Extracto
Antecedentes
Los microARN (miRNA) son cortos no codificante monocatenario ARN que suprimen la expresión de genes a través de ya sea la represión de traducción o degradación de ARNm diana. El recocido entre los ARN mensajeros y región 5 'de semillas de miRNAs se cree que es esencial para la supresión específica de la expresión del gen diana. Una miARN puede tener varios cientos de dianas diferentes en una célula. la evidencia acumulada sugiere que rápidamente muchos miRNAs están involucrados en la regulación del ciclo celular y en consecuencia juegan un papel crítico en la carcinogénesis.
Metodología /Principales conclusiones de crecimiento
Introducción de origen sintético miR-107 o miR-185 suprime de las no pequeñas líneas celulares de cáncer de pulmón de células humanas. Citometría de flujo El análisis reveló estos miRNAs inducen una detención del ciclo celular G1 en células H1299 y la supresión de la progresión del ciclo celular es más fuerte que la de Let-7 miARN. Por la expresión génica análisis con microarrays de ADN, nos encontramos con cientos de genes se ven afectados por la transfección de estos miRNAs. El uso de la predicción miRNA-meta análisis y la matriz de datos, nos aparece un conjunto de posibles objetivos de miR-107 y miR-185 para la detención del ciclo celular G1 y validar un subconjunto de ellos utilizando en tiempo real de RT-PCR e inmunotransferencia para CDK6.
Conclusiones /Importancia
Se identificaron nueva regulación del ciclo celular miRNAs, miR-107 y miR-185, localizada en regiones cromosómicas alteradas con frecuencia en los cánceres de pulmón humanos. Especialmente para el miR-107, un gran número de reguladas por los genes están anotados con el término ontología de genes 'ciclo celular'. Nuestros resultados sugieren que estos miRNAs pueden contribuir a regular el ciclo celular en tumores malignos humanos
Visto:. Takahashi Y, Forrest ARR, Maeno E, T Hashimoto, Daub CO, Yasuda J (2009) miR-107 y miR -185 puede inducir la detención del ciclo celular en no humano del cáncer de pulmón de células pequeñas líneas celulares. PLoS ONE 4 (8): e6677. doi: 10.1371 /journal.pone.0006677
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Junio, 2009; Aceptado: 17 Julio 2009; Publicado: 18 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Takahashi et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo la investigación fue apoyada por Grant por RIKEN Centro de Ciencias de la ómicas MEXT a Yoshihide Hayashizaki, Grant para el Sistema de investigación RIKEN Frontier, programa de investigación ARN funcional a YH y Grant-en-Ayudas a la Investigación Científica a J.Y. ARRF es apoyado por una beca de CJ Martin Del australiana NHMRC (ID 428261). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
miRNAs son de 19 a 23 bases de longitud ARN de cadena simple que desempeñan papeles cruciales en los procesos biológicos [1]. Las secuencias de nucleótidos de miRNAs a menudo se conservan evolutivamente entre los organismos multicelulares [2]. Los miRNAs se expresan como en forma de horquilla doble hebra pre-miRNAs y procesamiento secuencial por diferentes enzimas RNasa III, Drosha y Dicer, genera miARN maduro [3] .El madura miARN se une con un conjunto de proteínas, incluyendo Agonaute, para formar un miARN inducida silenciar complejo (miRISC). El miRISC se cree para hacer un complejo con ARN mensajeros de destino y post-transcripcionalmente suprime la expresión de los genes diana. El mecanismo de acción de miRISC sigue siendo controvertido [4], sin embargo, existe un consenso general de que la mayoría de los ARN mensajeros de destino tienen sitios de unión para los miRNAs en las regiones 3 'no traducidas. Del segundo al octavo bases de la secuencia 5 'finales de los genes miARN se denomina secuencia de semillas y se cree que es esencial para el reconocimiento de los ARN mensajeros objetivo de miRNAs.
Se ha hecho evidente que algunos miRNAs juegan un papel crítico en la regulación del ciclo celular en cooperación con los oncogenes o genes supresores de tumores (ver revisión [5], [6]). Un ejemplo de la regulación del ciclo celular miARN es el
let-7 gratis (para
hsa-let-7a
, MIMAT0000062). La introducción de sintético pre-let-7 hace que la detención del ciclo celular en células de cáncer de pulmón [7]. Muchos miRNAs son conocidos para regular a la baja los genes relacionados con el ciclo celular. El grupo de miR-17~92 fue identificado como el de aguas abajo de la
MYC
oncogén [8] y regular a la baja factores de transcripción E2F que son mediadores conocidos de la progresión del ciclo celular [9] .Otro gen importante relacionado tumor,
TP53
, induce la expresión de miembros de la familia miR-34 y la sobreexpresión de miR-34 provocó la detención del ciclo celular en la fase G1 [10] - [16]
Aquí mostramos. potencial de la regulación del ciclo celular miRNAs durante la búsqueda de miRNAs relacionados con el cáncer en las células de cáncer de pulmón. En este estudio vamos a retomar un conjunto de regiones genómicas identificadas por Zhao
et al
. que se amplifican o suprimen los cánceres de pulmón en humanos [17]. Durante el estudio, se encontró que los
miR-107 gratis (MIMAT0000104) y
miR-185 gratis (MIMAT0000455) suprimir la proliferación en las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón e inducir la detención del ciclo celular en la fase G1 del ciclo celular. Hemos tratado de caracterizar los ARN mensajeros abajo objetivo de estos miRNAs mediante el uso de microarrays de perfiles con la ontología de genes análisis y predicciones TargetScan [18].
Resultados
La expresión de miR-31, 107, y 185 en la colección de tejidos humanos incluyendo las líneas de tejido de cáncer de pulmón y de células
a partir de las regiones identificadas por Zhao
et al
. [17], encontramos 13 y 26 miRNAs anotados en las regiones homocigótica eliminados y amplificados respectivamente (Tabla S1). Debido a que muchos de los genes relacionados con el cáncer contribuyen a la transformación maligna en el amplio espectro de tipos de células, priorizamos miRNAs que han sido implicados en otros cánceres humanos del adulto. A continuación, elegimos tres miRNAs: miR-107, miR-185, miR-31 y (MIMAT0000089) [19] - [22]. Añadimos el let-7a para el crecimiento celular y el control del ciclo celular debido a que el miARN puede suprimir el crecimiento celular en las líneas celulares de cáncer de pulmón [23] e inducir la detención del ciclo celular en la línea celular HepG2 [7].
Uso Taq-Man cuantitativa tecnología de RT-PCR, que mide la expresión de los cuatro miRNAs en el cáncer de pulmón de células A549 líneas humana y H1299 y a través de un panel de ARN disponible comercialmente a partir de muestras normales de tejido de cáncer de pulmón y (Fig. 1). La mayoría de los miRNAs mostraron expresión relativamente omnipresente entre los tejidos sanos (Fig. 1). Es interesante que la expresión de los miRNAs analizados (miR-107, 185, y let-7a) fueron más bajos en las líneas tumorales de pulmón y cáncer de pulmón de células que en pulmón normal. El miR-31 fue altamente expresado en las líneas celulares de cáncer de pulmón.
niveles de expresión de genes miARN se midieron por miRNA TaqMan qRT-PCR en pulmón normal, el cerebro, la hipófisis, el hígado y los tejidos de ovario, una muestra de tumor de pulmón y también en las líneas celulares de tumor de pulmón, H1299 y A549. El eje vertical indica la expresión relativa de cada miARN normalizada con la de RNU44.
Supresión del crecimiento y la detención del ciclo celular por la sobre expresión de miRNAs candidatos en líneas celulares de cáncer de pulmón humano
El efecto de estos miRNAs sobre la proliferación se ensayó mediante el ensayo MTT con células H1299 y A549 pre-miARN transfectadas. La transfección de hsa-miR-107 y hsa-miR-185 reduce drásticamente la proliferación celular en ambas líneas celulares (Fig. 2). En el caso de las células H1299, los miARN let-7a mostraron una reducción significativamente la proliferación mientras que los efectos eran menos evidentes en las células A549. El grado de supresión del crecimiento de A549 por let-7a es similar a la de reportado [7]. El miR-31 mostró una ligera supresión del crecimiento celular, pero los niveles de supresión no fueron estadísticamente significativos en muchos puntos de tiempo para las dos células (Fig. 2).
Crecimiento efecto de supresión de miARN transfecciones candidatos sobre H1299 (izquierda panel) y A549 (panel derecho) como se mide por el ensayo de MTT. El eje vertical indica la proporción relativa de la A450 nm: la del día 0 de cada célula como 1. Nota de miR-107 y miR-185 suprime la proliferación en ambas líneas celulares
contenido de ADN por análisis. fluir transfección citometría de revelado de hsa-miR-107 y hsa-miR-185 indujo un aumento significativo en el porcentaje de células en la fase G1 del ciclo celular, a niveles similares como control let-7a, mientras que un control negativo revueltos no lo hizo (Fig. 3). No se observó tampoco ningún incremento aparente de la población sub-G1 en la citometría de flujo o cualquier cambios morfológicos relacionados con la apoptosis, tales como formación de ampollas en nuclear y la condensación, con el microscopio de contraste de fase (datos no mostrados). Esto sugiere que la supresión del crecimiento inducida por hsa-miR-107 y transfección hsa-miR-185 fue causado por la inducción de la detención en G1 lugar de la apoptosis.
Los histogramas de contenido de ADN obtenidos mediante análisis FACS se muestran. Los porcentajes de cada etapa del ciclo celular se muestran en la inserción de los histogramas. No había ninguna puerta se aplica a los eventos para que no hubo acumulación evidente de las poblaciones sub-G1 en todos los experimentos.
Identificación de los ARNm diana candidatas de los miRNAs mediante el análisis de genes de perfiles
El microarrays de perfiles se hizo para determinar los cambios globales en los niveles de expresión de mRNA en células H1299 transfectadas con miRNAs supresores de crecimiento en comparación con un control negativo. En el hsa-miR-107, miR-HSA-185 y dejar 7a hsa-células transfectadas había 561, 646 y 812 transcripciones abajo-regulada y 608, 698 y 949 regulados positivamente en 1,5 veces o más, respectivamente. Gene Ontología análisis se llevó a cabo en los genes regulados en los transfectans. La tabla 1 recoge los términos de GO enriquecido significativamente mayor para las reguladas por los genes miARN con cada uno. Los cinco primeros términos de genes regulados por hsa-miR-107 estaban todos relacionados con el ciclo celular (tabla 1). Abajo de los genes regulados con el let-7a eran principalmente involucrados en el metabolismo de ARNr, la biogénesis de ribosomas, y la fase M del ciclo celular. Por último, las reguladas por los genes con hsa-miR-185 no mostraron enriquecimiento de términos relacionados con el ciclo celular, en lugar de los términos relacionados con el desarrollo y la diferenciación eran prominentes. Además los 127 y 33 genes comúnmente abajo regulados y regulados positivamente, respectivamente, por ambos miRNAs no mostraron enriquecimientos ontología de genes, lo que sugiere que estos miRNAs inducen la detención del ciclo celular con diferentes vías de señalización (tablas 2, 3 y datos no mostrados).
Se compararon las predicciones de los genes miARN objetivo con el software TargetScan [18] para estos miRNAs a los genes regulados en nuestra expresión de perfiles de datos. Para ambos sitios conservados y no conservado, encontramos la mediana del cambio pliegue de objetivos previsto fue consistentemente más baja que la de todos los genes detectados en las matrices (Fig. 4). Hay una tendencia para los objetivos más fuertemente prevé están más abajo-regulados que los objetivos previsto débiles. Del mismo modo, los objetivos conservadas tienden a ser más predicciones abajo reguladas que todos los objetivos previstos (Fig. 4).
Objetivo del análisis se extrajeron de miRNAs 185, 107 y let7a. señal mediana de expresión se muestra sólo para genes considerados como detectado por el software Agilent. Eje Y indica la mediana del cambio veces para conjuntos de genes diana predichos microARN en diferentes umbrales, en comparación con todos los genes en el microarray (en negro). En todos los casos la señal mediana de objetivos previsto es inferior a la observada si se utilizan todas las sondas. Cuando el experimento se extendió a tres días, se observa un efecto menor, lo que sugiere blancos directos se ven más afectados en el primer día.
A continuación, alcanzaran estos objetivos previsto en los ordenadores para los genes abajo regulados de más de 0,75 veces en el nivel de ARN para reducir los posibles objetivos de estos miRNAs. Encontramos muchos de estos objetivos potenciales fueron anotados con los términos "ciclo celular" en las anotaciones Entrez Gene (tabla 2) lo que sugiere que estas tres miRNAs pueden regular directamente la progresión del ciclo celular a través de estos genes. Curiosamente, en nuestro lado, el 7 let-no suprimió la expresión de la CDK6 (NM_001145306) ARNm, que se suprimió por la sobreexpresión de let-7 en el estudio anterior [7]. La Tabla 3 indica que grupos distintos de los oncogenes conocidos están regulados a la baja por estos miRNAs.
A partir de estas listas y otra lista de candidatos que describen los genes miARN objetivos anotado con el ciclo celular términos, cáncer de pulmón, oncogén o supresor de tumores en las anotaciones Entrez Gene ( S2 tabla), se optó por un subconjunto de las transcripciones para la validación de QRT-PCR mediante la comparación con las listas de objetivos proporcionados por TargetScan [18] y PicTar [24] software (Fig. 5A). Para el miR-107, confirmamos ARNm baja regulación de
CCNE1 gratis (NM_001238),
CDK6
,
CDCA4 gratis (NM_017955.3),
RAB1B
(NM_030981.2) y
CRKL gratis (NM_005207.3), y para el miR-185, que confirmó la baja regulación de
CCNE1
,
CDK6
,
AKT1 gratis (NM_001014431.1),
HMGA2 gratis (NM_003483.4) y
CORO2B gratis (NM_006091.3) (Fig. 5B). Observamos que tanto el miR-107 y miR-185 transfección causaron baja regulación de la ciclina E1 (CCNE1) y ciclina quinasa dependiente de 6 niveles (CDK6) de ARNm, aunque el nivel de supresión de CDK6 por el miR-185 es modesta (Fig. 5B). a continuación, nos confirmó mediante transferencia que los niveles de proteína CDK6 son también las reguladas por el miR-107, mientras que la expresión CDK6 era relativamente sin cambios por el miR-185 (Fig. 5C) occidental. Debido a que el nivel de supresión de la expresión de ARNm CDK6 por el miR-185 es muy modesta, la posterior disminución de la expresión de proteínas CDK6 en el punto de observación (24 horas después de la transfección) el tiempo puede ser demasiado pequeño para ser observado las Immunoblottings convencionales.
coincide A) Representante secuencia de nucleótidos entre los posibles genes diana y miRNAs. Los números entre paréntesis indican las posiciones de nucleótidos de destino desde el codón de parada. Sólo nucleótidos emparejados con secuencias de genes miARN semillas se indican con las líneas verticales. B) Los análisis de RT-PCR cuantitativa de los posibles objetivos de miR-107 (CCNE1, CDK6, CDCA4, RAB1B y CRKL) y miR-185 (CCNE1, CDK6, AKT1, HMGA2, CORO2B) se muestran. El eje vertical indica la relación de la expresión relativa de cada gen se normalizó con la de GAPDH. C) Transferencia Western que muestra la baja regulación de la proteína CDK6 por el miR-107.
Discusión
Nos pasó a encontrar que el miR-107 y miR-185 pueden suprimir la proliferación celular en dos líneas y celulares de cáncer pulmonar inducida una detención en G1 del ciclo celular. El grado de supresión del crecimiento por estos miRNAs es similar a la por el supresor tumoral miRNA, let-7. perfiles de expresión génica análisis con la transfección de estos miRNAs indicó que sólo el miR-107 mostró un enriquecimiento significativo de los reguladores del ciclo celular para los efectores corriente abajo. Por otro lado, miR-185 no reprimió significativamente regulador del ciclo celular, así como let-7, un ciclo celular conocida la regulación de los genes miARN [6]. El miR-185, sin embargo, podría suprimir la expresión de mRNA de los genes que regulan el ciclo celular como CDK6 y AKT1.
Los conjuntos de genes regulados comúnmente por todos los miRNAs supresores tres de crecimiento no son tantos y no tan fuertemente relacionada con la regulación del ciclo celular (Tabla 2). Estos resultados sugieren que los tres miRNAs regulan distintas vías de señalización celular. Desde miRNA tiene una amplia gama de objetivos en una célula (es decir, menos específico) y puesto que el grado de supresión de la expresión diana por miRNA es generalmente moderada, la función de miRNAs debe ser considerado como el "ajuste fino" de la expresión génica en mamíferos las células [25]. La acumulación de estos pequeños efectos reguladores puede causar las reacciones biológicas importantes en las células [5] .Por otra parte, algunas moléculas diana potenciales, tales como CCNE1 y CDK6 pueden ser críticos para la regulación del ciclo celular por estos miRNAs. Por ejemplo, la reducción de CCNE1 con siRNA provoca la detención del ciclo celular en líneas celulares de cáncer de hígado [26]. En el caso de CDK6, la reducción de CDK6 por siRNA causado S-fase prolongada en las células madre de embriones humanos [27]. En general, la importancia de los genes miARN en la regulación del ciclo celular es bastante razonable porque miRNAs se supone que son moléculas clave para la inducción de la diferenciación celular, que acompaña con la detención del ciclo celular en muchos casos.
En términos de miR-107 , otra evidencia apoya un papel de este miARN en la detención de G1 y la supresión del crecimiento. miR-107 acciones 7 de las 8 bases de su secuencia de semillas con la familia miR-16 de miRNAs, que inducen la detención de G1 orientar varias ciclinas y reguladores del ciclo celular, incluyendo CDK6, que nos confirmó como un objetivo de miR-107 [28]. Por otra parte, un estudio anterior encontró que los inhibidores sintéticos para aumentar el miR-107 proliferación de células A549, pero no afectan a las células HeLa [29] lo que sugiere el miR-107 en verdad pueden desempeñar un papel específico de pulmón en la reducción de la proliferación. sobreexpresiones Curiosamente, el miR-107 mostró en los cánceres de páncreas que sugieren este miARN tiene algún papel positivo en la carcinogénesis pancreática [21]. Por otra parte, durante la preparación de este manuscrito, Lee et al. informaron que desmetilación y la desacetilación tratamientos a líneas celulares de cáncer de páncreas humano indujo la sobreexpresión de miR-107 y la sobreexpresión de miR-107 de crecimiento de células suprimido y la expresión de la CDK6 en las líneas celulares de cáncer de páncreas humanos [30]. El último estudio es compatible con nuestros datos en términos de CDK6 como un blanco de abajo candidato de miR-107. Es interesante si este miARN tenía ningún funciones celulares específicos en las células que en la regulación del ciclo celular. Safdar
et al
. sugirió que el miR-107 ha sido inducida en ratones ejercidas cuádriceps músculos [31]. De acuerdo con la revisión efectuada por Wilfred et al., El miR-107 y su paralog, miR-103, pueden funcionar en la regulación del metabolismo celular [32]. Puede ser interesante posibilidad de que estos miRNAs regulan las funciones celulares fundamentales, tales como el metabolismo o la progresión del ciclo celular en lugar de la especificación de la diferenciación celular
.
El mecanismo de la detención del ciclo celular por el miR-185 no está claro. El número de reguladores del ciclo celular en los genes reprimidos aguas abajo es mucho menor por el miR-185 que por el miR-107. Un grupo de científicos sugirió que este miARN se sobreexpresa en el cáncer de vejiga [20]. En el otro papel, Choong informado de que miR-185 tiene fuerte correlación positiva a la aparición de antígenos de superficie eritroide (CD71, CD36, y CD235a) en las células de sangre de cordón umbilical humano estimuladas con factores de crecimiento y diferenciación inducida eritroides [33]. Hablando en general, la inducción de la diferenciación de las células por lo general se acopla con la supresión de la progresión del ciclo celular. Teniendo en cuenta las funciones de los genes miARN en otros metazoos, muchos de los miRNAs inducible con la diferenciación de células podría tener algunas funciones de supresión del ciclo celular. El miRNA debe tener otras funciones biológicas en diferentes tipos de células. Por tanto, es interesante investigar si el miR-185 tiene todas las funciones de diferenciación en células de cáncer de pulmón. Otra cuestión importante es que miR-185 mostró funciones de crecimiento supresores (Figuras 2, 3) y disminución de la expresión en células de cáncer de pulmón (figura 1) a pesar de que el miARN se localiza en una región cromosómica amplificado en líneas celulares de cáncer de dos pulmonares ([17 ] y el cuadro complementario S1). Estos resultados son contra-intuitivo. Es posible, sin embargo, que los supresores de tumores pueden ser localizados en una amplificación cromosómica región que muestra en las células tumorales. Un ejemplo es un gen supresor tumoral potencial,
GSDMA gratis (NM_178171.4) [34], está localizado en una región cromosómica amplificado en células de cáncer gástrico [35]. Este gen es downregulated en los cánceres gástricos humanos, aunque el gen mostró amplificación en células tumorales [35]. En el caso de la miR-185, silenciamiento epigenético de la miARN podría ocurrir antes de la amplificación del gen de la región del cromosoma 22q21.1. La investigación adicional debe, obviamente, para hacer frente a estas cuestiones a fondo.
Por último, informamos que los nuevos candidatos miRNAs que pueden regular la progresión del ciclo celular en líneas celulares de cáncer de pulmón de células no pequeñas humanas. Sigue siendo una pregunta abierta que si alguno de alteraciones genéticas somáticas pueden causar la supresión de estos miRNAs en el cáncer de pulmón humano o cualquier otro tipo de tumores malignos. Además de la caracterización de los loci del genoma de estos miRNAs es necesario hacer que la cuestión clara.
Métodos
Extracción de la posición miARN
anotado miARN loci fueron extraídos de las regiones de ganancia cromosómica y la pérdida identificado por Zhao
et al
. [17] en un gran grupo de los carcinomas de pulmón humano utilizando conjuntos de SNP. Los HG16 coordenadas se convirtieron a su HG18 usando equivalentes utilizando la herramienta UCSC Ascensor-Over (http://genome.ucsc.edu).
Las líneas celulares
líneas celulares de cáncer de pulmón humano , H1299 y A549, se compraron de ATCC. Las líneas celulares se cultivaron en DMEM que contenía suero fetal inactivado por calor al 10% bovino, 100 g /ml de penicilina /estreptomicina y 292 mg /ml de L-glutamina (Invitrogen, Carlesbad, CA, EE.UU.).
preparaciones de ARN y cuantificación de ARN utilizando PCR en tiempo real
Todo el tiempo real PCR se realizó con el sistema de PCR en tiempo real StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) por cuadruplicado. ARN total fue extraído a partir de células H1299 y A549 con el
mir
kit de aislamiento de Vana miARN (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). ARN totales de los tejidos humanos se adquirieron de BioChain Institute, Inc. (Hayward, CA, EE.UU., números de catálogo: R1234152-50, R1235152-50, R1234035-50, R1234068-10, R1234149-50, R1234183-50). Para la cuantificación de miRNAs, 100 ng de ARN total se analizó con el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa (RT) (Applied Biosystems) con RNU44 como control de carga. Para la cuantificación de ARNm, 500 ng de ARN total fue inverso-transcrito utilizando la PrimeScript II RT enzima (Takara Bio, Inc., Shiga, Japón) y se realizó la PCR con SYBR premezcla Ex Taq (Perfect Tiempo real: Takara Bio, Inc. ) con GAPDH como control de carga. Todo el análisis de PCR en tiempo real se realizaron por triplicado.
miARN transfección
Sintético pre-miRNAs y el control negativo no específica (miRIDIAN microARN Mimic Control Negativo#1) se adquirieron de Dharmacon, Inc. (Lafayette, CO, EE.UU.). Los pre-miRNAs se transfectaron a una concentración final de 10 nM con Lipofectamine2000 (Invitrogen), y medio cambiaron 24 horas después de la transfección.
El crecimiento celular medición
Las células se sembraron en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora. La viabilidad celular se evaluó mediante el ensayo MTT utilizando el recuento de células kit-8 (DOJINDO, Kumamoto, Japón), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Después de 1 hora de incubación con los medios que contienen compuesto de tetrazolio, se detectó la absorbancia a 450 nm durante 0,1 segundos con Arvo MX 1420 (Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.).
Análisis del ciclo celular
Las células se recogieron después de 72 horas y se fijaron en 70% etanol enfriado con hielo, seguida de tratamiento con ARNasa a, se tiñeron con 50 g /ml de yoduro de propidio para el análisis de contenido de ADN por citometría de flujo análisis en un sistema de FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin, NJ, EE.UU.). Los datos fueron recogidos y procesados con el software de análisis de FACS FlowJo (Árbol Star, Inc., Ashland, Oregón, EE.UU.).
De perfiles de expresión utilizando gama de expresión génica de Agilent
La sonda de cRNA se generó a partir de ARN total (500 ng) con el ARN de entrada baja amplificación lineal & amp; kit de marcaje (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU.). Cy3 marcado cRNA (1,65 g) fue luego fragmentado y expresión relativa se midió mediante hibridación a todo 4 × 44K microarrays oligo humana (Agilent). Extracción de características ver. 9.1 software (Agilent) se utilizó para analizar la imagen de microarrays. Los análisis de microarrays se realizaron por duplicado. Todos los datos de microarrays reportados en el manuscrito se describe en conformidad con las directrices MIAME y los datos han sido depositados en CIBEX (Centro para la expresión génica Información Biología) base de datos [36] en el Centro para la Biología de la Información y Banco de ADN de datos de Japón (DDBJ), Nacional Institute of Genetics (Mishima, Japón). El número de acceso para el conjunto de datos es CBX79.
microarrays y Gene ontología análisis
Los datos de microarrays se visualizó y se normalizó el uso de software Genespring GX 7.3 (Agilent). Valores por debajo de 0,01 se fijaron a 0,01. Para cada chip de cada medición se dividió por el percentil 50 de todas las mediciones para ese chip. Luego, para cada sonda de las mediciones se normalizaron a las mediciones de control negativo. Debido a la limitación de los recursos, la estadística
p-valor
puede no ser criterios aplicables para la selección de genes de nuestra base de datos. Por lo tanto, para el análisis de genes ontología, se definieron los genes expresados diferencialmente como ≥1.5 doblar hacia arriba o hacia abajo en relación con el control negativo en el día correspondiente. Ontología de genes de enriquecimiento plazo en conjuntos de genes regulados hacia arriba y abajo se evaluaron utilizando la herramienta web GOstat [37]. La herramienta web GOstat proporciona un valor de p de si el gen lista proporcionada es considerablemente enriquecido para los genes anotados con una determinada ontología de genes. Esto se calcula con base en el número de genes en el conjunto de genes son anotados con la ontología dada, y el número de genes en todo el microarray (el fondo) están anotados con la misma ontología. Definimos el fondo como el conjunto de genes detectados en al menos una de las serie de experimentos.
Los anticuerpos y análisis de inmunotransferencia
Los anticuerpos contra la α-tubulina (Sigma) y CDK6 (Santa-Cruz se han usado Biotechnology, Santa Cruz, CA). Las células cultivadas (5,0 × 105 células /pocillo) se cultivaron en pocillos de placas de 6 pocillos y se transfectaron con miRNAs. 24 horas después de la transfección, las células se lisaron y se sometieron a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas separadas se transfirieron a una membrana Immobilon (Millipore, Billerica, MA) mediante electrotransferencia. Los complejos inmunes se detectaron mediante quimioluminiscencia mejorada (Perkin Elmer) y se visualizaron con LAS analizador de imagen 3000 (película Fuji, Tokio, Japón).
Apoyo a la Información sobre Table S1.
doi: 10.1371 /journal.pone.0006677.s001 gratis (XLS 0.03 MB)
Tabla S2.
doi: 10.1371 /journal.pone.0006677.s002 gratis (XLS 0.27 MB)
Reconocimientos
Agradecemos a las MPE. Satomi Fujiwara, Asami Hirakiyama, y Kana Nakamura por su asistencia técnica.