostrados) .
en la población blanca, los análisis de sensibilidad en punta con un menor riesgo, ya que las estimaciones totales documentadas, de los genotipos mutantes, sin embargo estadísticamente convertirse en un factor de protección (para el modelo codominante:
P
= 0,42 y 0,34, para el modelo dominante:.
P
= 0,33) cuando se excluyeron del estudio los Países Bajos [20], manifestando que esta investigación había ejercido un fuerte impacto en los resultados observados
Discusión
metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), una enzima crítica en el metabolismo del folato que dependen de la homocisteína, está implicada en la conversión de 5,10-metilentetrahidrofolato (5,10-methyleneTHF) a 5-metiltetrahidrofolato (5 -methylTHF) -la principal forma circulante de ácido fólico y el donante de carbono para la remetilación de la homocisteína en metionina [34]. polimorfismo C677T, el polimorfismo de nucleótido único funcional más localizada común en la MTHFR, se caracteriza por la citosina (C) a timina transición (T), que resulta en la conversión de una alanina (GCC) para una valina (GTC) en el codón 225 en el N dominio catalítico-terminal de la proteína. En comparación con el genotipo homocigoto normal (CC), ambos heterocigotos (TC) y homocigotos variantes (TT) se demuestra que tienen una mayor termolábil de la enzima, la actividad de la enzima MTHFR reducida, niveles elevados de homocisteína [34] y de plasma más bajos y las concentraciones de folato en glóbulos rojos [circulantes ,,,0],35]. Actualmente, se está convencido de que la deficiencia de folato se asocia con la carcinogénesis principalmente a través de dos mecanismos de [36]: (1) La conversión de uracilo a timina, que se utiliza para la síntesis de ADN y la reparación, requiere grupo metilo proporcionada por 5,10-methyleneTHF, por lo tanto, limitada folato puede interferir la biosíntesis de timidilato y posteriormente dar lugar a la síntesis de ADN anormal, la metilación y la reparación de cromosomas; (2) bajos niveles de 5-methylTHF hipometilación causa de ADN y potencialmente inducir la expresión de proto-oncogén como consecuencia del agotamiento de celular S-adenosilmetionina, que también es responsable de la metilación del ADN.
Cada vez hay más interés en el investigaciones relativas a las asociaciones del polimorfismo C677T MTHFR y la susceptibilidad o resistencia a la evolución del cáncer. Sin embargo, los resultados no son concluyentes, lo que impulsó a los investigadores a prestar atención a este polimorfismo en un nivel meta-analítico. En general, los efectos protectores del polimorfismo C677T en el cáncer colorrectal [37] y la infancia leucemia linfocítica aguda [38] han sido identificados por dos meta-análisis actualizado recientemente incluidos, respectivamente, 61 y 21 estudios de casos y controles publicados. Por el contrario, otras muestras grandes meta-análisis han propuesto un mayor riesgo de esófago y cáncer gástrico [39], así como el cáncer de mama [40], y sin embargo, no hubo evidencia de apoyo que C677T variantes contribuido al cáncer de pulmón [41], [42], cáncer de cabeza y cuello [42] o cáncer de próstata [43] a partir de publicaciones disponibles en la actualidad.
En referencia a la susceptibilidad a la enfermedad cervical, el primer estudio considerando polimorfismo C677T como un marcador molecular potencial se llevó a cabo por Piyathilake et al. [15] en 2000, que investigó 64 casos y 31 controles y sugirió un 2,9 veces mayor riesgo de NIC entre las mujeres que llevan ya sea heterocigoto mutante o genotipo homocigótico. Resultados similares fueron reportados por Goodman et al. [16] encontró que las mujeres con al menos un alelo mutante T tenían dos veces más riesgo de displasia cervical con una muestra de tamaño más grande. Lambropoulos et al. [17] En primer lugar reportaron una asociación nula entre el polimorfismo MTHFR y el riesgo de cáncer de cuello uterino, y también, variantes C677T no estaban relacionados con el riesgo de CIN. Después, repetidas investigaciones de diferentes regiones surgieron. Sin embargo, ya sea de protección [20], [21], [22] o el riesgo de efectos [18], [26] se han establecido, mientras que en algunos estudios, se informó de asociación nula [19], [23], [24] , [25].
puede haber varios factores que atribuyen a estos resultados contradictorios. En primer lugar, un pequeño número de sujetos de estudio se presentaron en algunos estudios [15], [19], [21], lo que podría reducir el poder estadístico del estudio mediante la limitación de la capacidad para estimar la asociación más precisa. En segundo lugar, el sesgo de selección de la participación brazo del estudio, los pacientes y los controles, podría ser una posible explicación de las discrepancias entre los estudios individuales, ya que todas las mujeres fueron reclutados de diferentes piscinas. En tercer lugar, las variaciones durante los procedimientos de laboratorio como fuente de ADN (a partir de tejido cervical o muestra de sangre), el uso de imprimación comercial o auto-diseño o condición amplificación por PCR podrían haber afectado los resultados. Por otra parte, los modelos genéticos aplicados en los estudios individuales fueron en gran medida diversa y por lo general sólo se utilizaron uno o dos modelos, por lo tanto las conclusiones incomprensibles o conflictivos podrían ser llevados por las diferencias metodológicas. Por último, pero no menos importante, los efectos de la heterogeneidad genética debido a la diferente ascendencia de las poblaciones de estudio no pueden ser ignorados. Las frecuencias de los alelos 677T, por ejemplo, se han reportado más prevalente en los hispanos en comparación con los no hispanos [44]. La heterogeneidad que eran inherentes entre las subpoblaciones puede llevar tanto de tipo I y tipo II errores y confundir la asociación entre el polimorfismo C677T de bienes y el cáncer cervicouterino, donde un resultado positivo o negativo podría ser atribuible a la inferencia artificial estratificación de la población
.
para aclarar aún más la relación entre el polimorfismo C677T y la enfermedad cervical, se realizó este meta-análisis. Los OR agrupados indican que las variantes C677T se asociaron con ninguna combinación ni estratificado CIN entre la población en general para todos los modelos genéticos. No hubo correlación significativa estadística, ya sea detectado en la población en general el cáncer cervical, mientras que los análisis de subgrupos apuntaban a una disminución en el riesgo entre las mujeres blancas con genotipos mutantes. No obstante, los análisis de sensibilidad en punta con un menor riesgo, ya que los resultados totales documentadas, pero sin estadísticamente convertirse en un factor de protección cuando se excluyó del estudio Países Bajos [20]. Los resultados anteriores estaban de acuerdo con la mayoría de los estudios relacionados como se resume en nuestro meta-análisis y también, manifiestan que el papel de la MTHFR polimorfismo C677T en el desarrollo de la carcinogénesis cervical podría estar mediado por la etnicidad.
Hemos asumido que la etnicidad diferencias, como hemos mencionado anteriormente, fueron la principal razón de la asociación inversa impulsado por la población blanca. Sin embargo, este hallazgo era vulnerable a la potencia estadística en el análisis de sensibilidad. Esta falta de consenso podría ser el resultado de dos aspectos. De acuerdo con las normas de Estados Unidos OMB, el subgrupo de población blanca se compone de sólo tres países europeos (Grecia [17], Países Bajos [20] y Polonia [24]) y México [21], los Países Bajos representaron la mayor proporción de la combinación tamaño de la muestra (636/851 592/940 y para el caso de control) y el único estudio que demostró una asociación protectora significativa entre los cuatro países, por lo que fue probablemente que las significaciones fueron impulsados por este estudio muy grande. Por otra parte, sólo el estudio Países Bajos se hizo en el contexto de un examen del cuello uterino basado en la población con el objetivo de detectar los genes de susceptibilidad neoplasia cervical, por lo tanto, los impactos potenciales podrían ser introducidos por las diferencias de diseño del estudio. A la luz de la particularidad del estudio Países Bajos, se consideró que la población blanca debe interpretarse con cautela.
En este meta-análisis, se identificaron todos los estudios en este campo, y se dirigió a las estimaciones de riesgo individuales, así como el resultados agrupados utilizando varios modelos genéticos. Los datos acumulados fueron sustanciales para superar el problema propuesto por Colhoun et al. [45] que los resultados contradictorios eran principalmente debido al tamaño pequeño de la muestra. Y el análisis de Egger y Begg de no detectar cualquier sesgo de publicación, lo que indica que nuestros resultados fueron imparcial.
Sin embargo, ciertas limitaciones en este estudio tuvieron que ser reconocido. En primer lugar, se observó una gran heterogeneidad entre los estudios, lo que significaba la interpretación de nuestros resultados deben llevarse a cabo con cuidado. La heterogeneidad observada podría deberse a diferencias tales como las variaciones de la etnicidad, el tipo específico de cáncer de cuello uterino, criterios de selección de casos y controles, los factores socioeconómicos y así sucesivamente. Y, sin embargo subanálisis en todas estas variables no se llevaron a cabo como los participantes en el estudio de los estudios anteriores variaron mucho y datos no pudieron ser presentadas en un estándar uniforme. En segundo lugar, otro polimorfismo en desequilibrio de ligamiento (LD), a saber, A1298C, que también causó la disminución de actividad de la enzima MTHFR, aunque en menor medida [46], también deben ser considerados para explicar los efectos de polimorfismo MTHFR en la carcinogénesis cervical solo o en combinación con genotipos C677T. Y sin embargo, nuestro estudio se basó en la estimación de un solo factor. Por otra parte, dada la complejidad del progreso del tumor y los modestos efectos genéticos de un solo gen, los factores ambientales y los efectos aleatorios no podían ser descartados. Con respecto a las enfermedades cervicales, los comportamientos individuales, por ejemplo, la edad de la primera relación sexual [47], múltiples parejas sexuales [48], la falta de anticonceptivos de barrera utiliza [49], fueron también presentados como factores de riesgo, pero las interacciones entre estos factores y variantes C677T no se describieron en nuestro estudio.
en resumen, este meta-análisis sugiere que las mujeres blancas con genotipos C677T mutantes podrían tener un menor riesgo de cáncer de cuello uterino, sin embargo, carecen de suficiente solidez estadística. Teniendo en cuenta la limitación de este estudio, se debe tener cuidado en sacar conclusiones firmes. Se requieren conjuntos de datos combinados y comparativos de estudios prospectivos a mayor escala para obtener más información sobre el papel de este polimorfismo en el desarrollo de la carcinogénesis cervical y para identificar los efectos conjuntos con los factores ambientales.
Apoyo Protocolo de información de
S1.
PRISMA 2009 Lista de verificación.
doi: 10.1371 /journal.pone.0046272.s001 gratis (DOC)
Lista de verificación S1.
Archivo Suplementario para la Figura 1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0046272.s002 gratis (DOC)