Extracto
La quimiorresistencia sigue siendo un obstáculo importante para el tratamiento eficaz en pacientes con cáncer de ovario, y recientemente crecientes evidencias sugieren que los miRNAs están involucrados en la resistencia a las drogas. En este estudio, se investigó el papel de miRNAs en la regulación de la resistencia a cisplatino en la línea celular de cáncer de ovario y analizamos sus posibles mecanismos. Estamos perfiladas miRNAs expresados diferencialmente en la línea celular de cáncer de ovario humano resistentes al cisplatino A2780 /DDP en comparación con las células parentales A2780 utilizando microarrays. Cuatro miRNAs expresados anormalmente fueron seleccionados (miR-146a, -130a, -374a y miR-182) para estudios posteriores. Su expresión se verificó mediante qRT-PCR. imita MiRNA o inhibidor se transfectaron en células A2780 y A2780 /DDP y luego la sensibilidad al fármaco se analizó mediante matriz MTS. RT-PCR y Western blot se llevaron a cabo para examinar la alteración de la expresión de genes MDR1, PTEN. Se encontró un total de 32 miRNAs que se expresó diferencialmente en las células A2780 /DDP. Entre ellos, miR-146a se había reducido regulado y miR-130a, -374a, -182 se upregulated en las células A2780 /DDP, que fue verificada por RT-PCR. MiR-130a y miR-374a imita disminuyó la sensibilidad de las células A2780 al cisplatino, a la inversa, sus inhibidores podrían resensitize células A2780 /DDP. Por otra parte, la sobreexpresión de miR-130 podría aumentar los niveles de mRNA MDR1 y P-gp en células A2780 y A2780 /DDP, mientras que desmontables de miR-130 podría inhibir la expresión del gen MDR1 y regular al alza la expresión de la proteína PTEN .En conclusión, la desregulación de miR-374a y miR-130a pueden estar implicados en el desarrollo y la regulación de la resistencia a cisplatino en las células de cáncer de ovario. Este papel de miR-130 se puede conseguir mediante la regulación de la expresión del gen MDR1 y PTEN
Visto:. Li N, Yang L, Wang H, Yi T, Jia X, Chen C, et al. (2015) miR-130a y función miR-374a como reguladores novedosos de la resistencia a cisplatino en células de cáncer de ovario humano A2780. PLoS ONE 10 (6): e0128886. doi: 10.1371 /journal.pone.0128886
Editor Académico: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 15 Febrero, 2015; Aceptado: 2 de mayo de 2015; Publicado: 4 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por dos fondos. Una de ellas es la Fundación local (No.2012SZ0022) del Departamento de la provincia de Sichuan Ciencia y Tecnología (http://www.scst.gov.cn/info/), cuya fuente de financiación se WHJ participando en el diseño del estudio y decisión de publicar en este estudiar. El otro es el Programa de Changjiang Académicos y el equipo de investigación innovadora en la Universidad (NO.IRT0935, http://www.moe.gov.cn/), cuyos donantes tenían ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, la decisión publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de ovario es la causa principal de muerte en neoplasias ginecológicas [1]. Más de 70% de los pacientes con cáncer de ovario han avanzado etapa (FIGO estadio III o IV) enfermedad en el momento del diagnóstico [2]. El cisplatino es el principal enfoque terapéutico para el cáncer de ovario avanzado, sin embargo, de resistencia a fármacos reduce al mínimo la eficacia de la quimioterapia con cisplatino-base en un gran número de los pacientes [3]. Múltiples factores y mecanismos que contribuyen a la resistencia a cisplatino se han reportado, incluyendo una mayor flujo de salida de drogas, la anomalía del objetivo de drogas, mejora de la reparación del ADN y la alteración de las vías de apoptosis [4-7] .Nonetheless los mecanismos subyacentes de la quimio-resistencia todavía son poco conocidos y la agentes eficaces para mejorar la resistencia es hasta que en ausencia.
Recientemente, los estudios informaron que los microRNA (miRNA) estaban involucrados en la quimio-resistencia. MiRNAs representan una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes, y podrían unirse a la región 3 'no traducida (3'-UTR) de los ARNm diana, dando como resultado la degradación del ARN y /o la represión de traducción [8]. Por lo tanto, miRNAs ampliamente participan en la regulación de diversos procesos biológicos, tales como el desarrollo embrionario, la proliferación celular, la diferenciación, la migración y la apoptosis [8,9]. Un número creciente de estudios sugieren que las expresiones aberrantes miARN se han asociado con todos los aspectos de la biología del tumor, incluyendo la resistencia a varios agentes quimioterapéuticos [10-12] .Para ejemplo, miR-21 se sobreexpresa en tejidos de cáncer colorrectal que eran menos sensibles a 5 -FU [13], y la inhibición de la expresión de miR-21 fue capaz de sensibilizar a las células a 5-FU [14]. Además, nuestro estudio anterior [15] encontró que el miR-130a se reguló en SKOV3 /DDP en comparación con SKOV3, y la inhibición de miR-130a podría superar la resistencia a cisplatino mediante la regulación de la vía /P-gp MDR1. Sin embargo, el papel de los miRNAs prensents especificidad de la célula, por lo que la expresión de miR-130a u otros miRNAs y sus papeles en otras líneas celulares de cáncer de ovario son necesarios para un estudio adicional.
En el presente estudio, hemos examinado la expresión de los genes miARN perfil de A2780 y A2780 /DDP células, y se seleccionan algunos de los miRNAs expresados diferencialmente en A2780 /DDP en estudio. A continuación, se verifica la expresión de miRNAs seleccionados por QRT-PCR, y se investigó su papel en la modulación del cisplatino-resistencia, que puede ofrecer nuevas dianas candidatas para la terapia génica en el cáncer de ovario resistentes al cisplatino.
Materiales y Métodos
cultivo celular
El A2780 línea celular de cáncer de ovario humano y su cisplatino resistentes sublínea A2780 /DDP se cultivaron en medio DMEM (Gibco, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS, Gibco , EE.UU.), en un incubador humidificado con un 5% de CO
2 a 37 ° C. A2780 /DPP fue alimentada alternativamente con un medio que contenía 9 mg /ml de cisplatino para mantener la resistencia a las drogas y más cultivadas en medio libre de drogas durante una semana antes de los experimentos de seguimiento. se obtuvieron y se conservan en Oncología Ginecológica de la terapéutica biológica Laboratorio, Hospital de China Occidental Segunda Universidad, la Universidad de Sichuan, Chengdu, China ambas líneas celulares.
miARN análisis de microarrays
ARN total fue extraído de A2780 y A2780 /células DDP utilizando Trizol (Invitrogen, EE.UU.) y miRNeasy mini kit (QIAGEN, Dinamarca) según las instrucciones del fabricante. La calidad y la cantidad se midieron por el espectrofotómetro (Beckman Coulter, DU730, EE.UU.) y la integridad del ARN se verificó por electroforesis en gel. RNA (1 ug) se marcó con fluorescente HY3 usando el kit de marcaje de miRCURY de alimentación (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) y a continuación se hibridó en la matriz de miRCURYLNA (v.18.0, Exiqon) que contiene sondas de captura 1887 miARN humanos anotados en miRBase 18.0. Después de la hibridación, las imágenes de señales fluorescentes fueron adquiridos utilizando un escáner Genepix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, EE.UU.) y se analizaron con Genepix Pro 6.0 suave-ware (Axon Instruments), en la que se obtuvo la mediana de la normalización. Dos veces o cambio mayor se estableció como un umbral de diferencia significativa.
Bioinformática
Los objetivos potenciales de miRNAs expresados diferencialmente se predijo con la ayuda de PicTar o software TargetScan 5.2.
en tiempo real QRT-PCR
verificó la expresión de miRNAs en seleted A2780 y A2780 /DDP células por QRT-PCR. El ARN total de cada línea celular se extrajo y se evaluó como la mencionada. Mirna y U6 cDNA se generó usando cebadores específicos de genes miARN RT tallo-bucle de acuerdo con el Kit de AMV Primera Strand cDNA Synthesis protocolo (Invitrogen, EE.UU.). Todos los cebadores fueron diseñados y sintetizados por Guangzhou RiboBio (RiboBio, China). En tiempo real QRT-PCR se realizó en un volumen de reacción de 20μl en el ABI stepone plus instrumento (EE.UU.). miARN expresión relativa se evaluó usando la 2
-ΔΔCt método y normalizó a la expresión de U6 pequeños ARN. Todos los QRT-PCR se realizaron por triplicado.
transfección celular
El miARN mímica, inhibidor y control negativo se diseñaron y sintetizaron químicamente mediante Guangzhou RiboBio (RiboBio, China). 24h antes de la transfección, las células fueron sembradas en placas de 96 pocillos con 5000 células /pocillo y se cultivaron en medio sin antibióticos. Después de la unión celular, la transfección se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.) y reducido OPTI-MEM medios suero (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. El medio se reemplazó 4-6h después de la transfección con el nuevo medio fresco. Las células se prepararon para su posterior análisis 48h después de la transfección. La eficiencia de este sistema de transfección mediada por liposomas se detectándose con la ayuda de Cy3-siRNA. Cy3-siRNA es una especie de 21-25nt pequeña molécula de ARN, similar al inhibidor de miARN o imita, y puede excitar la fluorescencia a la longitud de onda de 555 nm. Los pasos principales son las siguientes: las células se sembraron en placas de 24 pocillos con 10.000 células /pocillo y se transfectaron con el Cy3-siRNA usando Lipofectamine 2000 y medio Opti-Mem. 24 horas después de la transfección, se observaron las células bajo el microscopio de fluorescencia. La eficiencia de transfección se presenta como la relación de células observadas bajo la fluorescencia de células observadas bajo el ligtht nomal. Todos los experimentos se repitieron tres veces.
array viabilidad celular
Después de la transfección, las células en placas de 96 pocillos se expusieron a diversas concentraciones de cisplatino. La proliferación celular se determinó mediante un ensayo colorimétrico usando el One Solution kit ensayo de proliferación celular CellTiter 96 acuoso (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Después de 48 h de tratamiento, se añadieron 20 ul de un reactivo solución a cada pocillo y se incubó durante 3 horas a 37 ° C. La absorbancia a 490 nm de longitud de onda se midió utilizando un lector de microplacas (modelo 680, Bio-Rad, EE.UU.). Cada experimento se llevó a cabo con repeticiones de seis pozos y se repite tres veces.
Semi-RT-PCR cuantitativa
El ARN total a partir de células no tratadas o células transfectadas se aisló utilizando el reactivo Trizol. RT-PCR se realizó utilizando el kit de reactivos PrimeScript RT y Multiplex PCR Assay Kit de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Takara Biotecnología, Dalian, China). productos de la PCR se identificaron por electroforesis con 1,5% geles de agarosa y se registran mediante el sistema de imágenes Gel (Bio-Rad, CA, EE.UU.). GAPDH ARN se sirvió como un control de entrada.
ensayo de transferencia Western
Las células se lavaron con 1 x PBS y se lisaron con tampón RIPA. La concentración de proteína se midió utilizando el método BCA. A continuación, se utilizó 20 ug de proteína para la detección de P-gp y de la proteína PTEN, y GAPDH se utilizó como control de carga. monoclonal de ratón anti-Pgp (diluido 1: 1000; Calbiochem, San Diego, CA, EE.UU.), anti-PTEN (diluido 1: 1000; Santa Cruz, CA, EE.UU.) y anti-GAPDH (diluido 1: 50000; Kangchen, Shanghai , china) se utilizaron como anticuerpos primarios. El anticuerpo secundario fue conjugado con peroxidasa de rábano picante. Los anticuerpos unidos se detectaron usando el kit ECL. Aquel cantidad de software se utilizó para cuantificar las intensidades de banda de proteínas.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como la media ± desviación estándar. La diferencia entre las medias se analizó mediante la prueba t de Student. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS 13.0 (Chicago, IL, EE.UU.). Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.
Resultados
Diferencial expresaron miRNAs en A2780 /DDP en comparación con su célula parental A2780
El perfil de expresión de miRNA de ovario línea celular de cáncer A2780s y A2780 /DDP se detectó usando matriz miARN en este estudio. Como se muestra en la Tabla 1, 32 miRNAs (24 hasta reguladas, las reguladas 8) se encontraron que se expresó diferencialmente en las células A2780 /DDP en comparación con sus células parentales. El potencial del gen diana de estos miRNAs se predijo y se enumeran en la Tabla 1.
En tiempo real QRT-PCR para 4 miRNAs expresados diferencialmente
Entre los 32 miRNAs expresados diferencialmente, se seleccionaron 4 miRNAs para el estudio del futher. Los resultados de QRT-PCR mostraron que, en las células A2780 /DDP, la expresión de miR-374a, 130a, -182 se incrementó, respectivamente, por 2,06, 4,87, 1,28 pliegues y miR-146a se redujo en 133,56 veces en comparación con las células A2780s (
p
& lt; 0,05), que fueron consistentes con la micromatriz. (Figura 1)
El nivel de miR-146a en A2780 /DDP fue extremadamente baja, sólo representa el porcentaje de 0,75 que en A2780s (**
p Hotel & lt; 0,05). La expresión de miR-130a, -374a y miR-182 fue de 4,8, 2,08 y 1,28 veces más altas que en las células A2780 (**
p Hotel & lt; 0,05, *
p Hotel & lt; 0,05) .Estos resultados mostraron los cambios de expresión consistentes detectados por el microarray.
miR-130a y miR-374a imita o inhibidores regulan la sensibilidad cisplatino en A2780 y A2780 /DDP
este estudio, hemos utilizado el liposoma para mediar la transfección de los análogos de miARN. Por lo tanto, en primer lugar, detectamos la eficacia de transfección. se observaron células A2780 y A2780 /DDP bajo el microscopio de fluorescencia después de 24 horas de Cy3-siRNA transfección. calculamos que los A2780s y células A2780 /DDP con fluorescencia roja representaron respectivamente el 85% y el 93%, lo que indictated que el sistema de transfección mediada por liposomas podría alcanzar una alta eficiencia
Tres miARN (miR-374a,. - 130a, -182) imita y inhibidor de miR-146a se transfectaron en células A2780, para ver si las células transfectadas se adquirir resistencia a cisplatino. Los resultados mostraron que las células A2780 transfectadas con miR-374a y miR-130a imita tuvieron una supervivencia significativamente mayor que el grupo control en el marco del tratamiento de 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin, pero mismo fenómeno no se observó para miR-182 imita y inhibidor de miR-146a. (P & lt; 0,05, Figura 2A).
(A) Las células A2780 después de la transfección con el miR-130a-mímica y miR-374a-mímica mostró un aumento de la proporción de células supervivientes en el marco del tratamiento de 0,8, 3,2 ug /ml cispaltin (*
p Hotel & lt; 0,05). (B) miR-130a-inhibidor y miR-374a-inhibidor disminuyó la proporción de células supervivientes en el marco del tratamiento de 8, 32 ug /ml cispaltin (*
p
& lt; 0,05).
Estamos transfectadas adicionalmente con inhibidores de miR-374a y miR-130a en las células A2780 /DDP para explorar si se pueden revertir en parte la resistencia a cisplatino. Como se muestra en la figura 2B, miR-374a y el inhibidor de miR-130a mejorado significativamente la citotoxicidad de tratamiento con cisplatino en comparación con la del control (p & lt; 0,05).
miR-130a regulan la expresión de MDR1 y PTEN en A2780s y células A2780 /DDP
Se examinó la expresión de MDR1, PTEN ARNm y proteína en la A2780 y A2780 /DDP células por RT-PCT y Western blot. Como se muestra en la figura 3, el nivel de mRNA MDR1 y P-gp en el A2780 /células DDP fue de 2,33 y 1,88 veces mayor que la de en las células A2780 (P & lt; 0,05), mientras que la expresión de la proteína PTEN eran extremadamente bajos tanto en células líneas y la expresión de PTEN ARNm y proteínas no mostraron diferencias significativas entre ellos (P & gt; 0,05).
(A) los niveles de mRNA MDR1 y PTEN en A2780 y A2780 células /DDP. La expresión de MDR1 mRNA se sobreexpresa en A2780 /DDP en comparación con A2780 (P & lt; 0,05), y el nivel de PTEN mRNA no mostró diferencias (P & gt; 0,05). (B) P-gp y proteína PTEN niveles de expresión en A2780s y células A2780 /DDP. La expresión de P-gp en células A2780 /DDP fue mayor que la de A2780 (P & lt; 0,05), y la proteína PTEN se encontraba en una niveles muy bajos en las células A2780 y A2780 /DDP. (1,2: A2780, A2780 /DDP) guía empresas
Con el fin de investigar si el miR-130 podría regular PTEN y MDR1 expresión, imita las correspondientes e inhibidores de las dos miRNAs se transfectaron en A2780 y A2780 /células DDP. PTEN, MDR1 mRNA y la expresión de la proteína se determinó a las 48 h después de la transfección. Como se muestra en la figura 4, la inhibición de miR-130a aumentó los niveles de proteína PTEN y atenuó la expressio de MDR1 mRNA y P-gp (P & lt; 0,05), mientras que la sobreexpresión de miR-130a dio lugar a la sobre regulación de MDR1 ARNm y la expresión de P-gp en A2780 y A2780 células /DDP (P & lt; 0,05) .La expresión de PTEN mRNA no cambió con el tratamiento de inhibidor de miR-130a e imita en ambas líneas celulares (P & gt; 0,05).
(A1 , A2): PTEN y mRNA MDR1 en las células A2780 después de la transfección. El nivel de MDR1 ARNm se upregulated de los imitadores de miR-130a y regulada negativamente por el inhibidor de miR-130a (P & lt; 0,01). (B1, B2): P-gp y de la proteína PTEN en las células A2780 después de la transfección. La expresión de la proteína PTEN fue significativamente elevado Cuando las células fueron tratadas con miR-130a-I, la expresión de P-gp se upregulated por el miR-130-M y downregulated por miR-130a-I. (C1, C2): PTEN y mRNA MDR1 en A2780 /DDP células después de la transfección. El efecto regulador de miR-130 en las células A2780 /DDP fue similar a la de las células A2780. (D1, D2): P-gp y la proteína PTEN en las células A2780 /DDP después de la transfección. El efecto de miR-130a era similar a la de las células A2780s. (1,2,3: miR-130a-M, miR-130 y miR-I-NC; * p & lt; 0,05, ** p & lt; 0,01) guía empresas
En resumen, hemos encontrado 32 miRNAs se expresan diferencialmente en las células A2780 /DDP en comparación con sus padres células por serie de miRNA. Entre ellos, se redujeron reguladas miARN (miR-146a) y tres fueron seleccionados hasta reguladas (miRNAs miR-130a, -374a, -182) para su estudio, y su expresión se validaron consistente con arreglo miARN usando QRT-PCR. En el experimento de transfección, se encontró que la sobreexpresión de miR-130 y miR-374a para disminuir la sensibilidad de las células A2780 y /DDP A2780 al cisplatino, y abajo de la regulación del miR-130a y la expresión de miR-374a ejerce el efecto contrario. Los resultados de RT-PCR y Western blot mostraron que miR-130a podría regular positivamente la expresión del ARNm y la proteína de MDR1 y regular negativamente la proteína PTEN, que puede ser uno de los mecanismos de papel de miR-130 en la quimiorresistencia.
Discusión
a pesar de que la quimioterapia basada en platino ha mejorado en gran medida el pronóstico del cáncer de ovario, resistencia a las drogas sigue siendo el principal obstáculo de éxito del tratamiento [3]. Recientemente, se informó de miRNAs que se expresó diferencialmente en los cánceres resistentes a los fármacos y podrían regular la resistencia a los medicamentos [16,17].
En el presente estudio, se encontró que 32 miRNAs se expresan diferencialmente en A2780 /DDP en comparación con A2780. Curiosamente, algunos de estos miRNAs se han confirmado estar involucrado en la quimio-resistencia. Por ejemplo, el miR-27a fue hasta reguladas en las células de Taxol A2780 /y desmontables de miR-27a mejorado la sensibilidad paclitaxel [18]. Takiuchi [19] informó de que el miR-181 disminuyó la sensibilidad de las células del cáncer pancreático a través de la activación de gemcitabina NF-kB mediante la inhibición CYLD. Nuestro estudio anterior también encontró miR-130a se relaciona con cisplatino-resistencia en las células SKOV3. Los datos de microarrays revelaron que en DDP A2780 /la expresión de miR-146a era extremadamente baja, y miR-130a, -374a, -182 se reguló hasta. Además, el papel de miR-130a en la resistencia al cisplatino de las células A2780 y si miR-146a, -374a, -182 podría regular la resistencia a los medicamentos aún no han reportado, por lo que elegir estos cuatro miRNAs para el estudio adicional. Estos cuatro miRNAs expresión fueron verificados por QRT-PCR, lo que sugiere que un poco de microarrays tenía una gran precisión.
En los experimentos de transfección, se encontró alteración de miR-130a y la expresión de miR-374a podría cambiar el grado de resistencia al cisplatino en A2780 y A2780 /DDP. Varias investigaciones han demostrado que el miR-130a actuó como regulador quimioresistente. Sobre regulación de miR-130 podría afectar la resistencia doxorubicina en cáncer de mama [20], y miR-130a indujo la resistencia de células de cáncer de hígado a cisplatino por regulación a la baja de tumor gen supresor de RUNX3 [21]. En nuestro estudio anterior [15], el miR-130a se sobreexpresa en SKOV
3 /DDP células, y la inhibición de miR-130 podría restaurar parcialmente la sensibilidad a cisplatino, que era consistente con el estudio anterior.
En la actualidad, unos pocos estudios se centraron en el papel de miR-374a en el tumor, que señaló que el miR-374a se sobreexpresa en el osteosarcoma [22] y el cáncer de colon [23]. Además, el miR-374a estuvo implicado en la génesis tumoral y la metástasis del cáncer de mama mediante la regulación de la /catenina vía Wnt [24]. Hasta el momento, no existen informes sobre el papel de miR-374a en la resistencia a los medicamentos. Aquí, encontramos que el miR-374a fue aumentada en las células resistentes al cisplatino, y la disminución de su expresión podría hacer que las células sean más sensibles al cisplatino, mientras que la regulación positiva de su expresión en A2780s tenido el efecto contrario.
Por lo tanto, consideramos que la sobre expresión de miR-130 y miR-374a podría contribuir al desarrollo y la regulación de la resistencia a cisplatino en las células de cáncer de ovario. La inhibición de la expresión de miR-130 y miR-374a podría ser un enfoque novedoso para la superación de la resistencia a fármacos en cáncer de ovario. Como resultado, también se realizó RT-PCR y Western Blot para encontrar el mecanismo de miR-130a efecto regulador sobre la resistencia a los medicamentos.
Nuestro estudio encontró que la expresión de MDR1 ARNm y su producto de la proteína P-glicoproteína (P -gp) niveles en el A2780 /DDP fue significativamente mayor que en los A2780s, lo que sugiere que la sobre-expresión del gen MDR1 puede ser una de mecanismo de formación de la resistencia a fármacos en las células A2780 /DDP. P-gp es una bomba de membrana dependiente de ATP que transporta el fármaco fuera de las células, lo que resulta en la resistencia a múltiples fármacos [25]. Un montón de evidencias indica que los miRNAs se asociaron con mediada por P-gp resistencia a los medicamentos en muchos tipos de cáncer. Por ejemplo, el miR-451 superó la resistencia a la doxorrubicina al reducir la expresión de P-gp en las líneas celulares de cáncer de mama resistentes a la doxorrubicina MCF-7 /ADR [26]. La inhibición de miR-27a mejora la sensibilidad paclitaxel en A2780 /Taxol mediante la modulación de MDR1 /P-glicoproteína expresión [18]. Llegamos a la conclusión de que la inhibición de la expresión de miR-130a resultó en la regulación negativa de MDR1 mRNA y P-gp. Este resultado está de acuerdo con nuestros experimentos anteriores.
También encontraron que el miR-130a regula negativamente la expresión de la proteína PTEN. proteína PTEN es una fosfatasa de especificidad dual que puede bloquear las vías de transducción de señales de citoquinas mediada, a continuación, inhibir la proliferación celular, invasión y metástasis y promover la apoptosis [27]. En una variedad de tumores malignos, incluyendo el cáncer colorrectal, cáncer de mama, leucemia, cáncer de ovario etc, PTEN genes y proteínas tienen diferentes grados de eliminación o hacia abajo-regulación [27,28]. Se ha informado de que la proteína PTEN podría contribuir a la sensibilidad a los fármacos mediante la supresión de la vía PI3K /Akt, y servir como gen diana de muchos miRNAs, como miR-21, miR-22 y miR-222 [29,30]. En este experimento, la expresión de la proteína PTEN en A2780s y células A2780 /DDP eran extremadamente baja y no tenía ninguna diferencia significativa entre estas dos líneas celulares. También inferimos que la restauración de la expresión de PTEN puede ser uno de los mecanismos de aumento de la quimiosensibilidad en las células de cáncer de ovario. Sin embargo, las células A2780 y A2780 /DDP transfectadas con miR-130a-inhibidor no ejercen inhibición de la actividad celular más alta en comparación con los grupos de control en el marco del tratamiento de una dosis baja de cisplatino (0.2ug /ml y 2 ug /ml, respectivamente), se calculó la razón de este fenómeno es que la apoptosis de células PTEN mediada en parte se basan en el daño celular por el cisplatino y tienen un efecto sinérgico. Sólo una pequeña cantidad de células procesadas a la apoptosis o muerte en esta baja dosis de cisplatino y la inhibición del crecimiento celular mediada por PTEN no tenían suficiente capacidad para hacer una diferencia significativa entre los grupos experimentales y de control. Curiosamente, encontramos que el miR-130a no regulaba la expresión de PTEN ARNm asimismo PTEN proteínas, lo que sugiere que el miR-130a puede regular la transcripción del gen PTEN a nivel postraduccional por incompleta se unen a la región 3 'no traducida (UTR en 3' ) del ARNm de PTEN.
software PicTar andTargetScan predice que los posibles genes diana de miR-374a incluyen Akt3, Abi1, PDCD6, ABCC5 y así sucesivamente. Entre ellos, Abi1 se ha demostrado que se asocia con la inhibición del crecimiento y la proliferación [31] de células, que puede ser uno de los mecanismos de regulación de miR-374a sobre la resistencia a cisplatino, sin embargo, queda por verificar adicionalmente por expriments.
Recientemente, Xiang et al. [32] informó de que el miR-152 y miR-185 fueron regulados a la baja de manera significativa en el SKOV3 /DDP y las células A2780 /DDP, en comparación con su línea parental sensible SKOV3 y A2780, y hasta la regulación de la la expresión de miR-152 y miR-185 aumentó la sensibilidad de cisplatino SKOV3 /DDP y las células A2780 /DDP por la supresión de ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) directamente. De manera inconsistente, miR-152 y miR-185 (disminuyeron en 0,4 y 0,6 veces en A2780 /células DDP en comparación con las células A2780 en el estudio de Xiang) resultó ser positiva o negativamente regulado en menos de dos veces en A2780 /células DDP compararon con células A2780, por lo que estos miRNAs no fueron catalogados como miRNAs de interés. Sin embargo, debemos ser conscientes de esa matriz miARN es una prueba de detección preliminar cuyos resultados necesita una validación adicional, como por QRT-PCR, y menos de dos veces miRNAs expresados diferencialmente también pueden tener efecto sobre la resistencia a los medicamentos de cáncer de ovario.
en conclusión, este estudio demuestra que miRNAs expresados diferencialmente en células de cáncer de ovario resistentes al cisplatino probablemente juegan un papel importante en el desarrollo o la regulación de la resistencia a cisplatino. Por otra parte, la transfección con miR-130 y miR-374a inhibidores aumentó el efecto citotóxico de cisplatino. El papel de miR-130 en resistencia a los medicamentos se logró al menos parcialmente, mediante la regulación de la expresión de P-gp y de la proteína PTEN. PTEN puede ser un gen diana de miR-130, sin embargo, se necesita la validación de los informes de doble luciferasa. Estos resultados sugieren que el miR-130 y miR-374a podría ser prometedor como nuevas dianas terapéuticas para superar la resistencia a los medicamentos.
Reconocimientos
Este estudio fue apoyado por el Programa de Changjiang Los académicos y la investigación innovadora equipo (PCSIRT) en la Universidad (IRT0935), y la Fundación local del Departamento de Chengdu Ciencia y Tecnología (núm 11DXYB133SF-027).