Extracto
El cáncer de próstata (CaP) es actualmente la neoplasia más frecuentemente diagnosticada en los países occidentales. Es más frecuente en hombres mayores con el 75% de los casos incidentes de más de 65 años de edad. Después de la prostatectomía radical, aproximadamente el 30% de los hombres a desarrollar recurrencia clínica con niveles de antígeno prostático específico en suero elevada. Por lo tanto, es importante para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión de la PCa para desarrollar nuevos enfoques de diagnóstico /terapéuticos. En este estudio, se pretende comparar el perfil de microARN (miARN) de los tejidos tumorales de próstata recurrentes y no recurrentes para explorar la posible participación de miRNAs en la progresión del CaP. El ARN total de 41 recurrentes y no recurrentes 41 muestras de tejidos de CaP se utilizaron para investigar la firma miARN en muestras de CaP. En primer lugar, 20 recurrente y 20 muestras de CaP no recurrentes fueron perfilados usando miARN chips de micromatriz. De los miRNAs expresados diferencialmente, se seleccionaron MIR-1, miR-133b y miR-145 * de seguir validando con QRT-PCR en un conjunto diferente de 21 periódicos y 21 muestras de CaP no recurrentes. Los datos fueron analizados estadísticamente mediante la prueba t de Student bilateral, la prueba de correlación de Pearson, utilizando un análisis de característica. Nuestros resultados demuestran que el miR-1 y miR-133b han sido regulados a la baja de manera significativa en CaP recurrente especímenes en comparación con muestras de CaP no recurrentes y tienen poder suficiente para distinguir muestras recurrentes de los no recurrentes por su propia cuenta. Aquí, mostramos que la expresión relativa de miR-1 y miR-133b se han reducido significativamente en CaP recurrente especímenes en comparación con muestras de CaP no recurrentes, que pueden servir como nuevos biomarcadores para la predicción de la progresión del CaP.
Visto: Karatas DE, E Guzel, Suer I, Ekici ID, Caskurlu T, Creighton CJ, et al. (2014) miR-1 y miR-133b se expresan diferencialmente en pacientes con cáncer de próstata recurrente. PLoS ONE 9 (6): e98675. doi: 10.1371 /journal.pone.0098675
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 13 Marzo, 2014; Aceptado: 30 de abril de 2014; Publicado: 26 Junio 2014
Derechos de Autor © 2014 Karatas et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. matriz de datos se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO) con el número de GSE55323
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Científico y Tecnológico de Investigación (TÜBITAK) (número de concesión 108S051), así como en parte por el Instituto de los Estados Unidos Nacional de Salud (CJC y el MI, subvención P30 CA125123). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. CJC es un miembro del Consejo Editorial PLOS y esto no altera la adhesión de los autores a PLOS ONE políticas y criterios editoriales.
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es actualmente el tumor maligno más frecuentemente diagnosticado y la segunda causa de muerte por cáncer entre los hombres mayores de 50 años en los países occidentales [1]. CaP tiene una propensión a ser mucho más frecuente en hombres de edad avanzada con un 75% de los casos incidentes de más de 65 años [2]. La prostatectomía radical, radioterapia radical y la terapia de ablación hormonal son las técnicas que se aplican preferentemente para la primera etapa clínicamente localizada tumores para curar la enfermedad, las tasas de supervivencia sin embargo, estas técnicas no necesariamente proporcionan una mayor [3] y casi el 30% de los hombres desarrollan recurrencia clínica con aumento de los niveles séricos del antígeno específico de la próstata (PSA) [4]. Por otra parte, para los tumores avanzados y metastásicos, la quimioterapia, que es la única opción, la mayoría no presta resultado clínico positivo [5]. Por lo tanto es de gran importancia para comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del cáncer de próstata para desarrollar enfoques diagnósticos y terapéuticos novedosos
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Los microARN (miARN) son sintetizados endógenamente, reguladores no codificantes ARN pequeños compuestos por alrededor de 20 nucleótidos y considerados como una nueva clase de genes reguladores. Suprimen expresión de sus objetivos a través de la degradación del ARNm o inhibición de la traducción como consecuencia de enlace incompleto para las regiones 3 'no traducidas (3'UTR) del ARNm [6]. MiRNAs se supone que regulan la expresión de casi el 60% de los genes humanos [7]. Aproximadamente la mitad de los miRNAs humanos anotados están ubicados en sitios frágiles del genoma que sugiere que estas moléculas pequeñas podrían tener una función vital en la patogénesis de varias enfermedades incluyendo el cáncer [8], [9]. Ellos han demostrado ser capaces de distinguir los estados de diferenciación de varios tumores malignos, incluyendo los cánceres de mama, pulmón y colon. Además, hay estudios que sugieren miARN perfiles de expresión pueden distinguir malignas de tejidos de la próstata no malignos [10], [11]. Hay, sin embargo, un número limitado de informes en la literatura estudiada miRNAs en la progresión del cáncer de próstata.
Mirna perfiles mediante microarrays es una técnica muy valiosa para determinar una firma miARN, que es necesariamente significativo para averiguar lo general y alteraciones de expresión específicos entre distintos tipos de tejidos [12], [13]. En este estudio, el objetivo fue comparar el perfil de miARN de los tejidos tumorales de próstata recurrentes y no recurrentes para arrojar luz sobre una posible participación de miRNAs en la progresión del CaP.
Materiales y Métodos
Los pacientes
ARN fueron aisladas de 41 y 41 cánceres recurrentes de carácter no recurrente de prostatectomías radicales, que contenían al menos el 70% del tejido tumoral, que se obtuvieron de Colegio Baylor de Medicina programa de cáncer de próstata. La recurrencia se define como dos PSAs consecutivas de suero mayores que 0,2 ng /ml. Los pacientes fueron seguidos durante hasta recurrencia de PSA o por lo menos 4 años (para los casos no recurrentes). Este estudio ha sido aprobado por un comité de revisión institucional interna del Baylor College of Medicine. Los pacientes fueron incluidos en el estudio después de dar su consentimiento informado por escrito. Las características de los pacientes recurrentes y no recurrentes se resumen en la Tabla 1.
Aislamiento de ARN total
El ARN total de 41 periódicos y 41 muestras de tejido no recurrentes utilizando Trizol (Invitrogen , San Diego, CA) reactivo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las purezas y concentraciones de las muestras de ARN se determinaron espectrofotométricamente utilizando NanoDrop ND-2000c (Thermo Fisher Scientific, Inc., Wilmington, DE). La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel y comprobar in situ de ácido nucleico cuantificación Kit (Sigma).
Mirna Microarray y análisis de datos
100 ng de ARN total de 20 periódicos y 20 muestras no son recurrentes marcado con Cy3 mediante el uso de Agilent miRNA kit de marcaje siguiendo el protocolo del fabricante. ARN marcados se desnaturalizan y se hibridan a Agilent 8 × 15 k miARN microarrays V2 compuesta de 799 sondas dirigidas a una amplia selección de 723 personas y 76 miRNAs virales humanas con sondas de control de Sanger miRBase (liberación 10,1) a 55 ° C durante 20 horas de calor. Después de la hibridación y post-hibridación lavados, las diapositivas se escanean inmediatamente en Agilent Microarray escáner con SureScan de alta resolución Tecnología (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Característica v10.7.3.1 extracción (Agilent Technologies, CA) de software se utilizó para extraer todas las características de los datos obtenidos a partir de las imágenes escaneadas y software Bioconductor se utilizó para analizar los datos en bruto, que se normalizaron cuantil normalización. Los valores de p (t-test de dos caras) y doblar los cambios entre los grupos de comparación se calcularon a partir de datos de transformación logarítmica. Fuera de 15714 sondas, el número de verdaderos positivos tendría que ser muy superior 157 para la Tasa de Falso Descubrimiento esperado (FDR), que se considera bajo (utilizando el método por Storey et al. [14]). Las sondas nominalmente importantes no superaron la oportunidad esperada por múltiples pruebas, lo que hizo necesaria la validación adicional de seleccionar miRNAs. matriz de datos se han depositado en la Expresión Génica Omnibus (GEO, número de acceso GSE55323).
Síntesis de ADNc y cuantitativa en tiempo real PCR
Para validar la expresión diferencial de miR-1, miR se estudiaron 133b y miR-145 *, muestras de ARN a partir de un conjunto diferente de 21 periódicos y 21 pacientes no recurrentes. Para los experimentos de miRNA QRT-PCR, cantidades iguales de ARN total (30 ng) de cada muestra se utilizó para la síntesis de primera cadena de ADN (ADNc) utilizando miRNA cebadores específicos adquiridos de Applied Biosystems y "TaqMan MicroARN kit de transcripción inversa" de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). TaqMan hsa-miR-1 (Ensayo ID: 002222), -133b (Ensayo ID: 002247) y -145 * (ensayo ID: 002149). Kits de amplificación se obtuvieron de Applied Biosystems (Foster City, CA):
análisis de los genes miARN expresión por RT-PCR cuantitativa se llevó a cabo utilizando un tiempo real termociclador Roche LightCycler480-II (Roche, Suiza). TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) se utilizó y sondas específicas de microARN se compraron de Applied Biosystems (Dinamarca). datos de los genes miARN expresión se normalizaron a RNU43. Cada experimento se realizó por duplicado. El análisis de la cuantificación relativa se realizó mediante el método delta-delta-Ct como se describe anteriormente [15].
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de Student bilateral. Un valor de p & lt; 0,05 se consideró como estadísticamente significativo. Se utilizó la prueba de correlación de Pearson para mostrar la correlación de miR-1 y miR-133b expresión en muestras de CaP. (ROC) curvas de eficacia Se trazaron con el programa SPSS 15.0 para ver el poder de PSA y miRNAs para diferenciar a las muestras de CaP recurrentes a partir de muestras de carácter no recurrente. Para el análisis ROC, la regresión logística se llevó a cabo y las probabilidades predichas se calcularon para cada sola miARN o miR-1 y miR-133b juntos. A continuación, el área bajo la curva se calcula con intervalo de confianza del 95%. El área bajo la curva se acepta significativamente diferentes de 0,5 cuando el valor p es mayor que 0,5 sentido de que la regresión logística clasifica el grupo significativamente mejor que por casualidad.
Resultados
Un total de 41 recurrente y 41 tumores no recurrentes de las prostatectomías radicales, que se obtuvieron de Colegio Baylor de Medicina programa de cáncer de próstata, se incluyeron en este estudio para llevar a cabo miARN perfiles (Tabla 1). La edad media en el momento de la cirugía de los pacientes con CaP con recidiva fueron 62,8 ± 6, mientras que aquellos sin recurrencia tenían una edad media de 61,7 ± 7,2 (no significativo, p = 0,54, Mann Whitney). Más del 80% de los pacientes de ambos grupos eran caucásicos no hispanos. Promedio de meses de operación para 1
st recurrencia o la última evaluación normal para pacientes con CaP recurrente y no recurrentes fueron 22,63 ± 3,89 y 76,59 ± 2,87, respectivamente. rangos de los niveles de PSA de 4,2 a 100 y 3,1 a la el 40,3 en los pacientes con recurrencia y no repetición, respectivamente. Como era de esperar, el nivel medio del PSA preoperatorio de los pacientes recurrentes fue casi el doble que la de los pacientes no recurrentes (22 vs 11,3 ng /ml). En los pacientes recurrentes sólo 3 muestras fueron Gleason 6 (3 de 41), mientras que para los pacientes no recurrentes 14 de 41 muestras eran Gleason 5 o 6. Del mismo modo, 15 de 40 prostatectomías radicales de pacientes recurrentes para los cuales se dispone de datos mostraron invasión de vesículas seminales, pero Sólo 4 de 41 cánceres no recurrentes tenían esta característica. Así, mientras que las características demográficas de los dos grupos son muy similares, los cánceres recurrentes son mucho más altamente agresivo basado en las características clínicas y patológicas.
Para comparar los perfiles de miARN de CaP recurrente y especímenes no recurrentes, se llevó el análisis de microarrays a cabo utilizando 20 muestras de cada grupo. el análisis de microarrays de 20 periódicos y 20 muestras no recurrentes reveló que 93 sondas se han expresado diferencialmente con un valor de p inferior a 0,01. De las 93 sondas nominalmente significativos reportados, hay 84 mapeo de miRNAs humanos, que se proporcionan en la Tabla S1.
Un mapa de calor representación de miRNAs expresados diferencialmente se demuestra en la Figura 1A. Entre los miRNAs desregulados significativamente, MIR-1, MIR-133b, y miR-145 * (Figura 1B) fueron seleccionados para su posterior confirmación de QRT-PCR en un conjunto diferente de los recurrentes y no recurrentes muestras de CaP.
(A) mapa de calor representación de miRNAs desregulados significativamente en CaP recurrente especímenes vs muestras de CaP no recurrentes. (B) El calor de ruta representación de miR-1, miR-133b y miR-145 * en el CaP recurrente especímenes vs muestras de CaP no recurrentes.
Los QRT-PCR resultados demostraron que la expresión nivel de miR-1 se redujo significativamente en muestras recurrentes CaP que la de las muestras de tejido de CaP no recurrentes (Figura 2A, p = 0,036). Regulación a la baja de miR-133b en el CaP recurrente (Figura 2B, p = 0,012) también se confirmó. Por el contrario, aunque hay una ligera disminución en el nivel de expresión de miR-145 * en las muestras recurrentes en comparación con los no recurrentes, la diferencia no fue estadísticamente significativa (Figura 2C, p & gt; 0,05). Para evaluar la correlación de miR-1 y miR-133b expresión en ambos especímenes CaP no recurrentes recurrente y, se utilizó el análisis de correlación de Pearson, lo que demuestra que el miR-1 de expresión fue fuertemente correlacionada con la expresión de miR-133b en muestras de tejido PCA (Figura 3, el coeficiente de correlación (R) = 0,780).
niveles de expresión relativa de (a) miR-1, (B) miR-133b, y (C) de miR-145 * 20 en CaP recurrente en comparación con especímenes 20 muestras de CaP no recurrentes. RNU43 se utilizó para la normalización de la expresión de los genes miARN análisis.
Para probar la potencia del PSA, miR-1 y miR-133b para distinguir recurrente CaP especímenes de muestras no recurrentes, de funcionamiento del receptor curvas (ROC) se representaron, que mostró que el PSA, el miR-1 y miR-133b tuvieron área bajo la curva (AUC) valores de 0,950, 0,661 y 0,692, respectivamente, lo que demuestra que son suficientes para tener el poder para distinguir muestras recurrentes de los no recurrentes por su cuenta. Por otra parte, cuando el miR-1 y miR-133b se evaluaron juntos han representado una mejor potencia (AUC; 0,719). Que el caso en el que se analizaron individualmente miRNAs (Figura 4)
Las curvas para miRNAs individuales y su poder cooperativo para discriminar dos grupos de pacientes que constan de 20 periódicos y 20 muestras de CaP no recurrentes.
Discusión
PCA es una enfermedad muy heterogénea, por lo que los indicadores pronósticos actuales fallan sobre todo para determinar el resultado y casi el 30% de los pacientes con CaP experimentan una recaída después de una exitosa prostatectomía radical o la terapia adyuvante [16], [17]. Actualmente, el estadio del tumor primario, el nivel de PSA en suero, y la biopsia grado de Gleason se utilizan durante la evaluación clínica para predecir la fase patológica del tumor y de la eficiencia del tratamiento, sin embargo, ninguno o incluso una combinación de estos indicadores son suficientes para anticipar fiable resultado para los pacientes [3], [4]. Un criterio de consenso sobre la definición de recurrencia bioquímica en base a los niveles de PSA, no ha sido bien establecida, lo que impide el establecimiento de un modelo de pronóstico estándar en los hombres tratados con prostatectomía radical [18]. Además, la detección de PSA en el suero de pacientes con CaP después de la prostatectomía radical puede ser debido a la presencia de tejido benigno de la próstata residual, que extravía practicantes para llegar a un diagnóstico positivo falso [19]. Por otra parte, los pacientes con niveles de PSA en suero similares, la puntuación de Gleason y el estadio patológico se han demostrado tener resultados clínicos distintos debido a la heterogeneidad de los subtipos a nivel molecular [20], [21].
Debido a la hecho de que se necesitan urgentemente nuevos biomarcadores de pronóstico para el desarrollo más eficaz, optimizado y estrategias de terapia individualizada, varios biomarcadores pronósticos putativos fueron sugeridas en los últimos años, que logró un éxito limitado en la estratificación de los pacientes [22]. Por ejemplo, varios genes, que son detectados específicamente en la glándula de la próstata, tales como humano KLK2, PCA3, antígeno de membrana específico de la próstata y del antígeno de células madre de la próstata se sugirieron como útiles marcadores de pronóstico para la predicción de las características patológicas en pacientes con CaP [23]. expresiones alteradas de Bcl-2 y Bax también se asociaron con el desarrollo posterior de la recurrencia bioquímica [18]. Sin embargo, entre los genes propuestos como biomarcador pronóstico en función de la expresión génica a gran escala de perfiles de estudios, sólo unos pocos genes podrían ser validados en múltiples estudios [24]. Por otra parte, varios modelos de predicción de riesgo clínicos se han desarrollado para predecir el riesgo de recurrencia bioquímica o fracaso clínico, aunque estos tampoco para estimar de forma fiable y precisa el resultado clínico debido a la heterogeneidad de la enfermedad [25]. Teniendo en cuenta las limitaciones de las herramientas y modelos de pronóstico actuales, es importante la incorporación de nuevos biomarcadores de los modelos existentes para superar estas limitaciones durante el proceso de toma de decisiones clínicas.
Por lo tanto, es un objetivo vital en la investigación actual del cáncer de próstata para descubrir biomarcadores moleculares de pronóstico eficaces que ayuden a identificar con precisión los pacientes con enfermedad metastásica agresiva y con el fin de orientar las decisiones terapéuticas y determinar los pacientes que necesita un seguimiento más estrecho y cuidados intensivos. Además, la identificación de biomarcadores que tienen potencial para predecir la recurrencia después de la prostatectomía radical sería de importancia clínica de suma importancia para decidir si se requiere terapia adyuvante. Tales biomarcadores serían especialmente de gran valor para los pacientes con resultados distintos a pesar de que tienen características clínicas similares
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La primera implicación de miRNAs en la biología del cáncer ha sido descrita a través de la detección de miR-15 y miR-16 en la regulación a la baja crónica de células B leucemias linfocíticas [26]. Desde entonces, varios miRNAs se asociaron con la patogénesis del tumor a través de jugar papel en la iniciación, progresión y metástasis del cáncer [27], [28]. Además de investigar la expresión diferencial de miRNAs en el cáncer, es importante explorar los perfiles de miARN de muestras para averiguar una asociación de los genes miARN expresión con el resultado clínico.
miR-1 y miR-133b, codificada a partir de miR -1 /133a y miR-206 /133b racimos, se denotan como miRNAs específicos de músculo [29] y no se informó a ser regulados a la baja frecuencia en diversos tipos de tumores [30]. Además, su sobreexpresión ectópica se ha demostrado que inhibe el crecimiento celular, la migración celular e inducir la apoptosis en varios tipos de cáncer [30]. MIR-1 ha sido recientemente propuesto como un marcador pronóstico en el CaP para predecir la recurrencia [31]. Su regulación a la baja podría estar implicado en el CaP recurrencia niveles elevados exhaustivas de sus objetivos. Por ejemplo, la sobreexpresión de CXCR4 y SDF-1 alfa, como dianas validadas de miR-1 [32], se asociaron con recurrencia local y metástasis a distancia en el CaP [33] y de mal pronóstico en la etapa II adenocarcinoma ductal pancreático [34], respectivamente. La regulación positiva de NOTCH3, un oncogénico miR-1 objetivo, también se ha demostrado asociarse con CaP recurrencia [35]. En cuanto al papel de miR-133b en la recurrencia, se ha asociado con la supervivencia global y la metástasis en el cáncer de colon [36] y propuesto como un biomarcador de pronóstico para CaP recurrencia en un estudio muy reciente [37]. Los niveles elevados de objetivos de miR-133b validados como CXCR4 [38], FGFR1 [39], FSCN1 [40] se ha asociado con el pronóstico de varios tipos de cáncer.
Conclusiones
Las técnicas actuales hacen no necesariamente proporcionar las tasas de supervivencia mejoradas para los pacientes con CaP y casi el 30% de los hombres a desarrollar recurrencia clínica con niveles de antígeno prostático específico en suero elevada. Por lo tanto, es de suma importancia para desentrañar los mecanismos moleculares que subyacen a la progresión del CaP a desarrollar nuevas herramientas terapéuticas y diagnósticas /eficaces. En este caso, nos informan de que el miR-1 y miR-133b han sido regulados a la baja de manera significativa en CaP recurrente especímenes en comparación con muestras de CaP no recurrentes, que pueden servir como nuevos biomarcadores para la predicción de la progresión del CaP.
Apoyo a la Información
Tabla S1. Francia El listado de miRNAs expresados diferencialmente en recurrentes frente a no-recurrentes muestras de cáncer de próstata
doi:. 10.1371 /journal.pone.0098675.s001 gratis (XLS)
Reconocimientos
agradecemos Yiqun Zhang para la asistencia técnica en el análisis de microarrays.