Extracto
microARN-135a (miR-135a) hacia abajo-modula los parámetros de la progresión del cáncer y su expresión está disminuida en los cánceres de mama metastásicos (en comparación con los tumores no metastásicos), así como en tumores de próstata en relación con el tejido normal. Estos patrones de expresión y de actividad son opuestas a las de los receptores de estrógenos relacionada α (ERRα), un miembro huérfano de la familia de receptores nucleares. De hecho la alta expresión de ERRα se correlaciona con mal pronóstico en los cánceres de mama y de próstata, y el receptor promueve diversos rasgos de la agresividad del cáncer, incluyendo la invasión celular. Aquí nos muestran que el miR-135a regula a la baja la expresión de ERRα a través de secuencias específicas de su 3'UTR. Como consecuencia de miR-135a también reduce la expresión de objetivos de abajo ERRα. miR-135a también disminuye el potencial invasivo de células de una manera dependiente de ERRα. Nuestros resultados sugieren que la disminución de expresión de miR-135a en los tumores metastásicos conduce a la expresión ERRα elevada, lo que resulta en un aumento de la capacidad de invasión de células
Visto:. Tribollet V, Barenton B, Kroiss A, S Vicente, Zhang L, Forcet C, et al. (2016) miR-135a inhibe la invasión de las células cancerosas a través de represión de ERRα. PLoS ONE 11 (5): e0156445. doi: 10.1371 /journal.pone.0156445
Editor: Franky L. Chan, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong
Recibido: 28 Enero de 2016; Aceptado: 13-may de 2016; Publicado: 26 de mayo de 2016
Derechos de Autor © 2016 Tribollet et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. Todo relevante los datos están dentro del papel y su archivo de información de apoyo
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Ligue contre le Cancer (comités Puy-de-Dôme https://www.ligue-cancer.net/cd63/journal y Drôme https://www.ligue-cancer.net/cd26/journal) de JS y JMV. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Jean-Marc Vanacker es un miembro de la junta editorial PLoS ONE. Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas y criterios editoriales
Introducción
Los microARN (MIR) son pequeños ARN no codificantes que, a través de una llamada "caja de la semilla". unirse a secuencias complementarias específicas en el 3'UTR del ARNm diana e inducir su degradación o bloquear la traducción de la proteína codificada [1]. Dado el tamaño corto de la región de unión a ARNm en MIR y dado que el miR imperfecta unión es en algunos casos suficientes para inducir la regulación del ARNm, un individuo de miR puede actuar sobre varios ARNm. Esto plantea la posibilidad de que una vía de todo /proceso puede ser controlado a varios niveles a través de un único MIR. MIRS puede promover o reprimir el cáncer de iniciación o progresión, y la desregulación de su expresión es una característica común en estos procesos [2-5]. Human miR-135a es codificada por dos genes localizados en cromosomas diferentes (3 y 12 para miR-135a1 y miR-135a2, respectivamente), produciendo una secuencia idéntica, activo. Resultados contradictorios se han publicado sobre los efectos de miR-135a en la progresión del cáncer. Los informes indican, en efecto que este microARN podría promover o reprimir diversas características relacionadas con la agresividad del tumor, como la proliferación, la migración celular y la invasión en líneas celulares de colon, melanoma, cáncer de mama o cáncer de próstata [6-12]. Sin embargo, se demostró que la expresión de miR-135a está fuertemente disminuida en tumores de mama metastásico (en comparación con tipos de cáncer no metastásico, [10]), así como los tumores en la próstata con respecto al tejido normal [11], lo que sugiere que, al menos en estos tumor tipos, miR-135a contrarresta la progresión del cáncer. A este respecto, re-expresión de miR-135a en las células que no expresan reduce su potencial invasión. Se han propuesto al menos tres mecanismos moleculares para dar cuenta de esta reducción. Dependiendo del estudio y en el modelo celular, miR-135a de hecho se ha demostrado que disminuye la expresión de FAK, Runx2 y Rock1 /2, todas las normas que conducen a una reducción de la invasión celular [9-11].
el receptor de estrógeno relacionada con α (
ESRRA
, en lo sucesivo, ERRα) es un miembro de la superfamilia de receptores nucleares. Como tal, se muestra un dominio de unión a ADN conservado situado en el centro, así como un dominio de unión al ligando putativo C-terminal se encuentra que los contactos co-activadores y es necesario para la activación transcripcional [13]. Sin embargo no ligando natural de ERRα se ha identificado hasta la fecha. ERRα este modo se conoce como un receptor "huérfano" y activa la transcripción de sus genes diana de una manera aparente independiente de ligando. ERRα regula varios procesos fisiopatológicos
in vivo
tales como la diferenciación de osteoblastos y la formación ósea (revisado en [14]), la inmunidad innata [15-16] y el metabolismo energético (revisado en [17-18]). Además, la alta expresión en los cánceres ERRα se correlaciona con un mal pronóstico en varios tipos de cáncer ([19-25], revisado en [26-28]). Consistentemente, ERRα se ha demostrado que la promoción de varios rasgos de la progresión del cáncer, que van desde la proliferación [29-30], un epitelio-mesenquimal transición [31], la resistencia a la hipoxia [32], angiogénesis [33], interruptor metabólico a la glucólisis aeróbica [34 -35], la migración celular y la invasión [36-37]. ERRα aumenta la invasión celular a través de al menos dos mecanismos moleculares. Por un lado, el receptor se activa la cascada de hecho Wnt11-dependiente, en otra parte, ERRα indirectamente afina la estabilidad de RhoA a un nivel que es apropiado para la migración celular y la invasión orientado.
Aquí nos muestran que la reintroducción de miR-135a en células da como resultado que no expresa en la baja regulación de la expresión ERRα en los niveles de ARNm y proteínas. Esto ocurre a través de secuencias 3'UTR que son complementarias a la tolva de semillas de miR-135a. En consonancia, la expresión de ERRα apunta a genes es modulada por el miR-135a de manera ERRα-dependiente. Además, miR-135a sobre-expresión disminuye la capacidad de invasión de MDA-MB231 y células PC3 (células mamarias y carcinoma de próstata humano, respectivamente). Estas capacidades pueden ser rescatados por la re-expresión de un constructo ERRα que no está dirigido por el miR-135a. En conjunto, esto apunta a ERRα como un objetivo alternativo de miR-135a involucrados en la regulación de la invasión de células.
Materiales y Métodos
Células y Reactivos
MDA-MB231 (humana células epiteliales mamarias) y PC3 (células de la próstata humanos) se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) suplementado con suero de ternera fetal 10%, 10 U /ml de penicilina, 10 mg /ml de estreptomicina. LNCaP (célula de próstata humano) se cultivaron en RPMI (Invitrogen) suplementado de la misma manera. Las células se mantuvieron en una atmósfera de CO2 al 5% humidificada a 37 ° C. siRNAs y miRNAs se introdujeron en las células usando Interferine (Ozyme) o Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), respectivamente, siguiendo las instrucciones de los fabricantes. ERRα siRNAs (secuencias en la Tabla S1) eran de Invitrogen (siERRα#1) y Dharmacon (siERRα 2 #). Pre-miRNAs (PM11126 para miR-135a; control negativo de miR n ° 2) fueron de Ambion
Expresión Análisis
ARN totales se extrajeron mediante tiocianato de guanidinio /fenol /cloroformo y se convierte en primer lugar. hebra de ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc iScript (BioRad). PCR en tiempo real se realizó en una placa de 96 pocillos usando el IQ SYBR Green Supermix (Biorad). Los datos se cuantificaron por el método ΔΔ Ct-y normalizado a RPLP0 (36B4) mRNA. Secuencias de los cebadores utilizados en este estudio se muestran en la Tabla S1.
Para el análisis de transferencia Western, las células se lisaron en tampón RIPA. Las proteínas (50 g) se resolvieron en 10% SDS-PAGE, se transfirieron a PVDF (Millipore), se sondaron con anticuerpos específicos después de la saturación y revelaron utilizando un aumento de quimioluminiscencia sistema de detección (kit ECL, Amersham Biosciences) con peroxidasa apropiado específico Abs conjugado. Los anticuerpos fueron de Gentex (ERRα, GTX108166), Enzo (Hsp90, ADI-SPA-830) y Sigma (Bandera, F-3165).
Los plásmidos y luciferasa Los ensayos
pSG5Flag-? A /B-ERRα se ha descrito en otra parte [38]. Secuencias en ESRRA (que codifica ERRα) 3'UTR que son complementarias a la tolva de semillas de miR-135a se prevé utilizar TargetScan (http://www.targetscan.org), PicTar (http://pictar.mdc-berlin.de) y MiRBase de Miranda (http://microrna.sanger.ac.uk) on-line de los programas disponibles. Un fragmento de 400 pb de la humana ESRRA 3'UTR abarcando tanto predijo secuencias complementarias se clonó por PCR utilizando MDA-MB231 originario retrotranscrito mRNA y los cebadores, flanqueada por sitios de restricción XhoI y SalI. Las secuencias complementarias se mutaron por PCR recombinante. Después de la verificación por secuenciación, de tipo salvaje y fragmentos mutados se clonaron en pmiRGLO vector de expresión dual (Promega) como inserta aguas abajo de la secuencia de indicador de luciferasa de luciérnaga XhoI-SalI. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados para la mutagénesis están disponibles en el cuadro S1.
Para las transfecciones transitorias, 10
5 células MDA-MB231 se sembraron en placas de 24 pocillos y se transfectaron usando Lipofectamine 2000, 50 ng de plásmido y el pmiRGLO cantidad indicada de pre-MIR. Las células fueron zadas 48 h después de transfección y actividades reportero (Renilla y luciérnaga luciferasas) se determinaron utilizando métodos estándar.
Invasión ensayos
Para los ensayos de invasión, las células (5. 10
4) se suspendieron en 200μl DMEM /FCS al 2% y se sembraron en la parte superior de las cámaras de invasión de matrigel (Corning). Las células se dejaron migrar hacia la cámara inferior que contiene DMEM /10% FCS durante 48 horas. Matrigel se eliminó usando bastoncillos de algodón y las células se fijaron 1 h con 4% de formaldehído, coloreado con 0,1% de cristal violeta y microphotographed. células invasoras se contaron en su conjunto así el uso de imagen J.
Análisis estadístico
La significación estadística se determinó mediante pruebas t de Student entre los grupos.
Resultados
miR-135a Disminuye ERRα expresión
Durante el curso de un estudio previo, las consecuencias de pre-miR-135a sobre-expresión en células de cáncer de próstata humano LNCaP se analizó en términos de expresión de genes celulares utilizando un micro-array enfoque [11]. Se observó que la expresión de la receptor nuclear huérfano ERRα se redujo a tal tratamiento. Para validar estos resultados, transfectadas transitoriamente pre-miR-135a en las células LNCaP y analizamos la expresión de la proteína ERRα (Figura 1a). Se encontró que el nivel de este receptor se redujo tan pronto como 24 h después de la transfección, un efecto que persistió (aunque en menor medida) por 48 h. Resultados similares se obtuvieron también en células de carcinoma de mama humano MDA-MB231. El ARNm ERRα-correspondiente también se redujo 24h y 48h después de la transfección en células LNCaP tanto y MDA-MB231, a juzgar por los experimentos en tiempo real PCR (Figura 1B), lo que sugiere un efecto directo sobre el ARNm
.
La células indicadas fueron transfectadas con pre-miR-135a o el control pre-MIR (-) durante el tiempo indicado. a. La expresión de las proteínas indicadas determinados por transferencia de western. Hsp90 se utilizó como control de carga. La cuantificación de la expresión de la proteína ERRα (que se muestra por debajo de los borrones) se expresa en relación al de hsp90, que se utiliza como control de carga. segundo. La expresión de ARNm correspondientes ERRα analizados por PCR en tiempo real. Los datos se presentan en relación con pre-miR muestras de control y se expresan con relación a la expresión de RPLP0. Se muestra la media de experimentos llevados a cabo tres veces. Errores barras indican la SEM. ***:
p Hotel & lt; 0,005
Se analizó el ARNm ERRα humano por motivos de reconocimiento de microARN utilizando tres programas de predicción independientes (TargetScan, PicTar y Miranda), que produjo idénticos. resultados. Dos secuencias complementarias potenciales para miR-135a se identificaron en el 3'UTR de la más alta (8-mer) probabilidad de unión (Fig 2a). Cabe destacar la secuencia así como la posición de estos dos sitios están muy conservadas en mamíferos, pero no en las aves o anfibios, donde se pudo identificar tal secuencia no correspondiente. Para determinar si estas secuencias complementarias son funcionales para el reconocimiento de miR-135a, un fragmento de 400 pb de la UTR 3 '(que abarca ambas secuencias potenciales) fue clonado aguas abajo del gen indicador de luciferasa en pmiRGLO plásmido. Después, cada secuencia complementaria se mutó solo o en combinación. Las construcciones resultantes se transfectaron en las células MDA-MB231 junto con pre-miR-135a (Fig 2b). El fragmento salvaje derivada de ERRα tipo confiere sensibilidad miR-135a, lo que resulta en una disminución del 50% en la actividad de reportero. Este efecto se suprimió en la mutación de secuencia complementaria 2, pero no la secuencia complementaria 1. Esto sugiere fuertemente un efecto directo de miR-135a en el 3'UTR de ERRα, en particular, en secuencia complementaria 2, dando como resultado niveles disminuidos de los ARNm correspondientes y proteínas.
a. Las secuencias complementarias 1 y 2 (mayúsculas) en ERRα 3'UTR se muestran para las especies indicadas (
Homo sapiens
,
Mus musculus
,
Bos taurus Opiniones y
Felis silvestris
) y alineado con la secuencia de miR-135a. Posición del primer nucleótido de cada secuencia complementaria (cs 1 y 2) se indica con relación a la primera de nucleótidos 3'UTR y relativo al inicio de ARNm humano (en paréntesis). Los nucleótidos en negrita se han eliminado en los mutantes correspondientes. segundo. Esquema de los mutantes generados en PMIR-GLO se representa en la parte superior. Las células MDA-MB231 se transfectaron transitoriamente con los derivados PMIR-GLO correspondientes junto con la concentración indicada de pre-miR-135a. Las actividades de luciferasa se determinaron 48 h después de la transfección y la actividad de luciferasa de luciérnaga se normalizó a la de la luciferasa de Renilla. Los resultados se expresan para cada plásmido como porcentaje en relación con la transfección con el control pre-MIR y representan la media de tres experimentos independientes. Errores barras indican SEM. **:
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p Hotel & lt; 0,005
miR-135a Regula ERRα moleculares y celulares Actividades en el
Para analizar las consecuencias de esta regulación, se examinó si las funciones de ERRα pueden verse afectados por el miR-135a. ERRα actúa como un factor de transcripción y sus objetivos de genes en las células MDA-MB231 previamente han sido identificados a través de un enfoque transcriptómica RNA-secuenciación [37]. Estamos motivado que la sobreexpresión de miR-135a, lo que lleva a una disminución de los niveles de ERRα, también debe dar lugar a la desregulación de la expresión de estos genes diana. Esta hipótesis fue examinado en nueve genes seleccionados, que son, según nuestro enfoque transcriptómica, ya sea positiva (DHX33, GDAP1, RAB39A, RAPGEF5, TMEM198 y TNFAIP1) o negativamente (PDGFRB, RRAS, CEACAM1) regulada por ERRα. Es importante destacar que estos genes fueron seleccionados ya que no se prevé como objetivos directos de miR-135a, según TargetScan programa en línea. El uso de dos ARNsi diferente contra el receptor, primero se verificó que la expresión de estos genes está desregulado en ausencia de ERRα (Fig 3a). A continuación, analizó el nivel de mRNA de estos objetivos ERRα a la sobreexpresión de miR-135a. Como se muestra en la figura 3b, la expresión de estos genes era dependiente del tiempo regulado por transfección de pre-miR-135a. Es de destacar que todas las desregulaciones inducidas por el miR-135a se encontraban en la misma dirección que las inducidas por la orientación directa ERRα. Esto refuerza aún más la hipótesis de que el efecto de miR-135a en estos genes es mediada por ERRα. También se analizó la expresión de cuatro genes (Rock1, Rock2, PTK2 y Smad5) reportó como objetivos directos de miR-135a en la literatura [10-11, 39]. Como se esperaba, la expresión de estos genes es dependiente del tiempo reducido sobre pre-miR-135a sobreexpresión (figura 3c). Sin embargo, ninguno de estos cuatro genes parecen desregulado en la ausencia de ERRα, como se espera de nuestros datos RNA-secuenciación (Fig 3c y [37]). A continuación, utiliza un enfoque de rescate a cuestionar la posibilidad de un efecto ERRα dependiente de miR-135a. Con este fin, las células fueron transfectadas por un imitador de miR-135a complementado o no por un constructo ERRα que no comprende su 3'UTR naturales (
i
.
e
. MiR-135a sin secuencias complementarias). En consonancia, la desregulación de los objetivos ERRα fue rescatado por la reintroducción del receptor (Figura 3d). Por el contrario, la expresión de miR-135a objetivos directos (Rock1, Rock2, PTK2 y Smad5), la reducción a la sobreexpresión de la pre-Mir, no fue restaurada por ERRα transfección. En conjunto, estos datos muestran que los impactos de miR-135a sobre la expresión génica en los modales ERRα-dependientes e independientes.
-
a. células MDA-MB231 se transfectaron con el siRNA se indica (c: controlar siRNA) y el ARN se extrajeron después de 48 h. segundo. Las células fueron transfectadas con pre-miR-135a o el control pre-MIR (-). ARN se extrajeron en el momento indicado después de la transfección. Se examinó la expresión de los objetivos ERRα (a, b). do. El mismo experimento el análisis de la expresión de genes diana miR-135a directos. re. Las células fueron transfectadas por el pre-miR-135a y pSG5Flag vector vacío (miR-135a) o ERRα plásmido que codifica (miR-135a + ERRα). Como controles, las células fueron transfectadas por el control pre-MIR suplementado con pSG5Flag plásmido vector. ARN se extrajeron después de 48 h. La expresión de los genes indicados se determinó mediante PCR en tiempo real. Los datos se presentan con relación al control y expresan en relación a la expresión de RPLP0. Se muestra la media de tres experimentos independientes por triplicado con barras de error indican SEM. *:
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p Hotel & lt; 0,005, ns:. No significativa
a continuación se preguntó si los efectos funcionales de miR-135a podría depender de ERRα. Este receptor se ha demostrado que se requiere para varios rasgos relacionados con la progresión del cáncer, incluyendo la migración celular y la invasión [36-37]. Por otra parte miR-135a se ha demostrado que reduce la invasión de células [9, 11]. Uso de Boyden ensayos de cámara de invasión, de este modo, examinamos si parte de estas últimas actividades puede estar mediada por la inhibición ERRα. Sobreexpresan miR-135a imitar en las células MDA-MB231 conducido a una reducción de la expresión ERRα, así como a la inhibición de la invasión de células, en comparación con los controles (Fig 4a). Por el contrario, la re-expresión de una ERRα no ser objeto de orientación construir potencial invasión de células completamente restaurado. experimentos idénticos realizados en la línea celular de próstata humano PC3 dieron resultados similares (Figura 4b). Concluimos que miR-135a puede inhibir la invasión de células, al menos en parte, a través de la inhibición de la expresión ERRα.
MDA-MB231 (a) o PC3 (b) las células se transfectaron con el control de miR (miR-c ) o imitan el miR-135a (tanto complementado con el plásmido pSGFlag vacío) o imitan el miR-135a complementado con pSGFlag-? a /B-ERRα (borrado de su 3'UTR). La expresión de las proteínas indicadas se muestra en los paneles superiores. Las células se dejaron para invadir Matrigel en ensayos de cámara de Boyden. células invasoras fueron fijadas y teñidas. microfotografías típicos se muestran a la izquierda. La cuantificación se realizó sobre todo bien con la imagen J. Los resultados se expresan en relación con las condiciones de control de miR con barras de error indican sem. **: P
Restaurant & lt; 0,01, *: p
Restaurant & lt; 0,05, NS:.
Discusión
resultados discrepantes no significativos se han publicado en relación con el papel de miR-135a en la progresión del cáncer. De hecho, este microRNA ha informado para promover o inhibir rasgos de la agresividad del cáncer [6-12]. Aquí mostramos que miR-135a reduce la expresión de ERRα en los niveles de ARNm y de proteínas, lo que resulta en la modulación de la expresión de los genes diana de receptor. Curiosamente ERRα muestra un patrón de expresión en los cánceres que es opuesta a la de miR-135a. De hecho, los niveles de receptor (ARNm y proteínas) son más elevada en los tumores (en relación con el tejido normal) y su alta expresión se correlaciona con un mal pronóstico en varios tipos de cánceres tales como los de la mama o la próstata (revisado en [26 a 28 ]). Esta alta expresión podría ser el resultado de varios mecanismos tales como la amplificación genómica [40], un bucle autorregulador transcripcional [41], y la regulación a la baja de microRNAs que se dirigen a ERRα [25, 42]. Aquí proponemos que una disminución en la expresión de miR-135a puede desreprimir la del receptor. En consonancia con su definición como un factor de mal pronóstico, ERRα promueve varios rasgos de la progresión del cáncer, tales como la EMT, la angiogénesis, cambie a la glucólisis aeróbica (efecto Warburg) y la resistencia a la hipoxia [31-35]. No se sabe si miR-135a está realmente involucrado en contrarrestar la aparición de estos procesos. Sin embargo, el miR-135a reprime células invasión [11], un parámetro que es, por el contrario, promovido por ERRα [36-37]. Nuestros resultados actuales muestran que la inactivación de ERRα por miR-135a es instrumental en la prevención de la invasión de células ya que este fenómeno puede ser restaurada por la re-introducción de un receptor no objeto de orientación. Al menos dos mecanismos no se excluyen mutuamente se han evocado para dar cuenta de las actividades pro-invasivos del receptor. Por un lado, ERRα induce Wnt11 de señalización que regula directamente la invasión de células a través de un bucle autorregulador que implica β-catenina [36]. Por otra parte, el receptor regula positivamente la expresión de TNFAIP1, lo que reduce la estabilidad de la proteína RhoA, así como la actividad de su Rock1 efector aguas abajo [37]. En ausencia de ERRα el aumento de la actividad Rock1 conduce a una inhibición de la invasión de células. Es interesante que se ha demostrado recientemente que el miR-135a directamente induce la degradación del ARNm Rock1, también resulta en la inhibición de la invasión de células [11]. A este respecto, la reducción de la expresión de miR-135a en los cánceres puede resultar en la expresión Rock1 no controlada que puede llegar a ser excesiva y por lo tanto inhibir la invasión celular. Sin embargo, la reducción de miR-135a también probables clientes potenciales, de forma paralela, a una mayor expresión ERRα. A su vez el receptor reduce la actividad Rock1 a un nivel que sea apropiado para la invasión celular. En resumen miR-135a y ERRα puede formar una red de regulación de múltiples niveles que la actividad afina Rock1.
Examinando la literatura, parece posible que esta red de regulación ERRα miR-135a- puede ser eficaz en una forma completamente contexto diferente. De hecho se ha demostrado que el miR-135a directamente regula a la baja la expresión del gen maestro de la diferenciación de osteoblastos, Runx2, lo que impide la osteogénesis [39].
Per se
, la disminución inducida por BMP2 observado en la expresión de miR-135a puede por lo tanto dar lugar a Runx2 incontrolada sobre-expresión y la diferenciación de los osteoblastos tanto prematura. En otra parte, los datos independientes han revelado que tanto la expresión y la actividad Runx2 son reprimidos por ERRα ([43-45], revisado en [14]). La disminución de la expresión de miR-135a lo tanto, puede derepress directamente la expresión de ambos Runx2 y ERRα, éste a su vez la moderación de la actividad de los primeros. Tal red sería finalmente resultar en actividad Runx2 de ajuste, como se describe anteriormente para Rock1. Se requiere más trabajo para demostrar la veracidad de esta hipótesis.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Los oligonucleótidos utilizados en este estudio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0156445.s001 gratis (PDF)