pruebas
Extracto
La acumulación indica que los microRNA (miRNA) se expresan de forma aberrante en el cáncer humano y contribuyen a la tumorigénesis, pero su papel en el cáncer de páncreas aún no se conocen. En este estudio, nuestros datos muestran que miR-130b se downregulated significativamente en 52 pares de tejidos de cáncer de páncreas y cinco líneas celulares. Por otra parte, el miR-130b desregulado se correlaciona con un peor pronóstico, aumento del tamaño del tumor, el estadio TNM tarde, invasión linfática y metástasis a distancia. El análisis multivariado mostró que la expresión de miR-130b fue un predictor pronóstico importante e independiente para los pacientes con cáncer de páncreas. Estudios funcionales indican que la sobreexpresión de miR-130b suprimió drásticamente la proliferación de células de cáncer pancreático tanto in vitro como in vivo, lo que podría atribuirse a la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular en la fase S. Mientras tanto, un sobreexpresada miR-130b notablemente inhibió la capacidad invasiva de las células de cáncer de páncreas. Por otra parte, el ensayo de luciferasa dual reveló que STAT3 fue atacado directamente por el miR-130b, que fue confirmado por la expresión inversa de miR-130b y STAT3 en muestras de cáncer de páncreas. Nuestros hallazgos sugieren que el miR-130b podría tener un potencial considerable en la identificación de pronóstico y la aplicación de la terapia para el cáncer de páncreas
Visto:. Zhao G, Zhang Jg, Shi Y, Qin Q, Y Liu, Wang B, et Alabama. (2013) miR-130b es una proliferación celular e inhibe marcador pronóstico y la invasión en el cáncer pancreático a través de orientación STAT3. PLoS ONE 8 (9): e73803. doi: 10.1371 /journal.pone.0073803
Editor: Johannes Haybaeck, Universidad de Medicina de Graz, Austria |
Recibido: 31 de diciembre de 2012; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 10 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Zhao et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Comisión Nacional Science Foundation (SNCF) de China (los números de subvención 30972900 y 30600594). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN son ARNs no codificantes endógenas que consta de aproximadamente 22 nucleótidos. MicroARNs pueden regular negativamente la expresión de genes mediante la unión a secuencias parcialmente complementarias en el objetivo específico mRNA región 3 'no traducida (UTR), que pueden resultar en cualquiera de inhibición degradación o la traducción del mRNA [1]. Nuevas pruebas indican que los miRNAs se expresan de manera aberrante en diferentes tipos de tumores y participan en la tumorigénesis y /o metástasis humano por oncogenes dirigidos directamente o genes supresores de tumores [2] - [4].
El cáncer de páncreas es una de las neoplasias más letales. Sólo el 10-20% de los pacientes diagnosticados con cáncer de páncreas son resecable y en general la tasa de supervivencia a los 5 años es sólo del 5% debido a su alta tasa de recurrencia a pesar de los tratamientos multimodales [5], [6]. Al igual que otros tipos de cáncer, el desarrollo de cáncer de páncreas es un proceso de múltiples pasos con la acumulación de cambios genéticos y epigenéticos. expresiones miARN alterado, tales como miR-34a, miR-21 y miR-20a, se han identificado como moduladores del crecimiento celular, apoptosis, migración o invasión en el cáncer de páncreas [7] - [9]. Por lo tanto, investigaciones más extensas son necesarias sobre el papel de los miRNAs, que están liberalizados en el cáncer de páncreas con el fin de dilucidar la función de miRNAs en el cáncer de páncreas.
Microarray estudios han identificado una serie de micro ARN que fueron desregulado en páncreas cáncer, incluyendo los genes miARN-130 B [10] - [12]. Hasta la fecha, miR-130 B se ha encontrado para ser desregulado en algunos tipos de cáncer incluyendo el ser sobreexpresada en el cáncer gástrico [13], [14], glioma [15] y el cáncer de células renales [16], mientras que se downregulated en el cáncer de endometrio [ ,,,0],17] y el carcinoma papilar de tiroides [18]. Sin embargo, no se han realizado estudios específicos para revelar el papel de miR-130b en el cáncer de páncreas. Por lo tanto, nuestro estudio tuvo como objetivo identificar el papel de miR-130b en el cáncer de páncreas. En este estudio, se analizaron la expresión de miR-130b entre el cáncer de páncreas y los tejidos adyacentes normales pancreáticos. Por otra parte, la proliferación y la invasividad se evaluaron en PANC-1 y células ASPC-1 después de haber sido transfectadas con miR-130b.
Nuestra investigación identificó aún más el blanco directo potencial por el que el miR-130b ejerce su función en el páncreas Células cancerígenas. El software de predicción de microARN indicó que el transductor de señal y activador de la transcripción 3 (STAT3) podrían ser el blanco de abajo de miR-130b. STAT3 es un factor de transcripción citoplasmática clave que se activa por el crecimiento de la tirosina quinasa y receptores de citoquinas. STAT3 desempeña un papel importante en la mediación de diversos procesos biológicos incluyendo: la proliferación celular, la apoptosis y la diferenciación [19]. STAT3 se ha identificado como un factor oncogénico clave en una serie de tumores malignos y es necesario para la oncogénesis en la piel y el cáncer gástrico [20], [21]. En el cáncer de páncreas, la activación de STAT3 promovió el crecimiento de células tumorales y la invasión, lo que llevó a la mala supervivencia de los pacientes [22]. Por otra parte, STAT3 caída inhibió el crecimiento celular y la invasión en el cáncer de páncreas tanto
in vitro
y
in vivo
, y una marcada disminución de VEGF y MMP-2 expresión [23], [24]. Por lo tanto, se aplicó el ensayo de luciferasa dual para identificar si STAT3 fue atacado directamente por el miR-130b. Por otra parte, la correlación entre la expresión de miR-130b y STAT3 en muestras de cáncer de páncreas fue explorada más.
Materiales y Métodos
Pacientes y tejidos tumorales
Un total de 52 se obtuvieron tejidos humanos de cáncer de páncreas (PC) y los tejidos adyacentes normales emparejados pancreáticas (NP) durante la cirugía en el Instituto de Enfermedades pancreático, Union hospital (Wuhan, china) entre enero de 2007 y diciembre de 2009. el diagnóstico se basa en la evidencia patológica y los especímenes fueron inmediatamente congeladas instantáneamente. Ellos fueron almacenadas a -80 ° C para el futuro de miR-130b y la extracción de STAT3. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o radioterapia antes de la escisión quirúrgica. Todos los 52 pacientes dieron su consentimiento informado por escrito para el uso de sus tejidos y el protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología, y el número de aprobación ética se S214.
Cuantitativa en tiempo real Transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR)
El ARN total se aisló de los tejidos de cáncer de páncreas o de células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). MiR-130b y U6 se poliadenilado utilizando poli-Un kit basado polimerasa primer capítulo de síntesis (Takara Bio, Japón) siguiendo el protocolo del fabricante. Para cuantificar los niveles de ARNm de GAPDH y STAT3, 1 ug de RNA total se sometió a la síntesis de ADNc de primera cadena durante 15 minutos a 37 ° C y 5 s a 85 ° C utilizando un kit de reactivos RT PrimeScript (Takara). La PCR cuantitativa se realizó mediante SYBR Green PCR Master Mix (Takara) en el sistema ABI 7500HT. El U6 o GAPDH se utilizaron como control endógeno. Las expresiones de pliegue relativas se calcularon con el método -ΔΔCT 2
. Todas las reacciones de QRT-PCR se realizaron por triplicado. Una lista de los cebadores utilizados en las reacciones se presentan en la Tabla S1.
Líneas celulares y cultivos
cáncer pancreático humano PANC-1, ASPC-1, MiaPaCa-2, BxPC-3 y SW1990 líneas celulares se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) y se mantuvieron en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y antibióticos (100 U /ml de penicilina y 100 mg de sulfato de estreptomicina /ml). Las células se cultivaron en un incubador humidificado a 37 ° C con 5% de CO2.
La transfección
Los microARN fueron diseñados y sintetizados por RiboBio (Ribobio Co., Guangzhou, China). La transfección microRNA se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células de cáncer pancreático se sembraron en placas de 12 pocillos y se cultivaron hasta 40% de confluencia antes de la transfección. El ARN y las proteínas se extrajeron a las 48 h después de la transfección. La concentración final de miR-130b mímica y anti-miR-130b fue de 50 nM. Lentiviral miR-130b (LV-miR-130b) y vector lentiviral vacío (LV-NC) se construyeron mediante Genechem Company (Shanghai, China) y se transfectaron en las células de cáncer de páncreas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en este experimento se enumeran en la Tabla S2.
celulares Ensayos de proliferación
La proliferación celular se determinó por ensayos de MTT. Brevemente, las células de cáncer de páncreas (5 × 10
3 por pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos en RPMI 1640 y 10% de FBS. Después de 24 horas de estar en el cultivo, las células fueron transfectadas con 50 nM imita el miR-130b, anti-miR-130b y su respectivo control utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células fueron cultivadas en el medio para otro 48 h y se evaluaron mediante un ensayo colorimétrico utilizando la solución de MTT (5 mg /ml) a 570 nm. Todos los experimentos se realizaron tres veces con cinco repeticiones.
Evaluación de la apoptosis y el ciclo Cell Distribution
tasa de apoptosis y la fase del ciclo celular se determinaron por citometría de flujo FACS como se informó anteriormente [25]. Para el análisis de apoptosis, las células se recogieron, se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS) y se resuspendieron en tampón de unión a una densidad celular de 1 × 10
6 /mL. Las células fueron teñidas con anexina V-FITC y yoduro de propodium de acuerdo con el protocolo del fabricante. La señal fue adquirida por un flujo FACS Calibur citómetro (BD Biosciences) y se analizaron con el software Cellquest. Para el análisis del ciclo celular, las células se cosecharon por tripsinización, se lavaron dos veces con PBS frío y se fijaron en etanol al 70% durante la noche a -20 ° C. Luego, las células se trataron con solución de tinción de ADN que contiene 3,4 mM de Tris-Cl (pH 7,4), yoduro de propodium, triton X-100 0,1% tampón y el análisis del ciclo de la célula A. /ml de RNasa 100 g se realizó con flujo FACS citometría.
Matrigel invasión de ensayo
La cámara de invasión de Matrigel se utilizó para evaluar la capacidad de invasión de las células (placas de 24 pocillos, tamaño de poro mm 8, Corning) como se describe anteriormente [26]. En resumen, las células (5 × 10
4) se sembraron en la cámara superior a 37 ° C con el medio que contiene 0,1% de albúmina de suero bovino, mientras que los medios que contienen suero bovino fetal al 20% se colocó en el pocillo inferior. Después de 48 horas, las células se retiraron no invasora con hisopos de algodón. las células invasoras en la parte inferior de la membrana se tiñeron con 0,1% de cristal violeta y se contaron bajo observación microscópica. Los ensayos se realizaron por triplicado y se repitieron tres veces.
Análisis Western Blot
Se recogieron células del cáncer pancreático después de un tratamiento de 48 horas con 50 nM de miR-130b mímica o anti-miR-130b y controles correspondientes. La extracción de proteínas, electroforesis en gel de SDS-PAGE y transferencia se realizaron como anteriormente hemos descrito [27]. Se utilizaron varios diferentes anticuerpos primarios incluyendo: STAT3 (Tecnología de Señalización Celular, Danvers, EE.UU.) y GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE.UU.). Las incubaciones de anticuerpos secundarios se llevaron a cabo durante 2 horas a temperatura y bandas de proteínas se visualizaron las habitaciones en la película de rayos X utilizando un sustrato de quimioluminiscencia ECL mejorada.
Dual de ensayo de luciferasa
experimentos
Co-transfección eran realizaron en placas de 96 pocillos. Un total de 1 × 10
4 células fueron sembradas por pocillo en 200 l de medio. Un total de 100 ng de tipo salvaje (WT) o mutante (MUT) reportero construcciones fueron co-transfectadas con el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 en las células del cáncer pancreático con 50 nM de miR-130b o miR-NC de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 48 h, la actividad luciferasa se midió con el sistema de ensayo de indicador Dual-Luciferase (Promega). la actividad de la luciferasa de luciérnaga se normalizó a la correspondiente actividad de luciferasa de Renilla.
pancreático modelo de xenoinjerto de cáncer
Cuatro semanas de edad ratones desnudos hembra (BALB /c-desnudo) se utilizaron para examinar la tumorigenicidad . Un total de 100 células soluciones uL (que contienen 1,5 × 10
7 PANC-1 células) se inyectaron por vía subcutánea en el flanco derecho de los ratones. El tamaño del tumor se midió con un calibrador vernier cada cuatro días y los volúmenes tumorales se calcularon usando la fórmula: longitud x anchura
2 × 0,5 [28]. El uso de ratones desnudos cumplido con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el estudio fue aprobado por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de Tongji Medical College de la Universidad Huazhong de Ciencia y Tecnología.
Análisis estadístico
la expresión de miR-130b se comparó en tejidos de cáncer de páncreas y células de la prueba t de Student para datos independientes. Las relaciones entre el miR-130b y parámetros clínico fueron evaluados por χ
2 test. Las tasas de supervivencia para la expresión de miR-130b se estimaron utilizando el método de Kaplan-Meier y la diferencia en las curvas de supervivencia mediante la prueba de log-rank. Los datos de supervivencia se evaluó utilizando un análisis de regresión de Cox. La relación entre el miR-130b y expresión STAT3 fue explorada por la correlación de Spearman. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo por el software de SPSS13.0 y los datos se presentan como media ± desviación estándar (SD). A p inferior a 0,05 se consideró significativo.
Resultados
Significado clínico-patológico de miR-130b en el cáncer pancreático pacientes
El uso de un método de QRT-PCR, se detectó el miR-130b en todos los 52 pares de tejidos pancreáticos cáncer y sus tejidos pancreáticos no cancerosos coincidentes, así como líneas celulares de cáncer de páncreas. Como se muestra en la Fig. 1A, 45 tejidos de PC mostraron baja expresión de miR-130b, en comparación con la de los tejidos de NP y el pliegue del cambio media fue de 1,86 (P & lt; 0,01). Mientras tanto, la expresión de miR-130 B fue significativamente menor en las cinco líneas celulares de cáncer pancreático examinados en comparación con la de las muestras de páncreas normales (Fig. 1B).
(A) El nivel relativo de expresión de miR-130b en los tejidos humanos de cáncer de páncreas (n = 52) y tejidos pancreáticos no cancerosas adyacentes emparejados (n = 52). PC: tejidos de cáncer de páncreas; NP: tejidos pancreáticos no cancerosas adyacentes. (B) El nivel de expresión de miR-130b en cinco líneas celulares de cáncer pancreático (PANC-1, ASPC-1, MiaPaCa-2, BxPC-3 y SW1990). Los datos se presentan en las líneas celulares de cáncer pancreático en relación con el control. No había ninguna línea celular normal de páncreas, así que elegimos al azar tres tejidos pancreáticos normales como control. U6 se utilizó como control para la carga de ARN y la abundancia de los genes miARN se normalizó a la del ARN U6. curvas (C) de Kaplan-Meier de las supervivencias globales de 52 pacientes de cáncer de páncreas se anotó como bajo nivel de expresión (por debajo del valor de la mediana, n = 26) y alto nivel de expresión (por encima del valor de la mediana, n = 26) de acuerdo con la MIR -130b expresión. La regulación a la baja de miR-130b se correlacionó significativamente con una menor supervivencia global. Los valores de P se muestran con el uso de la prueba de log-rank. (D) La χ
2 Análisis de la relación entre el miR-130b y la invasión /metástasis en pacientes con cáncer de páncreas. *. P & lt; 0,05; **. P & lt;.
0,01
Además, se investigó la correlación de miR-130b regulación a la baja en correlación con el pronóstico del cáncer de páncreas. a continuación, se estudió la correlación entre la expresión de miR-130b y las características patológicas clínicas de cáncer de páncreas. El grupo de la expresión de miR-130b baja mostró una mayor incidencia de un aumento en el tamaño del tumor (p = 0,001), a finales estadio TNM (p = 0,005), invasión linfática (p = 0,012) y metástasis a distancia (P = 0,012). Sin embargo, no se observaron diferencias significativas con respecto a sexo, edad, localización del tumor, el grado histológico o infiltración recipiente en el cáncer pancreático (Tabla 1). Por otra parte, el análisis de supervivencia Kapan-Meier reveló que los pacientes con una expresión de miR-130b baja tenían un pronóstico significativamente peor que aquellos con una alta expresión (Fig. 1C). Como se muestra en la Fig. 1D, la χ
2 análisis mostró que los pacientes con una expresión de miR-130b inferior se asocian más frecuentemente con la invasión tumoral y la metástasis. Además, los pacientes con invasión tumoral y metástasis tenían una expresión significativamente menor miR-130b. Mientras tanto, el análisis multivariante de Cox mostró que la expresión de miR-130b, estadio TNM, y metástasis a distancia se asociaron significativamente con la supervivencia global de los pacientes con cáncer de páncreas como factores pronósticos independientes (Tabla 2). Estos resultados mostraron que la desregulación de miR-130 se correlaciona con un peor pronóstico y participó en la invasión /metástasis de cáncer de páncreas.
miR-130b Suprimida proliferación de células tanto
en
in vitro Opiniones y
con el fin de identificar los efectos de miR-130b en las células de cáncer de páncreas, las células transfectadas in vivo PANC-1 y ASPC-1 con 50 nm imita el miR-130b, anti-miR-130b y sus respectivos Comités Nacionales. Como se muestra en la Fig. 2A, los miméticos de miR-130b causó un aumento 63,32 y 28,75 veces en la expresión de miR-130b en las células PANC-1 y ASPC-1, respectivamente. Mientras tanto, el anti-miR-130b disminuyó la expresión de miR-130 B por 2,34 y 2,88 pliegues en las células ASPC-1 PANC-1 y, respectivamente. Después de la transfección con imita miR-130b, la proliferación fue significativamente inhibida en las células ASPC-1 PANC-1 y por 30,35 ± 2,90% y 22,03 ± 7,64%, respectivamente (P & lt; 0,01). Sin embargo, anti-miR-130b promovió el crecimiento de las células PANC-1 y AsPC-1 por 15,23 ± 7,40% y 16,70 ± 3,56%, respectivamente (P & lt; 0.01; Fig. 2B).
(A) el nivel de expresión de miR-130b se puso a prueba durante 48 h en células de cáncer de páncreas transfectadas con miR-130b imita (miR-130b), anti-miR-130b y sus respectivos CN (50 nM) de QRT-PCR. (B) El efecto de la transfección transitoria de miR-130 B o anti-miR-130 B (50 nM) durante 48 h, se examinó en el crecimiento de PANC-1 y las células ASPC-1 mediante el ensayo de MTT. (C) El miR-130b inhibió la tumorigenicidad en el modelo de xenoinjerto en ratones desnudos. El LV-miR-130b o LV-NC se transfectó en células PANC-1 en presencia del virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 20. Las células PANC-1 infectadas se inyectaron por vía subcutánea en los ratones desnudos. Las curvas de crecimiento del tumor y las fotografías de los tumores extirpados en 32 días después de la implantación se muestran como se indica. Los datos se representan como la media ± desviación estándar de 10 ratones. (D) Los niveles de expresión de miR-130b se analizaron en los tumores extirpados de QRT-PCR y se normalizaron a la del control endógeno (U6 RNA). Los datos se muestran como la media ± desviación estándar de 10 ratones. *. P & lt; 0,05; **. P & lt; 0,01 en comparación con el control
A fin de confirmar los resultados anteriores, un
in vivo
modelo de tumor se construyó mediante la implantación de las células PANC-1 transfectadas con el LV-miARN. -130b o un control negativo. A lo largo del periodo tumorigénico, los tumores de las células de miR-130b transfectadas crecieron significativamente más lenta (Fig. 2C). La expresión de miR-130b en los tumores de xenoinjertos de grupo LV-miR-130 B era obviamente más alta que la del grupo control (Fig. 2D). Estos resultados demostraron que el miR-130b inhibe la proliferación de células de cáncer de páncreas tanto
in vitro e
in vivo
.
miR-130b apoptosis inducida y detención del ciclo celular en el páncreas las células cancerosas
Para investigar los mecanismos de inhibición de miR-130b sobre la proliferación de células de cáncer de páncreas, se analizó la apoptosis y el ciclo celular en las células PANC-1 y ASPC-1 transfectadas usando citometría de flujo. Los miméticos de miR-130b aumentó significativamente la tasa de apoptosis en PANC-1 (3,57 ± 0,83%
vs.
11,17 ± 1,96%) y las células ASPC-1 (6.17 ± 1.66%
vs.
12,30 ± 1,30%) en comparación con la de la miR-NC (Fig. 3A y 3C). Además, los miméticos de miR-130b reducen significativamente la proporción de G0 /G1 y G2 /M fases. Por otra parte, aumentaron la proporción de la fase S en PANC-1 (24.13 ± 4.10%
vs.
41,54 ± 3,80%) y las células ASPC-1 (23,52 ± 3,33%
vs.
47.66 ± 2,04%) en comparación con la de los controles (Fig. 3B y 3D).
() las células PANC-1 y ASPC a-1 se transfectaron con miR-130b o miR-NC (50 nM) durante 48 horas y la apoptosis se midió mediante tinción con anexina V y citometría de flujo. (B) Las células ASPC-1 PANC-1 y se trataron como se ha mencionado anteriormente y la distribución del ciclo celular se midió mediante tinción con PI y citometría de flujo. Análisis de citometría de flujo de los efectos de la apoptosis miR-130 B inducida (C) y detención del ciclo celular (D). Los datos se presentan como media ± desviación estándar de los resultados de 3 experimentos independientes. **. P & lt; 0,01 en comparación con el control
miR-130b inhibió la capacidad invasora celulares de cáncer pancreático
El efecto de miR-130b en la invasión de células de cáncer de páncreas fue investigado por la invasión de Matrigel. ensayos. Se encontró que el número de células invasoras PANC-1 transfectadas con los imitadores de miR-130b (57 ± 5 células /HP, HP: Campo de magnificación de alta energía) fue notablemente menor que el número de las transfectadas con el miR-NC (122 ± 9 células /HP; Fig. 4a). También se obtuvieron resultados similares para la invasividad de las células ASPC-1 transfectadas con el imita miR-130b (Fig. 4B). Se reveló que el miR-130 B mediada la invasión de células de cáncer de páncreas.
(A) Las células PANC-1 se transfectaron con miR-130b o miR-NC (50 nM) durante 48 horas y la capacidad de invasión de células era medido mediante ensayos de invasión de Matrigel. (B) Las células ASPC-1 fueron tratados como anteriormente y la capacidad de invasión de las células se midió por ensayos de invasión de Matrigel. La cuantificación se realizó contando las células teñidas PANC-1 y ASPC-1 que invadieron a la cámara inferior bajo un microscopio de luz. Todos los resultados fueron reproducibles en tres experimentos independientes. **. P & lt;. 0,01 en comparación con el control
STAT3 podrían ser el blanco directo de miR-130b
Para explorar el potencial objetivo por el que el miR-130b inhibe la proliferación e invasión de las células de cáncer de páncreas, nos aprovechamos de la bioinformática para predecir los objetivos de miR-130b putativos utilizando TargetScan, Miranda y PicTar algoritmos. Nuestro análisis identificó STAT3, un oncogén clave, como uno de los posibles objetivos de miR-130b. Además, las secuencias diana de STAT3 3'UTR (tipo salvaje, WT) o la secuencia mutante (de tipo mutante, MUT) se clonaron en el vector informador de luciferasa, respectivamente (Fig. 5A). Nuestros resultados mostraron que el miR-130b disminuyó significativamente la actividad de la luciferasa de luciérnaga en el reportero con 3'UTR de tipo salvaje, pero la actividad de vector 3'UTR mutante no se vieron afectados (Fig. 5B). Las células PANC-1 se transfectaron adicionalmente con miR-130b y se examinaron para la expresión de STAT3 por QRT-PCR y Western Blot. Como se muestra en la Fig. 5C, la transfección de miR-130b condujo a una disminución obvia en STAT3 ARNm y la expresión de la proteína. Por el contrario, la transfección de anti-miR-130b dio lugar a una regulación al alza de la expresión de STAT3.
(A) (Panel superior) El fragmento de STAT3 3'UTR humano que contiene de tipo salvaje o mutado miR-130b- secuencia de unión. (Panel inferior) El miR-130b y el sitio de miR-130b-vinculante en el 3'UTR de STAT3. (B) ensayo indicador de luciferasa con la co-transfección de tipo salvaje o mutante 3'UTR (100 ng) y miR-130b o miR-NC (50 nM) en células PANC-1. actividad de la luciferasa de la luciérnaga de cada muestra se normalizó contra la actividad de luciferasa de Renilla. (C) Los efectos de miR-130b o anti-miR-130b en la expresión endógena de STAT3. QRT-PCR (panel izquierdo) y western blot (panel derecho) fueron utilizados para el control de la expresión de STAT3 en células PANC-1 48 h después de la transfección con el miR-130b o anti-miR-130b (50 nM). Todos los datos de tres experimentos separados se presentan como media ± desviación estándar. *. P & lt; 0,05; **. P & lt;. 0,01
STAT3 se reguló en el páncreas y los tejidos se correlaciona inversamente con los niveles de miR-130b
Los niveles de ARNm de STAT3 se midieron en los tejidos de PC y tejidos cancerosos adyacentes. Como se muestra en la Fig. 6A, el nivel medio de expresión STAT3 fue significativamente mayor en los tejidos de PC en comparación con la de los tejidos NP (P & lt; 0,01). Se observó una correlación inversa significativa entre STAT3 y expresiones de miR-130b en los tejidos de cáncer de páncreas (correlación de Spearman, r = -0.4903, P & lt; 0,01) y los tejidos no cancerosos adyacentes (r = -0.4026, P & lt; 0,001) (Figura 6B.).
(a) STAT3 se detectó mediante qRT-PCR en 52 tejidos de cáncer de páncreas (PC) y fue emparejado los tejidos pancreáticos no cancerosas adyacentes (NP). La abundancia de STAT3 se normalizó en contra GAPDH. (B) La relación entre STAT3 y la expresión de miR-130b fue explorado por la correlación de Spearman en 52 tejidos de PC pareadas y los tejidos adyacentes NP. Todos los datos de tres experimentos separados se presentan como media ± desviación estándar. *. P & lt; 0,05; **. P & lt;. 0,01
Discusión
Los perfiles de miARN se han establecido para una variedad de tumores malignos sólidos y hematológicos [29], [30]. En los últimos años, el descubrimiento de miRNAs ha sido objeto de importantes avances en la comprensión de la biología del cáncer, proporcionando mecanismos adicionales para la desregulación genética. Sin embargo, poco se sabe acerca de los mecanismos moleculares por los cuales de miRNAs modulación en el proceso de la tumorigénesis y el comportamiento de las células de cáncer de páncreas. En este estudio, encontramos que el miR-130b era con frecuencia las reguladas en ambos tejidos de cáncer de páncreas y líneas celulares. También se reveló que el miR-130b suprimió la proliferación de células de cáncer de páncreas tanto
in vitro
y
in vivo fotos: por la inducción de la apoptosis y la detención del ciclo celular, así como la invasividad inhibido
In
vitro. Además, también STAT3 se caracterizó como un objetivo funcional para miR-130b.
MiRNAs se han notificado a ser importante en el cáncer de páncreas, mientras que las asociaciones con los resultados de supervivencia y clínicos son en gran medida poco clara. El análisis de supervivencia de este estudio reveló que el miR-130b desregulación correlaciona con un menor tiempo de supervivencia de los pacientes con cáncer de páncreas. Mientras tanto, los datos clínicos mostraron que el miR-130b desregulación se asoció significativamente con el tamaño grande del tumor, el estadio TNM tarde, invasión linfática y metástasis a distancia. Además, el análisis multivariado indicó que la expresión de miR-130b baja, el estadio TNM avanzado y metástasis a distancia fueron factores pronósticos significativos de una tasa de supervivencia global de los pacientes pobres con cáncer de páncreas. Por lo tanto, proponemos que nuestras observaciones proporcionan información a la importancia de miR-130b que podría ser un nuevo biomarcador para predecir el pronóstico y la progresión de los pacientes con cáncer de páncreas.
Recientemente, se cree que la modulación de miRNAs para mantener substancial potencial clínico en la terapia del cáncer [31]. Yip et al. reveló que el miR-130b downregulated fue altamente correlacionado con el fenotipo agresivo de carcinoma papilar de tiroides [18]. Yang et al. mostró que la regulación a la baja miR-130b promovió el desarrollo de cáncer de ovario resistente a múltiples fármacos en parte por la orientación de la 3'-UTR de CSF-1, mientras que el silenciamiento de miR-130b podría estar mediado por la metilación del ADN [32]. Sin embargo, los otros resultados demostraron que el miR-130b se reguló de manera significativa y actuaron como un promotor de tumores. Lai et al. demostró que miR-130 B fue obviamente sobreexpresa en el cáncer gástrico y el aumento de su sobreexpresión la viabilidad celular y la reducción de la muerte celular [13]. Liu et al. mostró que el miR-130b se sobreexpresa en el cáncer de células hepáticas y podría ser un biomarcador de suero con valores clínicos para la detección del cáncer de células hepáticas [33]. Dado que el efecto de miR-130b en el cáncer de páncreas estaba lejos de ser definido, este estudio tuvo como objetivo identificar la función de miR-130b en el cáncer de páncreas. Se encontró que la restauración de miR-130b para suprimir significativamente la proliferación de células ASPC-1 PANC-1 y por la inducción de apoptosis y detención del ciclo celular en la fase S. Por otra parte, el crecimiento de tumores de xenoinjertos fue inhibida significativamente después de ser transfectadas con LV-miR-130b. Estos resultados implicaban que miR-130b podría actuar como un inhibidor en el progreso de la carcinogénesis pancreática. Además, estos resultados mostraron heterogeneidad en la función de miR-130b que depende del tipo de cáncer y el contexto celular.
invasión y metástasis fueron las principales causas de mal pronóstico en pacientes con cáncer de páncreas. Muchos estudios han demostrado que existe una estrecha correlación entre la invasión /metástasis de cáncer de páncreas y miRNAs, como miR-20 y miR-146a [9], [34]. Por lo tanto, desentrañar el complejo papel de miRNAs en el proceso de metástasis del cáncer de páncreas podría proporcionar nuevas perspectivas para algunas consecuencias terapéuticas. Nuestros resultados clínicos mostraron que miR-130b se redujo significativamente en los pacientes con invasión /metástasis. Por otra parte, los pacientes con una mayor expresión de miR-130b fueron menos frecuentemente con la invasión /metástasis. Se identificaron además el papel de miR-130b en la invasión de células de cáncer de páncreas. Después de la restauración de miR-130b, la invasividad de las células PANC-1 y ASPC-1 fue claramente inhibida. Estos resultados implicaron intensamente que el miR-130b podría estar implicado en la progresión de la metástasis del cáncer de páncreas. Por lo tanto, los enfoques para introducir el miR-130b en células cancerosas podría ser potencialmente viable para el tratamiento clínico de cáncer de páncreas, especialmente para aquellos con una menor expresión de miR-130b en los tejidos tumorales.
STAT3, un miembro de la transducción de señales y activación de la transcripción de la familia (STAT), ha sido frecuentemente sobreexpresado en una amplia variedad de tumores humanos, incluyendo cáncer de páncreas [35] - [37]. STAT3 participa en el inicio y desarrollo de cánceres mediante la promoción de la proliferación celular, la inhibición de la apoptosis celular, la promoción de la angiogénesis, la invasión y la metástasis [38], [39]. En este estudio, se demostró una asociación molecular importante entre miR-130b y STAT3. El análisis indicó que la bioinformática STAT3 podría ser uno de los posibles objetivos de miR-130b. Los datos de la actividad de luciferasa mostraron que el miR-130b era capaz de dirigirse directamente a la 3'UTR de STAT3. Los resultados de Western Blot QRT-PCR y demostraron que la sobreexpresión de miR-130b downregulated la expresión de STAT3 en células de cáncer pancreático por tanto interferir con la degradación de mRNA y, mientras que el anti-miR-130b upregulated la expresión STAT3. Por último, la correlación inversa entre el miR-130b y la expresión de STAT3 en PC y tejidos NP, se confirmó que la regulación negativa de miR-130b dio lugar a la sobreexpresión de STAT3. Tomados en conjunto, estos datos demuestran que el miR-130b podría inhibir el crecimiento celular y la invasión de cáncer de páncreas en la orientación STAT3.
En resumen, nuestro estudio demostró que la expresión desregulada de miR-130b se asocia con un mal pronóstico y fenotipo agresivo de cáncer de páncreas. Este estudio también da a entender que el miR-130b jugó un papel importante en la regulación del comportamiento maligno cáncer de páncreas, incluyendo la proliferación celular y la invasión atacando directamente a STAT3.