Extracto
Los microARN (miRNA) son pequeños RNAs no codificantes, que pueden funcionar como oncogenes o supresor de tumores genes en los cánceres humanos. Nuevas pruebas revela que la desregulación de miRNAs contribuye al cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM). En el presente estudio, hemos demostrado que los niveles de expresión de miR-132 se redujeron drásticamente en líneas celulares de cáncer y muestras de tejidos examinados NSCLC clínicas. Luego, hemos encontrado que la introducción de miR-132 suprimió de forma significativa la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón in vitro, lo que sugiere que miR-132 puede ser una novela supresor de tumor. Otros estudios indican que el factor de transcripción relacionados ZEB2 EMT-fue uno de los genes diana directa de miR-132, evidenciado por la unión directa de miR-132 con 'no traducida (3' UTR 3) de ZEB2. Además, miR-132 podría disminuir la expresión de ZEB2 en los niveles de mRNA y proteína. En particular, el marcador EMT E-cadherina o vimentina, aguas abajo de un ZEB2, fue también regulados hacia abajo o hasta reguladas en el tratamiento de miR-132. Además, sobre-expresión o silenciamiento ZEB2 fue capaz de elevar o inhibir la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón, en paralelo con el efecto de miR-132 en las células de cáncer de pulmón. Mientras tanto, desmontables de ZEB2 revirtió el aumento de la migración y la invasión mediada por anticuerpos anti-miR-132. Estos resultados indican que el miR-132 suprime la migración y la invasión de células de NSCLC través de la orientación ZEB2 que implica el proceso de EMT. Por lo tanto, nuestro descubrimiento proporciona nueva información sobre el mecanismo de progresión de NSCLC. Terapéuticamente, miR-132 puede servir como un objetivo potencial en el tratamiento de cáncer de pulmón humano
Visto:. Usted J, Li Y, Fang N, Liu B, L Zu, Chang R, et al. (2014) miR-132 suprime la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón
a través de
Orientación de la EMT Regulador ZEB2. PLoS ONE 9 (3): e91827. doi: 10.1371 /journal.pone.0091827
Editor: Pan-Chyr Yang, Universidad Nacional de Taiwán, Taiwán
Recibido: 19 de septiembre de 2013; Aceptado: 15 Febrero 2014; Publicado: 13 Marzo 2014
Derechos de Autor © 2014 et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por las subvenciones del Proyecto clave de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.81000950), Programa Nacional 863 (No.2012AA02A201, No.2012AA02A502), Programa Nacional 973 (No.2010CB529405), Programa de Sistemas de Innovación Científica Tianjin (No.07SYSYSF05000, No.07SYSYJC27900), Fundación de china-Suecia Cooperativa (No.09ZCZDSF04100), y el Proyecto Principal de Programa de Apoyo a Sci-Tech Tianjin (No.06YFSZSF05300). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es una de las causas más comunes de muerte por cáncer en todo el mundo, y la mayoría de los cánceres de pulmón son el cáncer de pulmón de células pequeñas no (CPNM), que comprende aproximadamente el 80% de todos los cánceres de pulmón [1 ]. Los pacientes portadores de CPCNP son frecuentemente diagnosticados como una etapa avanzada, sufriendo por enfermedades metastatically o localmente avanzado, por lo que casi el 90% de los pacientes con cáncer de pulmón mueren de metástasis [2]. A pesar de grandes esfuerzos y progresiones se han hecho en el estudio del cáncer de pulmón en las últimas décadas, el mecanismo molecular de la metástasis del cáncer de pulmón sigue siendo difícil de alcanzar.
El microARN (miARN) es una clase de pequeños ARNs no codificantes, con aproximadamente 19 a 25 nucleótidos. Se regula negativamente la expresión génica a nivel post-transcripción mediante la interacción con las regiones 3 'no traducidas (3'-UTRs) de ARNm diana [3], [4]. MiRNAs son filogenéticamente conservados y juegan un papel crucial en una serie de procesos biológicos incluyendo el desarrollo, la diferenciación, la apoptosis, el metabolismo, la inmunidad y el progreso del tumor [5], [6]. Además, el aumento de la evidencia indica microRNAs pueden modular la iniciación del tumor y la progresión y la función en la invasión de células tumorales y la metástasis [7], [8], [9], [10]. Estudios anteriores han documentado los papeles de miR-132 en la regulación de la diferenciación de las neuronas de dopamina [11] y la activación del endotelio para facilitar la angiogénesis patológica [12]. En la tumorigénesis, se informa de que la regulación por disminución de miR-132 contribuye al desarrollo del cáncer de páncreas [13]. Sin embargo, el papel potencial de miR-132 en la progresión del cáncer de pulmón todavía no se ha documentado.
ZEB2 /SIP1 es un miembro de la familia deltaEF-1 de los factores a dos manos de dedos de zinc y juega un papel vital en el desarrollo de una variedad de cánceres, como el gástrico, de ovario, carcinomas de pulmón de células escamosas y no pequeñas [14], [15]. ZEB2 suprimir específicamente la expresión de E-cadherina mediante la unión a CACCT motivo (G) en el promotor de la E-cadherina durante la transición mesenquimal epithelial- (EMT) [16], [17]. Además de la E-cadherina, otros genes como placofilina 2 y ZO-3 que implican uniones célula-célula epitelial también son reprimidos por ZEB2 [18]. Recientemente, se informa que ZEB2 transcripcionalmente hasta de regular la vimentina
a través de la cooperación con SP1
durante la EMT [19].
En el presente estudio, hemos tratado de investigar el posible papel de miR-132 en metástasis de NSCLC. Encontramos que el miR-132 es el regulado en líneas celulares de cáncer metastásico de pulmón y muestras de tejidos clínicos, lo que sugiere que el miR-132 podría actuar como un supresor de tumores. Identificamos que el regulador de ZEB2 EMT es uno de los genes blanco directo de miR-132. MiR-132 es capaz de inhibir la EMT y la metástasis de las células NSCLC través de paralizar la función de ZEB2.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
El estudio fue aprobado por la Ética Comité de la Universidad médica de Tianjin, china, y presta su consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes estudiados.
líneas celulares y muestras clínicas
Las líneas de células sub, L9981 metastásico de alta y baja metastásico NL9980, fueron aislados y establecido a partir de una gran línea de células de carcinoma de células de pulmón humano [20]. El metastásico 95D y de bajo metastásico 95C alta eran sublíneas de cáncer de pulmón de células gigantes línea celular de carcinoma humano [21]. La línea celular de NSCLC YTMLC-9 [22], [23] se estableció en nuestro instituto. Estas líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con suero de ternera al 10% (Invitrogen, EE.UU.), 100 UI /ml de penicilina y 100 IU /ml de estreptomicina. La línea celular A549 NSCLC, comprado de la American Tissue Culture Collection (ATCC), cultivadas en medio DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, penicilina 100 U /ml y 100 U /ml de estreptomicina. Estas líneas de células fueron cultivadas a 37 ° C en una atmósfera húmeda con 5% de CO
2. Para las transfecciones, las células fueron cultivadas a 70% de confluencia y se transfectaron con plásmidos usando Lipofectamine2000 (Invitrogen) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
Un total de 90 casos de CPNM muestras se obtuvieron del Hospital General de la Universidad Médica de Tianjin. Todos los 90 pacientes que no habían recibido radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. Las muestras de tejido para su uso se almacenaron en nitrógeno líquido. Se utilizó el sistema de estadificación TNM de la UICC (1997) para clasificar las muestras y los tiempos de supervivencia que se calcularon a partir del día de la operación hasta la muerte a través de la evaluación de la recurrencia y metástasis hasta la última fecha de seguimiento. El seguimiento de los pacientes que sobreviven a un promedio de 32,55 meses con un rango de 1 a 96 meses. El estudio ha sido aprobado por el comité de ética del hospital. la información clínico-patológico de los pacientes sobre la edad, el tamaño del tumor, el tipo histológico, la diferenciación, la fase y la metástasis de los ganglios linfáticos se obtuvo de los registros de pacientes, que se resumen en la Tabla 1.
PCR de transcripción inversa (RT PCR), cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) y werstern Blot ensayo
ARN total extraído por el kit mirVana (Applied Biosystems, CA) fue transcrito inversamente en ADNc con la transcripción inversa del tallo-bucle imprimación para la detección de miRNA. La transcripción inversa de miR-132 y U6 control interno se realizó utilizando la transcriptasa inversa M-MLV (Takara, Japón). La PCR se realizó usando QRT-SYBR Premezcla Ex Taq (Takara) siguiendo el protocolo usando un instrumento en tiempo real precalentado (Invitrogen). Todos los cebadores se muestran en la Tabla S1. Se realizaron tres experimentos independientes para analizar las expresiones de genes relativos y cada muestra se ensayó por triplicado. Los valores de Ct se utilizaron para calcular la expresión de los niveles de ARN. La cantidad de expresión del gen diana (2
-ΔΔCt) se normalizó el uso de referencia U6.
Construcciones de plásmidos
Secuencia genómica humana de miR-132, incluyendo la secuencia de flanqueo ~ 200 pb, fue amplificado a partir de genoma humano, a continuación, insertado en el sitio BamHI /EcoRI del vector pcDNA3.1 (Invitrogen), nombrado como pcDNA3.1-miR-132. La región 3 'no traducida de longitud completa (3'UTR) del ZEB2 se amplificó a partir de ADN genómico humano, y se clonó en el de aguas abajo de la región de luciferasa de luciérnaga de PMIR-GloTM Luciferase vector (Promega, EE.UU.) que codifica. El vector recombinado fue nombrado como PMIR-ZEB2. Las mutaciones de los sitios de unión de miR-132 se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio y el vector resultante se nombran PMIR-ZEB2-Mut. Los cebadores usados para las construcciones se enumeran en la Tabla S1. Todas las construcciones fueron confirmadas por secuenciación.
Los anticuerpos y siRNAs
Los anticuerpos primarios utilizados en Western blot fueron conejo anti-ZEB2 (Santa Cruz, EE.UU.), anti-E-cadherina (Santa Cruz) , anti-vimentina (Santa Cruz) y el ratón anti-β-actina (Sigma, Aldrich, St. Louis, MO). β-actina se utilizó para la normalización. Los ARN interferentes pequeños (ARNsi) de orientación de ARNm ZEB2 humano, control negativo siRNA (siCONTROL), miR-132 inhibidor de control negativo (anti-miR-132), y el inhibidor (anti-miR-NC) fueron adquiridos de Ruibobio (Guangzhou, China ). Todas las secuencias de oligonucleótidos se enumeran en la Tabla S1. Se realizó
La migración celular y la invasión ensayos
Herida ensayo de curación para analizar la migración celular como se describe anteriormente [24]. ensayos de cámara de Boyden se utilizaron para examinar la capacidad de invasión de células. Las células fueron transfectadas con 1 g de pcDNA3.1 o pcDNA3.1-miR-132 vector. Dieciséis horas después, las células transfectadas se trataron con tripsina y se resuspendieron. 1.0 × 10
5 células en 300 l de medio de cultivo se colocaron en las cámaras superiores (Millipore). Las cámaras inferiores se rellenaron con 500 l de medio completo con 10% de FBS. Después de la incubación durante 12 horas a 37 ° C, las células no invasoras se eliminaron de la parte superior de la cámara con un hisopo de algodón. Las células migratorias sobre la superficie inferior de los insertos fueron fijadas y teñidas con 0,1% de cristal violeta, y cinco campos aleatorios para cada inserto se contaron a 100 × aumentos.
informador de luciferasa Ensayo del gen
las células adherentes se sembraron en placas de 24 pocillos y co-transfectaron con 200 ng de PMIR-ZEB2 o vector PMIR-ZEB2-Mut y 80 ng de pcDNA3.1-miR-132 vector o vectores pcDNA 3.1 vacías, y la pRL-TK plásmido (Promega, Madison, WI) que se utiliza como normalización interna. Las células se recogieron después de 36 horas y se lisaron usando tampón de lisis (Promega). ensayo de gen informador de luciferasa se llevó a cabo utilizando el sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
Análisis estadístico
Cada experimento se repitió al menos tres veces. La significación estadística se evaluó mediante la comparación de los valores medios (± DE) utilizando
t-
prueba de Student para grupos independientes y se supuso para
p Hotel & lt; 0,05 (*) y
p
. & lt; 0,01 (**)
Resultados
miR-132 es frecuentemente reducido regulado en células altamente metastásico del cáncer de pulmón y muestras de tejido
evaluó la expresión de miR-132 de QRT-PCR en varias líneas celulares de cáncer metastásico con capacidades distintas. Se encontró que los niveles de miR-132 exhibieron un patrón que varía en estas líneas celulares. En particular, la expresión de miR-132 en L9981 altamente metastásico y 95D células se redujo drásticamente, con relación a la de los correspondientes NL9980 o celulares 95C líneas mal metastásicos, respectivamente (Figura 1A). Además, se detectó la expresión de miR-132 en 45 emparejados clínica de tejido de cáncer de pulmón primario y muestras de tejido de cáncer de ganglios linfáticos metastásicos. En comparación con sus homólogos primarios, las muestras de tejido de los ganglios metastásicos albergaban un significativo bajos niveles de miR-132 (Figura 1B,
P Hotel & lt; 0,001, estudiante de
t-test
). Además, el análisis de las características clínico-patológicas de los pacientes con CPNM demostraron que la expresión de miR-132 tenía una correlación significativa con el estado de los ganglios linfáticos (Tabla 1,
P = 0,011
). Estos datos indican que la reducción de la expresión de miR-132 es un evento frecuente en células de NSCLC y tejidos altamente metastático, que puede estar implicado en la metástasis de las células cancerosas de pulmón humano.
(A) Los niveles de ARNm relativos de miR-132 se detectó por qRT-PCR y se normalizó contra un control endógeno (U6 RNA) en varias líneas celulares de cáncer de pulmón con capacidad metastásica distinta. Los datos se presentan como media ± desviación estándar de tres experimentos independientes (**
P Hotel & lt; 0,01, Estudiante de
t CD - prueba). (B) Análisis de QRT-PCR de la expresión de miR-132 en 45 pares de tejidos con CPNM primarios y sus metástasis en los ganglios linfáticos correspondiente. MiR-132 expresión en esos dos tipos de tejidos se comparó a modo de Wilcoxon prueba (***
P Hotel & lt; 0,001, de Student
t CD - prueba).
miR-132 es capaz de inhibir la migración y la invasión de células de NSCLC in vitro
a continuación, probamos el significado funcional de miR-132 en células de NSCLC. Wound ensayo de curación mostró que la expresión ectópica de miR-132 en células de cáncer de pulmón L9981 o la migración de células A549 inhibió significativamente, en comparación con el grupo control (Figura 2A). Adicionalmente, se realizó el ensayo de cámara de Boyden para investigar el efecto de miR-132 en la invasión de células. Como se muestra en la Figura 2B y 2C, cuando transfectadas con pcDNA3.1-miR-132 plásmidos, la capacidad de invasión de las células A549 mostró una disminución sobre-3 veces, en comparación con el grupo control. Sin embargo, las células mostraron un aumento de la invasión en el tratamiento de miR-132 inhibidor (Figura 2B, 2C). Además, se observaron resultados paralelos en los 95D y las líneas celulares L9981 (Figura 2C). Tomados en conjunto, los datos sugieren fuertemente que el miR-132 es capaz de suprimir la migración y la invasión de células de NSCLC
in vitro
.
(A) La cicatrización de la herida o se utilizó para detectaron la migración capacidad de las células L9981 y A549, respectivamente. (B, C) se empleó ensayo de cámara de Boyden para examinar la capacidad de invasión 95D, L9981, y las células A549, respectivamente. Los resultados fueron de tres experimentos independientes (*
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01, Estudiante de
t CD - prueba). El número de células migratorias en cada grupo se normalizó con el control. Las células fueron transfectadas con pcDNA3.1 (NC) o pcDNA3.1-miR-132 (miR-132) construye, y miR-132 inhibidor (anti-miR-132) o el control inhibidor (anti-miR-NC). Las células A549 migratorias en las cámaras inferiores de un experimento se muestran en B.
miR-132 inhibe directamente la expresión de ZEB2 a través de su 3'UTR y regula la EMT de células de NSCLC
Para detectar el mecanismo molecular por el que el miR-132 suprime la metástasis de las células del cáncer de pulmón, que predijo los genes diana putativos de miR-132 en células humanas utilizando la herramienta
Miranda
,
PicTar
y
TargetScans
. Entre los candidatos predichos, ZEB2 era de interés en este estudio, teniendo en cuenta los papeles cruciales de ZEB2 en el desarrollo de los cánceres humanos [14], [15]. Para probar si miR-132 se dirige directamente a ZEB2 (Figura 3A), el tipo salvaje o mutante secuencia de 3 'UTR de ZEB2 se clonó en PMIR vector reportero, respectivamente, como se muestra en la Figura 3B. La actividad luciferasa de pMIR- ZEB2 constructo 3 'UTR-peso se redujo significativamente en la expresión excesiva de miR-132 en células NL9980, mientras que su homólogo mutante no era (Figura 3C). Es de destacar que el niveles de proteína de ZEB2 en L9981 o ARNm o 95D células se redujeron drásticamente por el miR-132, respectivamente (Figura 3D, 3E y 3F). Se ha informado de que ZEB2 es un inductor de vital importancia EMT a través de la supresión de E-cadherina o inducir la expresión de vimentina en el cáncer humano [16], [19]. Para confirmar aún más que los ZEB2 actúa como un objetivo de miR-132, examinamos el efecto de miR-132 en esos dos efectores de ZEB2 por Western blot. Como se muestra en la Figura 3E y 3F, el fabricante de EMT E-cadherina o vimentina fue dramáticamente hasta reguladas o hacia abajo-regulado a la sobreexpresión de miR-132 en ambos L9981 y 95D células. Tomados en conjunto, estos datos indican que el miR-132 inhibe directamente la expresión ZEB2
a través de la orientación de su
'UTR 3 e induce la EMT de células de NSCLC.
(A) El sitio de unión de miR-132 en predijo el 3'UTR de ZEB2 mRNA. (B) mutante se genera en la región de la semilla de ZEB2 3 'UTR tal como se indica por el subrayado. Un fragmento 3 'UTR de ZEB2 mRNA que contiene de tipo salvaje o mutante de la secuencia de unión a miR-132 se clonó en el de aguas abajo del gen de la luciferasa en PMIR vector. Las células L9981 (C) fueron transfectadas con vectores indicadores PMIR que contienen ya sea de tipo salvaje o mutante ZEB2 3'UTR (indicado como PMIR-ZEB2-3 'UTR-peso y PMIR-ZEB2-3' UTR-mut), ya sea con pcDNA3.1 (indicado como Carolina del Norte) o pcDNA3.1-miR-132 vector (indicado como miR-132). La actividad de luciferasa se determinó 48 h después de la transfección. (D) ZEB2 mRNA se detectó mediante qRT-PCR en líneas celulares transfectadas con pcDNA3.1 (indicado como Carolina del Norte) o pcDNA3.1-miR-132 vector (indicado como miR-132). (E, F) Los niveles de proteína de ZEB2, E-cadherina o vimentina fue examinado por Western blot en células transfectadas con plásmidos diferentes. Figura F muestra los valores de gris relativas de cada banda (normalizado a ß-actina). Las bandas de proteínas a partir de tres ensayos de Western blot independientes se cuantificaron utilizando software Quantity One (Bio-Rad, EE.UU.). Los datos se presentan como media ± desviación estándar (**
P Hotel & lt; 0,01, de Student
t CD - prueba).
ZEB2 Contribuye a miR-132- suprimido la migración y la invasión de células NSCLC
a continuación, se analizó la expresión de ARNm o proteína de ZEB2 en varias células de NSCLC, así como 45 casos de cáncer de los tejidos pulmonares primarios y tejidos de ganglios linfáticos metastásicos. Los datos revelaron que el nivel de proteína de ZEB2 en la L9981 altamente metastásico o 95D células fue notablemente hasta reguladas, en comparación con el mal NL9980 metastásico o 95c células, respectivamente (Figura 4A). Además, se observó el mismo resultado de los niveles de mRNA de ZEB2 en los tejidos de ganglios linfáticos metastásicos, en relación con los tejidos de cáncer de pulmón primario (Figura 4B). Es de destacar que la expresión de ZEB2 muestra una correlación inversa con el nivel de miR-132 en los tejidos de NSCLC (Figura 4C). A continuación, se investigó si ZEB2 es fundamental para la migración y la invasión de células de NSCLC. La expresión ectópica de ZEB2 en NL9980 o 95c células invasión de células significativamente mayor (Figura 4D), sin embargo, silenciando ZEB2 por siRNAs en células L9981 resultó en una disminución migración y la invasión capacidad de las células (Figura 4E, 4F), revelando sus papeles positivos en el la contribución de la migración celular y la invasión NSCLC. Mientras tanto, la transfección o silenciar la eficiencia de ZEB2 en las células se detectó por Western blot (Figura 4D y 4F,
menor
). Luego, hemos accedido si el efecto funcional de miR-132 en células de NSCLC dependía de ZEB2. Como se muestra en la Figura 4G y 4H, la introducción de anti-miR-132 en células NL9980 conducido a un aumento de la migración celular y la invasión, mientras que el silencio de ZEB2 por siRNAs abolió parcialmente la mejora. Al mismo tiempo, el nivel de proteína de ZEB2 fue confirmada por Western blot (Figura 4H,
menor
). En conjunto, estos resultados sugieren que ZEB2 funciona como un objetivo de miR-132, responsable de la regulación mediada por el miR-132 de la migración y la invasión de células de NSCLC.
(A) La expresión de ZEB2 fue examinado por Western borrar en las células NSCLC. (B) Se detectaron los niveles relativos de ARNm de ZEB2 en 45 tejidos tumorales de NSCLC primario pareadas y sus homólogos de metástasis en los ganglios linfáticos. ZEB2 expresión en esos tejidos se comparó a modo de prueba de Wilcoxon firmado-rank (***
P Hotel & lt; 0,001, prueba de la t de Student). (C) la correlación inversa entre el miR-132 y la expresión en los tejidos ZEB2 NSCLC. expresión ZEB2 se analizó mediante qRT-PCR y normalizado para GAPDH. La expresión de miR-132 se detectó por análisis de QRT-PCR y se normalizó a la expresión U6. El análisis estadístico se realizó mediante el coeficiente de correlación de Pearson (r = -0.68, ***
P Hotel & lt; 0,001). (D) La invasión de células se detectó mediante un ensayo de cámara de Boyden en NL9980 o 95c células transfectadas con vectores pCMV o pCMV-ZEB2, respectivamente. (E, F) El efecto de ZEB2 caída en la migración celular o invasión fue evaluada por la curación de heridas o la cámara de Boyden ensayo, respectivamente (**
P Hotel & lt; 0,01, de Student
t CD - prueba). Además, la eficiencia de silenciamiento de ZEB2 por siRNA se examinó por transferencia de Western. (G, H) La cicatrización de la herida o ensayo de cámara de Boyden se utilizó para detectar la capacidad de migración o invasión de células NL9980 con diferentes tratamientos, respectivamente (*
P
& lt; 0,05, **
P
& lt; 0,01, Estudiante de
t CD - prueba). Además, la eficiencia de silenciamiento de ZEB2 de siRNA fue examinado por Western blot.
Discusión
Nuestro grupo se ha centrado en el mecanismo molecular del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) desarrollo en los últimos años, especialmente dedicando a la investigación de NSCLC metástasis. MiRNAs están involucrados en la patogénesis de NSCLC y sus perfiles de expresión se han utilizado para clasificar los tipos de cáncer [25], [26], [27]. Por lo tanto, se esperaba que el dyregulation de microRNAs relacionados con metástasis puede facilitar el progreso avanzado de NSCLC. Miao LJ,
et
,
al. Hola, ha encontrado que el miR-449C podría inhibir la invasión de células de NSCLC por la orientación de c-Myc ARNm [28]. Además, deshuesado Liu,
et al.
Informó que el miR-26a puede promover la metástasis de las células de cáncer de pulmón a través de la activación de AKT por la orientación PTEN [29]. MiR-132, que surge de la agrupación de miR-212/132 [30], se ha documentado un papel en la promoción del desarrollo del cáncer pancreático
a través de la activación de AKT
vía de señalización [31]. Sin embargo, la función de potencial de este microRNA en la progresión del NSCLC humano tiene pocos informes. En el presente estudio, estamos interesados en el papel potencial de miR-132 en la metástasis de células de NSCLC.
En este estudio, encontramos que el miR-132 era con frecuencia las reguladas en líneas celulares de cáncer altamente metastásicas y muestras de tejido. Por lo tanto, se supone que el miR-132 puede ser una novela supresor de tumores de miARN y su dyregulation puede implicar el progreso avanzado de cáncer humano. Además, en la tumorigénesis inicial, Shuyu Zhang y su colega encontraron que miR-132 ejerce los bajos niveles de expresión en los tumores pancreáticos primarios y puede estar asociada con el desarrollo temprano de cáncer de páncreas humano [13]. Sin embargo, el papel potencial de miR-132 en la progresión temprana de NSCLC aún deben investigarse más a fondo. Para el mecanismo de participación de miR-132 baja regulación, Shuyu Zhang,
et al.
Informó de que la hiper-metilación de la región promotora era responsable de la reducción de la expresión de miR-132 [13]. En consecuencia, se especuló que esta modificación del ADN podría causar la alteración de la expresión de miR-132 en NSCLC humano.
A continuación, se investigó la función de miR-132 en el CPNM. Nuestros datos muestran que la reintroducción de 132 reprimido drásticamente la migración celular y la invasión de células de NSCLC
in vitro
. Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la disminución de expresión de miR-132 puede contribuir a la metástasis de las células de cáncer y facilitar por consiguiente el desarrollo avanzado de cánceres humanos como NSCLC. Nos ZEB2 caracteriza además como un objetivo funcional de miR-132 por ensayos de reportero de luciferasa de genes, RT-PCR y análisis de transferencia Western, respectivamente. ZEB2 /SIP1, como un miembro de la familia deltaEF-1 de dos manos factores de dedos de zinc, se expresa con frecuencia en una variedad de cánceres humanos, incluyendo páncreas [31], de mama [32], gástrico [33], [34 ], renal [35], de cabeza y cuello [36], glioma [37], hepatocelular [38], [39] de ovario, carcinomas de pulmón de células escamosas y no pequeñas [14], [15]. El papel importante del factor de transcripción ZEB2 ha sido fuertemente subrayado en numerosos trabajos, debido a su función en la inducción de transición mesenquimales epithelial- (EMT) y facilitar la metástasis de las células del cáncer [37], [40], [41]. Por ejemplo, Nam EH,
et al
. informó que ZEB2 podría inducir la EMT y la invasión de las células cancerosas humanas
a través de
reprimir específicamente la expresión de E-cateherin y hasta la regulación de la expresión de vimentina [42]. Además, Cong N y su colega descubrieron que las reguladas microARN-200 de la familia era capaz de promover la EMT a través de la vía Wnt /β-catenina por la orientación represores E-cadherina ZEB1 /ZEB2 en el adenocarcinoma gástrico [33]. En el presente estudio, hemos encontrado que ZEB2 tenía una frecuencia alta expresión en células de NSCLC metastásico y tejidos de ganglios linfáticos clínicos. Y ZEB2 era responsable de la migración modulada-miR-132 y la invasión de células de NSCLC. En particular, se observó que la E-cadherina o vimentina, el efector aguas abajo de ZEB2, fue también regulados hacia abajo o hasta reguladas por el miR-132, lo que indica que el miR-132 puede ejercer funciones en la migración y la invasión de células de NSCLC través de la modulación de la EMT. Estos
in vitro
datos implícitas la necesaria contribución de las atenuada de miR-132 en la promoción de la metástasis en el cáncer de células. Estudios recientes revelaron una transición epitelial mesenchymal- (MET) en las metástasis que permitieron el establecimiento de células de cáncer en un sitio remoto [43]. Sin embargo, el papel potencial de miR-132 en este proceso todavía hay que ilustra adicionalmente.
En resumen, hemos investigado el papel de miR-132 en el desarrollo de NSCLC. Nuestro hallazgo sugiere que el miR-132 puede ser una novela supresor de tumores de miARN. MiR-132 bloquea la migración y la invasión de células de NSCLC mediante la focalización ZEB2 regulador de la EMT. Nuestros datos proporcionan nuevos conocimientos sobre el mecanismo responsable del desarrollo de NSCLC humano. Además, el miR-132 puede servir como un candidato potencial terapéutico en el tratamiento del NSCLC.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Los cebadores usados en el documento se enumeran
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091827.s001 gratis (DOC)