Extracto
Antecedentes
El microARN miR-101 es downregulated en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de vejiga. Sin embargo, el papel de miR-101 en la invasión, metástasis y quimiosensibilidad de las células de cáncer de vejiga sigue siendo poco clara. Este estudio se realizó para determinar el papel de miR-101 en el lymphangiogenic factor de crecimiento endotelial C molécula vascular (VEGF-C) y sus efectos sobre la migración de las células del cáncer de vejiga, la invasión y la quimiosensibilidad al cisplatino.
Métodos
Dos líneas celulares de cáncer de vejiga (T24 y 5637) y la línea celular 293T herramienta se emplearon aquí. células de cáncer de vejiga fueron transfectadas ya sea con un vector sobreexpresión miR-101 o de un lentivirus de secuencia revueltos, ambos de los cuales exhibe una alta eficiencia de transfección. Non-transfección se utilizó como control negativo simulado. La cicatrización de heridas y ensayos Transwell se realizaron para medir la migración celular y la invasión. Un ensayo de informador de luciferasa se realizó para validar la interacción de miR-101 con la región no traducida 3 'de VEGF-C seguido por RT-PCR y la confirmación de transferencia Western. Un ensayo de MTS se utilizó para evaluar la sensibilidad a cisplatino de las líneas celulares.
Resultados
miR-101 sobreexpresión inhibe significativamente la migración y la invasión al tiempo que mejora significativamente la sensibilidad cisplatino. miR-101 regula negativamente la expresión de proteína VEGF-C, y VEGF-C sobreexpresión rescató a los efectos de miR-101 sobreexpresión, lo que indica que miR-101 regula negativamente la expresión de la proteína VEGF-C post-transcripcionalmente. miR-101 y la interferencia de VEGF-C aumentó de forma independiente citotoxicidad cisplatino en células de cáncer de vejiga.
Conclusiones
miR-101 suprime la expresión de VEGF-C, inhibe la migración celular y la invasión, y aumenta la sensibilidad a cisplatino en células de cáncer de vejiga. Este estudio proporciona nueva información sobre el papel de miR-101 en el cáncer de vejiga y muestra la promesa de miR-101 como un objetivo molecular potencial para el cáncer de vejiga
Visto:. Lei Y, Li B, Tong S, Qi L, Hu X , Cui Y, et al. (2015) miR-101 suprime de crecimiento endotelial vascular Factor C que inhibe la migración y la invasión y mejora cisplatino quimiosensibilidad de las células del cáncer de vejiga. PLoS ONE 10 (2): e0117809. doi: 10.1371 /journal.pone.0117809
Editor Académico: Ming Tan, de la Universidad del Sur de Alabama, Estados Unidos |
Recibido: 21 Agosto, 2014; Aceptado 30 de diciembre de 2014; Publicado: 6 Febrero 2015
Derechos de Autor © 2015 Lei et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la Juventud de China (Nº 81.202.005), el Fondo plan de Tecnología de la Ciencia de Hunan (núm 2013FJ4109 ), y el Fondo de Innovación Universidad central del Sur para la exploración independiente de Graduados (Nº 72150050587). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de vejiga es el tumor maligno más frecuente del tracto urinario, produciendo aproximadamente 150.000 muertes anuales en todo el mundo [1] y se caracteriza clínicamente por su progresión, recurrencia, metástasis y resistencia a los medicamentos [2, 3]. A pesar de la quimioterapia agresiva, el 10-20% de los cánceres de vejiga no músculo-invasivo en última instancia, el progreso de músculo invasivo cáncer de vejiga [4]. El enriquecimiento de los vasos sanguíneos y linfáticos en la propia urotelial lámina, invasión de vasos sanguíneos, la profundidad de la invasión, y la condición de los ganglios linfáticos regionales han sido identificados como factores pronósticos independientes de supervivencia post-cistectomía libre de tumor, con la mayoría de los casos de la fase II y por encima distalmente recurrentes con cada nodo linfático positivo adicional que aumenta el riesgo de mortalidad en un 20% [5,6]. Aunque el cisplatino es la quimioterapia de primera línea para el cáncer de vejiga avanzado, el /gemcitabina (CG) régimen de cisplatino, tiene un tiempo hasta la progresión media de sólo seis meses y no tiene efecto sobre la supervivencia global después de la cistectomía radical en pacientes de alto riesgo [7 ]. A pesar de la cistectomía radical o la quimioterapia preoperatoria, la invasión linfovascular incontrolada de cáncer de vejiga sigue dando un mal pronóstico clínico [8-10]. Por lo tanto, es necesario realizar más investigaciones sobre la progresión del cáncer de vejiga, recurrencia, metástasis, y la eficacia de la quimioterapia.
Los microARN (miARN) son filogenéticamente conservada pequeños ARN no codificantes que regulan negativamente dirigidos mRNA 3 'regiones no traducidas (3' UTR) en varios tipos de cáncer y se han identificado cada vez más como supresores tumorales o agentes cancerígenos [11-13]. Por otra parte, varios miRNAs se han asociado previamente con la sensibilidad de quimioterapia en varias líneas celulares de cáncer, incluyendo el cáncer de vejiga [14]. En particular, miR-101 ha sido bien establecido como un supresor de tumor con efectos inhibidores sobre la proliferación celular, la migración y la invasión. Específicamente, niveles más bajos de miR-101 se han asociado previamente con cáncer de vejiga [15], así como de próstata [16], de ovario [17], de colon [18], el hígado [19], gástrico [20], de pulmón [21], de mama [22], tiroides [23], y melanoma [24] cánceres. Con respecto al cáncer de vejiga, miARN perfiles de carcinoma de células transicionales de vejiga (TCC) muestras ha revelado que el miR-101 se downregulated en TCC, y que el miR-101 inhibe la proliferación celular y la formación de colonias en las líneas celulares de TCC a través de represión directa del EZH2 histona metiltransferasa [15]. Sin embargo, el papel de miR-101 (si los hay) en la invasión, metástasis y quimiosensibilidad de las células del cáncer de vejiga sigue siendo poco clara.
VEGF-C, un miembro de la familia de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF), es considerado como una molécula de lymphangiogenic importante y se sabe que aumenta la permeabilidad de los vasos linfáticos [25-27]. En el cáncer, el VEGF-C se correlaciona positivamente con la extensión linfática en el cáncer de vejiga, mejora la migración de células de adenocarcinoma de pulmón a los vasos linfáticos, y modula la resistencia a cisplatino en células de cáncer gástrico [28,29,38]. Aunque se conoce el cáncer de vejiga para difundir principalmente a través de los vasos linfáticos (con metástasis encuentra más comúnmente en los ganglios pélvicos regionales) [30], ningún estudio ha identificado aún una relación (si existe) entre miR-101 con VEGF-C en células de cáncer de vejiga . En el estudio actual, el miR-101 ha demostrado tener un efecto sobre la migración de células de cáncer de vejiga, la invasión y la sensibilidad cisplatino regulando directamente su objetivo funcional de VEGF-C. Estos datos sugieren que el miR-101 puede ser una diana molecular potencial para la terapia del cáncer de vejiga.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
Las líneas celulares de cáncer de vejiga T24 y 5637 como así como la herramienta de riñón 293T línea celular embrionaria humana utilizado en este estudio se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china) y se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.) y Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, EE.UU.), respectivamente, complementados con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina /estreptomicina. Todas las líneas celulares se incubaron a 37- en humidificado 5% de CO
2
Construcción del plásmido y lentivirus Preparación
Un fragmento de miR-101 se genera utilizando los siguientes cebadores:. Sentido , 5'-CGGGTACCGGTAGTCCTTCACTTCATGGGGAG-3 'y antisentido, 5'-CGGAATTCAAA- AAACCCAGCCACCTGTTTCAC-3' y se insertó en el vector GV209 con un gen reportero de la proteína fluorescente verde (GFP) dentro de los sitios AgeⅠand EcoRⅠrestriction. El mencionado plásmido miR-101, pHelper1.0 y pHelper2.0 fueron co-transfectadas en células 293T, y se obtuvo el sobrenadante enriquecido en partículas lentiviral 48 h más tarde. Una secuencia revueltos (5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '), que no tenía homología con el gen humano, se utilizó como control negativo revueltos. El VEGF-C cDNA se amplificó usando los siguientes cebadores: sentido, 5'-TCCGCTCGAGATGCACTTGCTGG- GCTTCTTC-3 'y antisentido, 5'-ATGGGGTACCGTGCTCATTTGTGGTCTTTTCC-3' y se clonó en el vector GV147 con una proteína roja fluorescente (RFP) gen informador que contiene los sitios de enzimas de restricción Kpn I. XhoⅠand no transfección se utilizó como control negativo mock (S1 datos). Todas las secuencias en los experimentos se confirmaron por secuenciación de la siguiente manera: VEGF-C siRNA, el sentido, 5'-AGAUCUGGAGGAGCAGUUAUU-3 'y antisentido, 5'-UAACUGCUCCUCCAGAUCUUU-3'; control negativo siRNA, el sentido, 5'-UACUCACUACUCGAGAUGCUU-3 'y antisentido, 5'-GCAUCUCGAGUAGUGAGUAUU-3'. Entonces, el par sintetizado de complementaria VEGF-C shRNA se colocaron en un vector pGenesil-1 (Genesil, Wuhan). células activadas por fluorescencia (FACS) (Epopeyas Altra flujo Cytosorter, Beckman, EE.UU.) se utilizó para selecto GFP o RFP + + células de acuerdo con el procedimiento recomendado por el fabricante. La eficacia de transfección de miR-101 (GFP) y VEGF-C (RFP) se calculó de la siguiente manera: la eficacia de transfección de miR-101 = GFP + recuento de células /recuento total de células x 100%, y la eficiencia de transfección de VEGF-C = células RFP + /Total contar x 100%. Sobre esta base, se encontró que las eficiencias de transfección de miR-101 (GFP) y VEGF-C (RFP) a ser del 99% y 40%, respectivamente.
Aislamiento de RNA y PCR cuantitativa
ARN total fue aislado utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. ARN aislado se midió utilizando un espectrofotómetro Nanodrop 1000 (Thermo Scientific, DE, EE.UU.) con un OD
260 OD relación /
280 mayor que 1,8 se utiliza para la síntesis de ADNc. La transcripción inversa de miR-101 y su amplificación específica se llevaron a cabo usando un equipo de miARN QRT-PCR de detección (GeneCopoeia, MD, EE.UU.). U6 se utilizó como control endógeno. la síntesis de cDNA de VEGF-C se efectúa utilizando un kit primer capítulo de síntesis de cDNA (GeneCopoeia, MD, EE.UU.), y la reacción cuantitativa en tiempo real PCR (RT-qPCR) de VEGF-C se efectúa utilizando qPCR Mix (GeneCopoeia, MD , ESTADOS UNIDOS). GAPDH se utilizó para la normalización plantilla de VEGF-C. Todos los cebadores se compraron de GeneCopeia. miR-101 y la amplificación de VEGF-C se determinaron sobre una plataforma Rotor-Gene 3000. Los valores de destino ciclo umbral PCR (Ct) se normalizaron restando la U6 o el valor Ct GAPDH, que proporciona el valor Ct. Expresión relativa se calculó usando la siguiente ecuación: relative nivel de expresión génica = 2
- (Ct grupo experimental de control de grupo-Ct)
Análisis Western Blot
tampón de lisis RIPA que contiene 1 mM. PMSF se añadió a las células en placas de seis pocillos y después se centrifugó durante 10 min a 4. El contenido total de proteína del sobrenadante se determinó por el método de Lowry. La muestra de proteína se diluyó, se calienta para la desnaturalización, y después se sometió a electroforesis en dodecilsulfato de sodio en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Después de que las proteínas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, MA, EE.UU.), 5% desnatada se aplicó polvo de leche durante 2 horas a 37-. Entonces, 1: 1.000 diluciones de conejo policlonal anticuerpo primario anti-VEGF-C (Cell Signaling Technology, MA, EE.UU.) o anti-β-actina (que sirvió como control de carga; Bioworld Technology, Inc, EE.UU.) se incubó con el durante la noche membrana. El día siguiente, la membrana se lavó en TBST tres veces y después se incubó con un anticuerpo secundario anti-conejo fluorescente durante 2 h. La membrana fue escaneado por un sistema de imagen de infrarrojos (Odyssey) y la intensidad de la banda fue detectado por Odyssey software de análisis 3.0.
VEGF-C 3'UTR tipo silvestre y mutante Tipo de construcción y Luciferase reportero de ensayo
se utilizó
análisis TargetScan para descubrir una secuencia complementaria de siete nucleótidos entre miR-101 y el VEGF-C 3'UTR. Un tipo salvaje (wt) secuencia 3'UTR VEGF-C que incluye los sitios de restricción Xba1 (5'-TCTAGAACGAACCGCCAGAAGGCTTGTGAGCCAGGATTTTCATATAGTGAAG- AAGTGTGTCGTTGTGTCCCTTCATATTGGAAAAGACCACAAATGAGCTAAGATTGTACTGTTTTCCAGTTCATCGATTTTCTATTATGGAAAACTGTGTTGCCACAGTAGAACTGTCTGTGAACAGAGAGACCCTTGTGGGTCCATGCTAACAAAGACAAATCTAGA-3′) Además de un tipo mutante (mut) secuencia de VEGF-C 3'UTR con una secuencia de miR-101 de unión completamente diferente, se sintetizaron y cada uno se clonó independientemente en GV272 vectores indicadores de luciferasa separadas (Genechem, Shanghai, China). La descrito previamente miR-101 que sobreexpresan o plásmido de secuencia revueltos junto con un plásmido de VEGF-C 3'UTR en peso o mut fueron co-transfectadas en células 293T usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, EE.UU.), creando cuatro grupos experimentales. Luego, se realizaron ensayos de luciferasa de células 293T para determinar la interacción entre las actividades de luciferasa de luciérnaga miR-101 y el peso y mut VEGF-C 3'-UTR. Renilla y se midieron a las 48 h después de la transfección utilizando el Sistema Dual-Glo Luciferase reportero de ensayo ( Promega, Madison, WI, EE.UU.) de acuerdo con los protocolos del fabricante. la relación de se registró renilla-a-luciérnaga valor de luciferasa (S1 Tabla). los experimentos se realizaron en pocillos por triplicado, y los datos representan la media de cinco experimentos independientes.
Curación de heridas Ensayo
Las células diana, incluyendo T24 y 5637 células, se transfectaron con lentivirus recombinante (1 × 10
8 unidades de transducción /ml) y polibreno (5 ug /ml) . Después de 48 h, una suspensión de células individuales se trataron con tripsina se preparó y se sembró en seis pocillos platos (5 × 10
5 /pocillo) hasta que las células alcanzaron 80% de confluencia. A continuación, 1 ml punta de pipeta estéril se utiliza para raspar una cruz en el centro (similar a una herida), se lavó con PBS tres veces, y el medio libre de suero fue reemplazado inmediatamente. Las células se dejaron migrar durante 24 h, y los arañazos fueron cuidadosamente observadas y fotografiadas. imágenes microscópicas y fluorescentes de luz fueron capturadas con un microscopio Olympus IX71. Las longitudes de brecha también se calcularon a partir las fotomicrografías. Cada línea celular se midió por triplicado.
Transwell ensayo
Una cámara Transwell (Corning Corporation, MA, EE.UU.) con 8-micras poros del filtro de membrana de poliéster, se utilizó tanto para el ensayo de invasión y ensayo de migración. La diferencia entre el ensayo de invasión y la migración de ensayo fue que la invasión de ensayo utilizado recubierto Matrigel (BD Bioscience, MD, EE.UU.) en la cámara superior, que simula las características de la matriz extracelular, mientras que el ensayo de migración no lo hizo. Un total de 2 × 10
5 células infectadas por lentivirus se sembraron en la cámara superior con 200 l de medio libre de suero. Se añadió un total de 500 l de medio que contenía FBS al 20% a la cámara inferior. Después de la incubación durante 24 h, las células que se adhieren a la superficie inferior de la membrana en la cámara superior fueron fijadas en 90% de etanol durante 10 min, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, contados en tres tomas aleatorias por microscopía, y se fotografiaron. se informó El número medio de células en los tres disparos aleatorios. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
MTS Ensayo
La suspensión de células se sembró en placas de cultivo de 96 pocillos a una densidad de 4 x 10
3 células /pocillo (0,2 ml /pocillo) durante 24 h antes de su uso. El medio de cultivo se reemplazó con medio fresco que contiene cisplatino con diferentes concentraciones de 72 h. A continuación, se añadió MTS (20 l /pocillo) a cada pocillo, y la absorbancia a 490 nm de cada pocillo se registró con un lector de microplacas universal (Bio-Rad Hercules, CA, EE.UU.) después de 3 h. curvas de tasa de dosis-inhibición se trazan de acuerdo con los valores de absorbancia. También se calculó el valor de CI50 (la concentración inhibitoria máxima de 50% de cisplatino). El ensayo se repitió por triplicado.
Análisis estadístico
Los resultados se expresan como medias ± desviaciones estándar. Todos los datos fueron analizados utilizando el software SPSS versión 21.0. Los experimentos fueron analizados estadísticamente por el estudiante de
t-test
o ANOVA de una vía.
P Hotel & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
Resultados
miR-101 inhibe el cáncer de vejiga migración celular y la invasión
Debido a los hallazgos anteriores. de una menor expresión de miR-101 en el cáncer de vejiga [15,31], se construyó un plásmido sobreexpresión de miR-101 y se envasa en vector lentiviral. células de cáncer de vejiga fueron transfectadas ya sea con un vector sobreexpresión miR-101 o de un lentivirus de secuencia codificada (control negativo revueltos), ambos de los cuales exhibe una alta eficacia de la transfección (Fig. 1A). Non-transfección se utilizó como control negativo simulado. A continuación, examinó la capacidad de la migración celular y la invasión de estas células de cáncer de vejiga. El ensayo de curación de heridas y ensayo de migración Transwell mostraron que la migración celular se inhibió significativamente por el lentivirus miR-101 que sobreexpresan (Fig. 1B, 1C). El efecto inhibidor de miR-101 en la invasión de células fue confirmada por el ensayo de invasión Transwell. Como resultado, tanto T24 y 5637 células miR-101 que sobreexpresan en la superficie inferior de la cámara superior exhibido invasividad drásticamente inhibida en comparación con sus homólogos de secuencia transfectadas revueltos (Fig. 1D).
(A) normalizaron los niveles de miR-101 de ARNm detectados por RT-qPCR. (B) El% herida abierta (campo de heridas
última
/campo de la herida
inicial ¿x 100%) a partir del ensayo de curación de la herida después de la transfección. (C) Imágenes representativas de células migradas con el número de células que migraron por campo. Nota: las células T24 tienen una mayor afinidad por el colorante cristal violenta. Por lo tanto, aunque la imagen parece mostrar más abundante tinción para las células T24, los recuentos de células T24 fueron en realidad más bajos comparados con los de 5637 células. (D) Imágenes representativas de las células invasoras que penetran en el Matrigel revestido y el número de la invasión de células por campo. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p
. & Lt; 0,01
miR-101 se dirige directamente a VEGF-C en células 293T
para evaluar el mecanismo molecular (s) de miR-101, el análisis TargetScan encontró que VEGF-C es un gen diana potencial para miR-101, ya que hay una secuencia complementaria de siete nucleótidos entre miR-101 y el VEGF-C 3 'UTR (Fig. 2A). Por lo tanto, un ensayo de indicador de luciferasa mostró que miR-101 upregulation disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa de tipo silvestre VEGF-C, pero no el mutante de VEGF-C (Fig. 2B). Entonces, RT-qPCR y transferencia Western se utilizó para evaluar el ARNm de VEGF-C y los niveles de proteína, respectivamente (Fig. 2C, 2D). miR-101 sobreexpresión de la expresión de proteínas, inhibió VEGF-C, pero no inhibió significativamente la expresión de VEGF-C ARNm en tanto T24 y 5637 células, lo que sugiere la regulación post-transcripcional de VEGF-C por el miR-101.
(A ) los posibles sitios de unión de miR-101 en las siete secuencias de pares de bases de la semilla de la región 3'UTR de VEGF-C. El tipo mutante se construyó en esta región de la semilla, como se destaca (en peso: de tipo salvaje, mut: tipo mutante). (B) la actividad luciferasa Firely /Renilla después de la transfección con el peso y mut VEGF-C 3'UTR y, o bien vector de miR-101 que sobreexpresan o un vector de la secuencia codificada. la expresión (C) VEGF-C ARNm medido por RT-qPCR en líneas celulares transfectadas que muestran diferencias significativas en la expresión de VEGF-C ARNm a través de los tres estados de transfección. (D) Análisis de transferencia Western de la expresión de VEGF-C en líneas celulares transfectadas que muestran la sobreexpresión de miR-101 suprime significativamente la expresión de la proteína VEGF-C. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **
p
. & Lt; 0,01
efectos de la invasión de VEGF-C-expresión de los rescates de miR-101
Para comprobar el papel de VEGF-C en el cáncer de vejiga líneas celulares, se realizaron experimentos de rescate (S1 Fig.). Después de las células T24 se transfectaron con el lentivirus miR-101 durante 48 h, se transfectaron transitoriamente con un plásmido sobreexpresión de VEGF-C (Fig. 3A) para investigar la recuperación de la movilidad celular. El ensayo de invasión Transwell mostró que la transfección posterior de VEGF-C se recuperó parcialmente la capacidad de invasión de las células en comparación con el control negativo VEGF-C y los grupos no transfectadas (Fig. 3B). Como era de esperar, el nivel de proteína VEGF-C fue rescatado (Fig. 3C). Por lo tanto, la inhibición de la vejiga invasión de células cancerosas por el miR-101 es probablemente una consecuencia de la disminución de la expresión de VEGF-C.
(A) Imágenes representativas de las células del cáncer de vejiga transfectadas simultáneamente con la proteína de miR-101 /verde fluorescente (MIR -101 /GFP) y VEGF-C de la proteína fluorescente /rojo (VEGF-C /RFP). (B) Imágenes representativas de las células invasoras que penetran en el Matrigel recubierto transfectadas con cualquiera de miR-101, miR-101 y VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (+)), miR-101 y un control negativo de VEGF-C (miR-101 /VEGF-C (-)), o no transfección (simulacro). (C) Análisis de transferencia Western validación de expresión de la proteína VEGF-C en las líneas celulares transfectadas.
La sobreexpresión de miR-101 y VEGF-C Derribo Independientemente aumentar la sensibilidad de la célula a la vejiga cisplatino
MIR -101 sobreexpresión aumenta la sensibilidad de ambos T24 y 5637 células al cisplatino, con el valor IC50 pasando de 4,06 ± 0,69 mg /l a 9,17 ± 1,24 mg /l y de 2,96 ± 0,46 mg /l a 5,56 ± 0,36 mg /l, respectivamente (Fig. 4A, 4B). Con el fin de determinar la función de VEGF-C en la sensibilidad a cisplatino, un plásmido interferencia VEGF-C se construyó y se transfectó en las líneas celulares de cáncer de vejiga (Fig. 5A). La sensibilidad de T24 y 5637 células al cisplatino aumentó después de la interferencia VEGF-C, con el valor IC50 pasando de 2,56 ± 0,31 mg /l a 8,23 ± 0,83 mg /l y de 3,01 ± 0,5 5 mg /l a 5,42 x 0,52 mg /l , respectivamente (Fig. 5B, 5C). Estos resultados sugieren que el VEGF-C regulación a la baja, ya que el objetivo aguas abajo de miR-101, mejora la sensibilidad de las células del cáncer de vejiga a cisplatino
.
(A) Los gráficos de curvas de tipos de inhibición dosis de cisplatino medir el recuento de células después de la transfección con cualquiera miR-101 que sobreexpresan o lentivirus secuencia codificada. valores (B) IC50 redujo significativamente tras la sobreexpresión de miR-101. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **
p
. & Lt; 0,01
(A) Análisis de transferencia Western de la expresión de VEGF-C en líneas celulares transfectadas con VEGF-C o el control shRNA shRNA. (B) Los gráficos de las curvas de tipos de dosis de inhibición para contar las células de medición cisplatino después de la transfección con VEGF-C o el control shRNA shRNA. (C) IC50 valor redujo significativamente después de VEGF-C desmontables. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. **
p
. & Lt; 0,01
inducida por el miR-101 de VEGF-C-expresión de los rescates cisplatino sensibilidad
Después de las células T24 se transfectaron con el miR-101 lentivirus durante 48 h, luego fueron transfectadas transitoriamente con un plásmido de VEGF-C sobreexpresión, un plásmido de control VEGF-C, o un plásmido VEGF-C shRNA. Se encontró que la sobreexpresión de VEGF-C se recuperó parcialmente sensibilidad de las células del cáncer de vejiga en comparación con el cisplatino el control VEGF-C con valores de IC50 of10.05 ± 1,05 mg /l y 3,14 ± 1,02 mg /l a 0,63 ± 0,16 mg /l, respectivamente (Fig . 6A, 6B). Por otra parte, shVEGF-C más significativamente mayor sensibilidad de las células del cáncer de vejiga a cisplatino en comparación con el control de VEGF-C (Fig. 6A, 6B).
(A) Los gráficos de curvas de tipos de inhibición dosis para la medición de cisplatino recuentos de células después de la transfección con cualquiera de miR-101 y VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (+)), miR-101 y un control negativo de VEGF-C (MIR-101 /VEGF-C (-)), o miR 101 y VEGF-C shRNA (miR-101 /shVEGF-C). (B) El valor de IC50 se incrementó significativamente después de la transfección con el miR-101 /VEGF-C (+).
Discusión
Nuevas evidencias muestran que el miR-101 expresión se pierde en tejidos de cáncer de vejiga y líneas celulares de cáncer de vejiga [15,31]. El eje NDY1 /KDM2B-miR-101-EZH2 ha sido identificado como activo en las células de cáncer de vejiga [32], en el que miR-101 suprime la motilidad de las células de cáncer de vejiga T24 por la orientación de c-Met 3'-UTR [33]. Sin embargo, el mecanismo molecular detallado (s) del papel de miR-101 en células de cáncer de vejiga que queda por esclarecer. Por lo tanto, mediante la utilización de un enfoque basado en bioinformático TargetScan para buscar potenciales miR-101 objetivos, hemos identificado VEGF-C como un potencial objetivo miR-101. Entonces construyó un lentivirus de miR-101 que sobreexpresan para la transfección en el 5637 las líneas celulares de cáncer de vejiga T24 y y demostramos que la sobreexpresión de miR-101 inhibe la migración celular y la invasión del cáncer de vejiga. Por otra parte, hemos demostrado que el miR-101 regula negativamente la expresión de la proteína VEGF-C y VEGF-C sobreexpresión rescata a los efectos de la sobreexpresión de miR-101, lo que sugiere que el miR-101 regula negativamente la expresión de VEGF-C post-transcripcional. Por último, puso de manifiesto que tanto el miR-101 y la interferencia de VEGF-C aumentó de forma independiente citotoxicidad cisplatino en las células del cáncer de vejiga, y VEGF-C también rescatamos efecto de miR-101 en la sensibilidad de las células del cáncer de vejiga con el cisplatino.
La producción y secreción de estimuladores VEGF-potentes de la angiogénesis que afectan a la proliferación celular endotelial y la motilidad, así como la permeabilidad ha vascular ha observado comúnmente en varios tipos de tumores agresivo e influye significativamente el pronóstico de los pacientes con cáncer [28], aunque VEGF-C se ha demostrado que tener efectos angiogénicos en las células endoteliales [34], VEGF-C actúa principalmente linfática a través de la KDR /VEGFR-2 tirosina quinasas receptor Flt4 /VEGFR-3 y [35], que se expresa exclusivamente en el endotelio linfático y alta endotelio venular de la linfa linfáticos en los tejidos adultos normales. Por ejemplo, VEGF-C sobreexpresión se ha demostrado que producen la proliferación endotelial linfático y la hiperplasia selectiva de la vasculatura linfática [36].
Con respecto al papel de VEGF-C en la malignidad, se detectó inicialmente la expresión de VEGF-C ARNm en un conjunto mixto de tumores sólidos humanos con el papel de VEGF-C en la LI proporcionar un posible mecanismo para la metástasis a través de los vasos linfáticos recién formados [37]. Estudios posteriores descubrieron que el receptor principal de VEGF-C Flt4 /VEGFR-3 se expresa en una variedad de tumores malignos humanos, incluyendo de pulmón, colorrectal, próstata y carcinomas de células escamosas de la cabeza y el cuello, así como el sarcoma de Kaposi [28]. Por otra parte, las correlaciones positivas se han encontrado entre la expresión de VEGF-C y diseminación linfática en CCT de vejiga [38], así como en la próstata [39], de colon [40], gástrico [41], de la tiroides [42], y de neuroblastoma tipos de cáncer [43 ]. VEGF-C regulación a la baja reduce el cáncer de pulmón y de colon metástasis murinos, y Flt4 /VEGFR-3 de inhibición se ha asociado con la reducción de las actividades de la angiogénesis /lymphangiogenic, así como la reducción del crecimiento y la metástasis de mama, páncreas y ovario, allanando el camino para el desarrollo y el ensayo de VEGFR3 como inhibidores quimioterapéuticos dirigidos [44]. Aquí, miR-101 sobreexpresión reprimida expresión de la proteína VEGF-C, impidiendo la migración de células de cáncer de vejiga y la invasión
in vitro
en ausencia de linfangiogénesis. Estos hallazgos sugieren que el VEGF-C actúa a través de mecanismo (s) no lymphangiogenic en la promoción de la progresión del tumor de vejiga. Se necesitan investigaciones adicionales para determinar la affector (s) aguas abajo de la /VEGFR-3 ejes VEGF-C-Flt4 en células de cáncer de vejiga que promueven la movilidad celular de cáncer de vejiga.
El cisplatino quimioterapia sigue siendo el tratamiento de primera línea para cáncer de vejiga localmente avanzado, por lo que la resistencia a cisplatino es un problema clínico importante para los pacientes con cáncer de vejiga [45]. Aunque no encontramos trabajo previo investigar el papel de miR-101 en la resistencia a cisplatino en las células del cáncer de vejiga, miR-101 expresión se ha demostrado que se downregulated en líneas celulares de cisplatino docetaxel inducida por la cabeza resistencia cruzada y el carcinoma de células escamosas del cuello [46], mientras miR-101 se ha demostrado que la sinergia con cisplatino, doxorrubicina y fluorouracilo en la inducción de apoptosis en células de carcinoma hepatocelular [47,48]. Como antagonista de miR-101, VEGF-C promueve la resistencia a cisplatino en las células de cáncer gástrico [29], y VEGF-C da la sobrerregulación en la resistencia del tumor a la terapia anti-VEGF en un modelo murino de cáncer de pulmón [49]. De acuerdo con estos resultados anteriores, aquí tanto miR-101 y la interferencia VEGF-C se muestran para mejorar de forma independiente citotoxicidad cisplatino en células de cáncer de vejiga, y VEGF-C también rescatados efecto de miR-101 en sensibilidad de las células del cáncer de vejiga con el cisplatino. Sin embargo, aún se desconoce el mecanismo (s) subyacente en el papel de VEGF-C en la resistencia a cisplatino de las células de cáncer de vejiga y requiere un estudio adicional.
Hay dos limitaciones en este estudio. En primer lugar, este estudio muestra que VEGF-C juega un papel clave en la migración de células del cáncer de vejiga, la invasión y la quimiosensibilidad cisplatino y es un objetivo directo de miR-101. Sin embargo, este hecho no excluye la posibilidad de que el miR-101 tiene otros objetivos que tienen funciones celulares similares a VEGF-C. Utilizando la base de datos TargetScan, encontramos 803 transcripciones que se prevé están siendo blanco de hsa-miR-101, incluyendo EZH2, BTBD3, NLK, y MITF. Se necesitan más estudios para determinar si estos 803 supuestos objetivos son los objetivos reales de miR-101 y si alguna de estas proteínas diana se asocian con el cáncer de vejiga migración celular, invasión y quimiosensibilidad cisplatino. En segundo lugar, el trabajo previo ha demostrado que el miR-101 se downregulated en TCC y que el miR-101 inhibe la proliferación celular y la formación de colonias de TCC a través de represión directa de la histona metiltransferasa EZH2 [15]. Por lo tanto, en este estudio, no se evaluó los efectos de miR-101 sobre la proliferación de células de cáncer de vejiga sino que se centró específicamente en la influencia de miR-101 en la migración celular y la invasión del cáncer de vejiga a través de VEGF-C. Por lo tanto, si el eje de miR-101-VEGF-C afecta a la proliferación de células de cáncer de vejiga sigue siendo una pregunta abierta. En tercer lugar, la eficiencia de transfección de miR-101 lentivirus fue del 99%, pero la eficacia de transfección del plásmido de VEGF-C era sólo el 40%; debido a problemas técnicos fotográficos, se asumió que todas las células eran células de miR-101 + (GFP +) y por lo tanto seleccionados por FACS únicamente sobre la base de VEGF-C + (RFP +). En resumen, el VEGF-C + (RFP +) las células fueron consideradas células doble positivas. Debido a esta limitación técnica, era difícil de evaluar adecuadamente la co-localización de miR-101 y VEGF-C ARNm.
En resumen, hemos demostrado miR-101 post-transcripcionalmente suprime la expresión de VEGF-C, inhibe la vejiga migración de las células del cáncer y la invasión, y aumenta la sensibilidad a cisplatino. Aunque se necesita más investigación para identificar otros objetivos pertinentes de miR-101, este estudio proporciona nueva información sobre el papel de miR-101 en el cáncer de vejiga y muestra la promesa de miR-101 como un objetivo molecular potencial para el cáncer de vejiga.
Apoyo información
S1 de datos. La construcción de miR-101-sobreexpresión plásmido y VEGF-C-sobreexpresión plásmido
doi: 10.1371 /journal.pone.0117809.s001 gratis (DOC)
S1 Fig. Imagen representativa de las células del cáncer de vejiga T24 Simultáneamente transfectadas con el miR-101 /proteína fluorescente (miR-101 /GFP) y VEGF-C /proteína roja fluorescente verde (VEGF-C /RFP)
doi: 10.1371 /journal.pone. 0117809.s002 gratis (TIF)
S1 tabla. Firely /Renilla luciferasa Los análisis de la transfección con el peso y mut VEGF-C y 3'UTR Vector De cualquier miR-101 que sobreexpresan o una secuencia de vectores revueltos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0117809.s003
(XLSX)