Extracto
El factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) vía de señalización es un supresor de tumores vía que comúnmente se inactiva en el cáncer colorrectal (CRC). La inactivación de TGFBR2 es el evento genético más común que afecta a la ruta de señalización de TGF-β. Sin embargo, el mecanismo por el cual las células cancerosas downregulate TGFBR2 no está claro. En este estudio, se encontró que los niveles de proteína TGFBR2 se upregulated consistentemente en los tejidos de CRC, mientras que sus niveles de ARNm variaban en estos tejidos, lo que sugiere que un mecanismo post-transcripcional está implicado en la regulación de TGFBR2. Debido a que los microRNAs (miRNAs) son potentes reguladores post-transcripcional de la expresión génica, se realizó un análisis bioinformático para buscar miRNAs que potencialmente se dirigen TGFBR2. Se identificaron el sitio de la orientación específica de miR-135b en la región 3 'no traducida (3'-UTR) de TGFBR2. Se identificaron además una correlación inversa entre los niveles de miR-135b y la proteína TGFBR2, pero no ARNm, en muestras de tejidos de CRC. Mediante la sobreexpresión o silenciar el miR-135b en las células de CRC, que validada experimentalmente que el miR-135b se une directamente a la 3'-UTR de la transcripción TGFBR2 y regula la expresión TGFBR2. Por otra parte, las consecuencias biológicas de la focalización de TGFBR2 por miR-135b se examinaron usando en ensayos de proliferación celular y la apoptosis in vitro. Hemos demostrado que miR-135b ejerce un efecto promotor de tumores mediante la inducción de la proliferación y la inhibición de la apoptosis de las células de CRC a través de la regulación negativa de la expresión TGFBR2. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan la primera evidencia que apoya el papel de miR-135b como un oncogén en el CCR a través de la inhibición de la traducción TGFBR2
Visto:. Li J, Liang H, M Bai, Ning T, C Wang , Fan Q, et al. (2015) miR-135b promueve la progresión del cáncer de Orientación de factor de crecimiento transformante beta del receptor II (TGFBR2) en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 10 (6): e0130194. doi: 10.1371 /journal.pone.0130194
Editor Académico: Shrikant Anant, Universidad de Kansas Facultad de Medicina de Estados Unidos |
Recibido: 9 Febrero 2015; Aceptado: 16-may de 2015; Publicado: 10 Junio 2015
Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 81201946, 81372394, 81250044, 81401257), el Ministerio de Educación Fondo de Investigación del doctorado programa (Nº 2012202120013), la Fundación de Ciencias de la Universidad médica de Tianjin (No.2011KY15), la Plataforma Nacional de Investigación de Tecnología de evaluación clínica para Nuevos Medicamentos contra el cáncer (núm 2013ZX09303001). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es actualmente el tercer cáncer más común y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo [1]. La acumulación de alteraciones genéticas y epigenéticas media la formación de CRC y la progresión, la desregulación de las vías de señalización claves en las células del cáncer [2,3]. En CRC, una de las vías de señalización más comúnmente inactivada es el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β) vía de señalización, que se ha asociado con el establecimiento y la progresión de neoplasias intestinales [4].
El TGF β vía de señalización juega un papel importante en muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la migración celular, la apoptosis y la modulación inmune a través de dos relacionados serina transmembrana /receptores treonina quinasa, el tipo I y tipo II serina /treonina quinasa de receptores [5]. la señalización de TGF-β se inicia cuando el ligando se une al receptor de tipo II, que es seguido por la dimerización del receptor de tipo II con el receptor de tipo I. Dentro de este complejo heteromérico, los fosforila receptor de tipo II y activa el receptor de tipo I quinasa, que se propaga la señal por la orientación componentes aguas abajo de esta vía [6]. La vía de señalización de TGF-β actúa como un supresor de tumores en la etapa temprana del CRC, que a menudo se inactiva a través de la regulación a la baja de TGFBR2 [7]. Una disminución en los niveles de expresión TGFBR2 se ha asociado con un aumento de la tumorigenicidad en un número de tumores humanos, incluyendo CRC [8]. La inactivación de TGBR2 genética debido a la alteración o la metilación del promotor ha sido reportado en esofágico, gástrico y de próstata [9-11]. Se informó que la inactivación de TGFBR2 debido a la mutación genética o la metilación que se produzca principalmente en CRC microsatélites-inestable debido a defectos de reparación del ADN desajuste [12-14]. Sin embargo, los tumores que presentan inestabilidad de microsatélites sólo representan el 10-15% de todos los casos de CCR [15]. El mecanismo subyacente no desajuste de reparación deficiente CRC sigue siendo poco clara. Estas observaciones sugieren que otros mecanismos moleculares pueden estar involucrados en la regulación a la baja de TGFBR2; esta hipótesis requiere una mayor investigación
.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños no codificantes, ARN de cadena simple que juegan un papel importante en la regulación de la expresión génica a nivel post-transcripcional [16-18 ]. La evidencia reciente ha indicado que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores tumorales mediante la represión de los genes relacionados con el cáncer [19]. Alteraciones de la expresión de los genes miARN se han observado en una variedad de tumores humanos, incluyendo CRC [20,21]. Algunos de estos miRNAs han atraído una atención especial debido a su participación en la iniciación, progresión y metástasis de cánceres humanos [22,23]. Por ejemplo, el miR-143 y miR-145 (MIR-143/145) están regulados a la baja en muchos tipos de cáncer, incluyendo CRC [24,25]. Por otra parte, se informó que el miR-143/145 actúan como supresores tumorales a través de la inhibición de la traducción del gen KRAS en el CCR humano [26-28]. Estos resultados ponen de relieve la necesidad de una búsqueda en profundidad para miRNAs que se expresan de forma aberrante durante la carcinogénesis colorrectal y la necesidad de una intensa investigación de su papel en la biología del tumor.
A pesar de que la desregulación de TGFBR2 y miRNAs se asocia con CRC tumorigénesis en humanos, se sabe poco sobre los cuales actúan sobre miRNAs TGFBR2. En este estudio, la hipótesis de que TGFBR2 es un objetivo de miR-135b. Después de medir los niveles de expresión de miR-135b y TGFBR2 CRC en los tejidos y tejidos no cancerosos emparejado, se detectó una correlación inversa entre el miR-135b y Tgfbr2 expresión en el CCR. Además, en este estudio, hemos confirmado experimentalmente la regulación directa de TGFBR2 por miR-135b y el papel biológico de la regulación mediada por el miR-135b de expresión TGFBR2 en el CCR humano.
Materiales y Métodos
tejido humano
tejidos y tejidos no cancerosos CRC adyacentes apareados fueron obtenidas de pacientes sometidos a procedimientos quirúrgicos en el hospital Gulou Afiliado de la Universidad de Nanjing (Nanjing, china). Tanto el tumor y los tejidos no cancerosos se sometieron a análisis histológico para la confirmación del diagnóstico. El tipo patológico de cada cáncer fue identificado como adenocarcinoma. consentimiento por escrito fue proporcionado por todos los pacientes o sus tutores, y el Comité de Ética de la Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Anhui aprobó todos los aspectos de este estudio. Los fragmentos de tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido en el momento de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C. Las características clínicas de los pacientes se enumeran en la Tabla S1.
Cultivo de células
Las líneas celulares humanas CRC HT-29 y SW-480 fueron adquiridos de la Shanghai Instituto de Biología Celular de la china Academia de Ciencias (Shanghai, china). Las células HT-29 y SW-480 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco) en un incubador humidificado a 37 ° C en 5% de CO
2.
ARN aislamiento y RT-PCR cuantitativa
el ARN total se extrajo de las células cultivadas y tejidos utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Los ensayos para cuantificar miRNAs maduros se realizaron utilizando sondas TaqMan miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 g de ARN total fue transcrito de forma inversa en ADNc usando transcriptasa inversa AMV (Takara, Dalian, China) y un cebador tallo-bucle RT (Applied Biosystems). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min y 85 ° C durante 5 min. PCR en tiempo real se realizó con un kit TaqMan PCR y una (Applied Biosystems) Biosystems del sistema de detección de secuencias Applied 7500. Las reacciones se incubaron en una placa óptica de 96 pocillos a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s y 60 ° C durante 1 min. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. Después de las reacciones eran completas, se recogieron el ciclo umbral (C
T) usando datos de configuración de los umbrales fijados, y la media C
T se determinó a partir PCR por triplicado. Un método C
T comparativo se utilizó para comparar cada transcripción a los controles. U6 snRNA se utilizó como un control interno, y la cantidad relativa de los genes miARN normalizaron a los niveles de U6 snRNA se calculó utilizando la fórmula 2
-ΔΔCT, en el que ΔΔC
T = (C
T miRNA - C
T U6)
target - (C
T miARN - C
T U6)
Control
Para cuantificar los niveles de ARNm de GAPDH y TGFBR2, 1 g del total. ARN fue inverso-transcrito a cDNA utilizando oligo d (T) 18 cebadores (Takara) y Thermoscript transcriptasa inversa (Invitrogen). Las condiciones de reacción fueron las siguientes: 42 ° C durante 60 min y 70 ° C durante 10 min. En tiempo real PCR se realizó en el producto RT, tinte SYBR Green (Invitrogen) y cebadores específicos para TGFBR2 o GAPDH. Las secuencias de los cebadores fueron las siguientes: TGFBR2 sentido: 5'-GTAGCTCTGATGAGTGCAATGAC-3 '; TGFBR2 antisentido: 5'-CAGATATGGCAACTCCCAGTG-3 '; GAPDH sentido: 5'-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3 '; y GAPDH antisentido: 5'-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3 '. Las reacciones se incubaron a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 1 min. Después de la finalización de las reacciones, el C
valores de T se determina de acuerdo con un umbral fijo. La cantidad relativa de mRNA TGFBR2 se normalizó al nivel de ARNm de GAPDH.
miRNA sobreexpresión
miRNA sobreexpresión se consiguió mediante la transfección de células con un miRNA mimic, que es un dúplex de ARN oligonucleótido sintético que imita el miARN secuencia precursora. Las moléculas de ARN sintéticos, incluyendo pre-miR-135b y un ARN control negativo revueltos (pre-miR-control), fueron adquiridos de GenePharma (Shanghai, China). células HT-29 y SW-480 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) en el día siguiente, cuando las células fueron aproximadamente 70% de confluencia. Para los experimentos de sobreexpresión de los genes miARN, se utilizaron 100 pmol de pre-miR-135b. Después de 6 h, el medio de las células HT-29 y SW-480 se cambió a medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 2%. Las células se recogieron a las 24 h o 48 h después de la transfección para el aislamiento de ARN total o proteína, respectivamente.
Construcción de plásmidos y la eficacia siRNA ensayo
Un plásmido de expresión de mamíferos (Preceiver-M98 -TGFBR2) diseñado para expresar específicamente el marco de longitud completa de lectura abierto (ORF) de TGFBR2 humano sin el miR-135b-sensible 3'-UTR se adquirió de FulenGen (Guangzhou, china). Un plásmido vacío sirvió como control negativo. La secuencia de siRNA (5'-GATTCAAGAGTATTCTCACTT-3 ') de orientación TGFBR2 humano fue diseñado y sintetizado por Ribobio (Guangzhou, China). Un siRNA revueltos (Ribobio) se utilizó como control negativo. El plásmido sobreexpresión o siRNA se transfectó en HT-29 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se aisló el ARN total o proteína 24 h o 48 h después de la transfección. Los niveles de mRNA TGFBR2 y expresión de proteínas se evaluaron mediante RT-PCR cuantitativa y Western blot, respectivamente.
reportero de luciferasa ensayo
Todo el 3'-UTR de TGFBR2 humana se amplificó mediante PCR utilizando humana ADN genómico como plantilla. Los productos de PCR se insertaron entonces en el plásmido PMIR-INFORME (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). La inserción exitosa de esta secuencia se confirmó mediante secuenciación del ADN. Para evaluar la especificidad de unión, se mutaron las secuencias que interactúan con la región semilla de miR-135b (de AGCUAUG a UCGAUAC para el miR-135b sitio de unión), y el mutante TGFBR2 3'-UTR se insertó en un plásmido indicador de luciferasa equivalente. Para los ensayos de reportero de luciferasa, HT-29 y SW-480 células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y co-transfectaron con 0,8 g del plásmido indicador de luciferasa de luciérnaga, 0,8 g de la β-galactosidasa (β-gal) plásmido de expresión (Ambion ), y cantidades iguales (20 pmol) de la miR-135b imitan o un ARN control negativo revueltos usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El plásmido β-gal fue utilizado como control de la eficiencia de la transfección. Las células se recogieron 24 h después de la transfección y se sometieron al ensayo de actividad de la luciferasa utilizando un kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
aislamiento de proteínas y Western blot
células o los tejidos se lisaron en tampón de lisis RIPA (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 0,1% de SDS, NP-40, 0,25% de desoxicolato de sodio al 1% y EDTA 1 mM, pH 8,0) que contiene recién añadido cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) para 30 min en hielo y se centrifugaron a 16.000 × g a 4 ° C durante 10 min. Se recogió el sobrenadante y la concentración de proteína se calculó utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). Las proteínas se separaron mediante SDS-PAGE (Bio-Rad). Después de la electroforesis, las proteínas se electrotransfirieron a membranas de PVDF (Bio-Rad) y luego se bloquearon con leche desnatada al 5% durante 1 h. Las membranas fueron incubadas en anticuerpos primarios a 4 ° C durante 12 h. Después de tres lavados en TBST, las membranas se incubaron en un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante durante 1 h a temperatura ambiente. Después de tres lavados, se incubaron las membranas en el sustrato de quimioluminiscencia SuperSignal West Pico (Pierce). La misma membrana se sondeó con un anticuerpo GAPDH para servir como control de carga. Los anticuerpos contra TGFBR2 y GAPDH fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (SC-400 y SC-365062, respectivamente; Santa Cruz, CA, EE.UU.).
La proliferación celular ensayo
células HT-29 se sembraron a 5 x 10
4 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche en luego RPMI-1640 suplementado con 10% FBS. Las células se recogieron a las 12, 24, 36, 48 o 60 h después de la transfección. Después de la transfección, se añadió 10 l de solución de Cell Counting Kit-8 (CK04-500, Dojindo) a los pocillos correspondientes probado y se incubó durante 1 h. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 450 nm. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Ensayos de apoptosis
La apoptosis de las células HT-29 se evaluó mediante un /yoduro de propidio Anexina V-FITC (PI) tinción ensayo. Las células HT-29 se cultivaron en placas de 12 pocillos y se transfectaron con pre-miR-135b, anti-miR-135b, TGFBR2 siRNA, el plásmido o sobreexpresión TGFBR2 para inducir apoptosis. Pre-miR-control, anti-miR-control, control de siRNA, y un plásmido de control sirvió como controles negativos. Las células se cultivaron durante 24 h en medio de suero empobrecido; a continuación, el documento adjunto y se recogieron las células flotantes. análisis de citometría de flujo de las células apoptóticas se realizó utilizando un kit Annexin V-FITC /PI tinción (BD Biosciences, CA, EE.UU.). Después de lavar con PBS frío, las células se resuspendieron en tampón de unión (HEPES 100 mM, pH 7,4, NaCl 100 mM, y CaCl 25 mM
2), seguido por tinción con Anexina V-FITC /PI a temperatura ambiente en la oscuridad durante 15 min. Las células apoptóticas se evaluaron a continuación, colocando puertas en las células PI y Anexina V-positivos utilizando un activadas por fluorescencia celular (FACS) citómetro de flujo (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Además, los núcleos se tiñeron con DAPI para evaluar los cambios morfológicos en las células apoptóticas. En pocas palabras, después de la transfección y cultivo durante 24 h en medio de suero empobrecido, las células HT-29 se tiñeron con DAPI durante 15 min a 37 ° C bajo 5% (v /v) de CO2. Después de lavar con PBS frío y se fijan en 4% (v /v) de formalina, se examinaron células usando un microscopio Olympus IX81 (200 ×) equipado con iluminación de fluorescencia X-CITE (Serie 120Q; fluorescencia azul). El grado de apoptosis se cuantificó mediante el cálculo de la relación de condensado a los núcleos totales. Los resultados se muestran a partir de los datos de tres experimentos independientes con 3 campos microscópicos al azar de cada muestra. Se contaron los núcleos condensados en el campo microscópico.
El análisis estadístico
Todas las imágenes blot y Ensayo de proliferación occidentales son representativos de al menos tres experimentos independientes. Los ensayos cuantitativos de RT-PCR y reportero de la luciferasa se realizaron por triplicado, y cada experimento individual se repitió varias veces. Los resultados se presentan como la media ± SE de al menos tres experimentos independientes. Se consideraron las diferencias observadas significativas a p & lt; 0.05 sobre la base de la prueba t de Student.
Resultados
La regulación positiva de la proteína TGFBR2, pero no ARNm, en los tejidos CRC
primero se determinó los patrones de expresión de TGFBR2 en humanos tejidos de CRC. Después de medir los niveles de proteína de TGFBR2 en cinco tejidos adyacentes apareados CRC y normales, se encontró que los niveles de proteína TGFBR2 se redujeron dramáticamente en los tejidos de CRC en comparación con los tejidos adyacentes normales (Fig 1A y 1B). Sin embargo, aunque la proteína TGFBR2 se downregulated consistente en el tejido CRC, los niveles de mRNA TGFBR2 no difirieron significativamente entre los tejidos cancerosos y no cancerosos (figura 1C). Esta disparidad entre la expresión de la proteína y el ARNm de TGFBR2 en CRC sugiere fuertemente que un mecanismo post-transcripcional está implicado en la regulación de TGFBR2.
(A y B) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína TGFBR2 de cada cinco emparejados CRC y las muestras normales de tejido adyacente (NAT). A: imagen representativa; B: análisis cuantitativo. (C) RT-PCR cuantitativa análisis de los niveles de mRNA en TGFBR2 cinco muestras de tejidos de CRC y NAT pareadas. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.
Identificación de sitios diana de miR-135b conservadas dentro de la 3'-UTR de TGFBR2
Tres algoritmos computacionales, TargetScan [29], Miranda [30] y PicTar [31 ], se utilizaron en combinación para identificar miRNAs potenciales que se dirigen a TGFBR2. Los tres algoritmos predijeron miR-135b como un regulador de TGFBR2. Las interacciones predichas entre miR-135b y los sitios diana dentro de la 3'-UTR de TGFBR2 se ilustran en la figura 2A. Se observó una hibridación predicha entre miR-135b y la 3'-UTR de TGFBR2. No era perfecta complementariedad entre la región de la semilla (la secuencia central que abarca los primeros 2-8 bases de los genes miARN maduro) y la secuencia diana putativo. El valor mínimo de energía libre de la hibridación entre miR-135b y TGFBR2 fue -20,7 kcal /mol, que está dentro de la gama de auténticos pares miARN objetivo. Además, las secuencias de unión de miR-135b en el TGFBR2 3'-UTR son altamente conservadas entre las especies. Por lo tanto, se seleccionó miR-135b para la verificación experimental adicional de su unión a TGFBR2
.
(A) Esquema de los dúplex hipotéticas formadas por la interacción entre los sitios de unión en la TGFBR2 3'-UTR (arriba) y miR-135b (parte inferior). El valor de energía libre predicho de esta interacción se indica. Los sitios de reconocimiento de la semilla se denotan, y todos los nucleótidos de estas regiones están altamente conservadas a través de varias especies, incluyendo humanos, de ratón y de rata. (B) El análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de miR-135b en cinco muestras de tejidos de CRC y NAT pareadas. (C) de dispersión gráfica de correlación de Pearson de las veces el cambio de miR-135b y proteínas en los tejidos TGFBR2 CRC humanos. (D) de dispersión gráfica de correlación de Pearson de las veces el cambio de miR-135b y el ARNm TGFBR2 CRC en los tejidos humanos. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.
Identificación de una correlación inversa entre los niveles de miR-135b y los niveles de proteína en los tejidos TGFBR2 CRC
miRNAs se piensa generalmente para mostrar patrones de expresión que son opuestas a las de sus objetivos [16-18]. El interés en la relación entre el miR-135b y TGFBR2 también fue apoyada por la reciente identificación de este miARN como un oncogén candidato y de TGFBR2 como un supresor de tumores en el CCR [2,32]. A continuación se investigó si los niveles de miR-135b inversamente correlacionados con los niveles de expresión de proteínas TGFBR2 en los tejidos de CRC. Después de determinar los niveles de miR-135b en cinco pares de CRC y los tejidos adyacentes normales, se encontró que el nivel de expresión de miR-135b, fue significativamente superior en los tejidos de CRC (Figura 2B). La correlación inversa entre el miR-135b y los niveles de proteína TGFBR2 (figura 2C) y la disparidad entre los niveles de miR-135b y TGFBR2 ARNm (figura 2D) se ilustra adicionalmente mediante los gráficos de correlación de Pearson de dispersión. Estos resultados indicaron que el nivel de expresión de miR-135b se correlaciona inversamente con el nivel de expresión de la proteína en los tejidos TGFBR2 CRC humanos. Por lo tanto, TGFBR2 se determinó que era un objetivo de miR-135b sobre la base de las dos predicciones computacionales y la correlación inversa entre los niveles de miR-135b y proteínas TGFBR2, pero no ARNm, en el CCR.
Validación de TGFBR2 como blanco directo de miR-135b
la correlación entre el miR-135b y Tgfbr2 expresión se examinó mediante la evaluación de la expresión TGFBR2 en las líneas celulares humanas CRC HT-29 y SW-480 después de la sobreexpresión y la caída de miR-135b . En estos experimentos, la sobreexpresión de miR-135b se consiguió mediante la transfección de células HT-29 y SW-480 con pre-miR-135b, que es un oligonucleótido de ARN sintético que imita el precursor de miR-135b; mientras que desmontables de miR-135b se logró mediante la transfección de células con anti-miR-135b (oligonucleótidos antisentido modificados químicamente diseñados para dirigirse específicamente a madurar miR-135b). La sobreexpresión eficiente o desmontables de miR-135b se demuestra en la figura 3A. Claramente, los niveles de miR-135b celulares se incrementaron significativamente cuando las células HT29 y SW480 se transfectaron con pre-miR-135b y disminuyó drásticamente cuando las células HT29 y SW480 fueron tratados con anti-miR-135b. La expresión de la proteína TGFBR2 fue inhibida significativamente por la introducción de pre-miR-135b en HT29 (Fig 3B) y SW480 (Fig 3C) células, mientras que anti-miR-135b aumentó significativamente el nivel de proteína TGFBR2 en HT29 (Fig 3B) y células SW480 (Fig 3C). Para determinar el nivel en el que el miR-135b regula la expresión TGFBR2, repetimos los experimentos anteriores y examinó la expresión de ARNm TGFBR2 después de la transfección. La sobreexpresión o derribo de miR-135b no afectaron a la estabilidad del ARNm de TGFBR2 (figura 3D). Estos resultados demostraron que el miR-135b regula específicamente la expresión TGFBR2 a nivel post-transcripcional, que es el mecanismo más común de acción animal miARN
.
(A) Análisis de RT-PCR cuantitativa de los niveles de miR-135b en células HT-29 y SW-480 tratadas con pre-miR-control mezclado, pre-miR-135b, anti-miR-control o anti-miR-135b. (B y C) Análisis de transferencia Western de los niveles de proteína en TGFBR2 HT-29 y células SW-480 tratadas con pre-miR-control, pre-miR-135b, anti-miR-control o anti-miR-135b. B: imagen representativa; C: análisis cuantitativo. (D) Análisis cuantitativo de RT-PCR de los niveles de mRNA en TGFBR2 HT-29 y células SW-480 tratadas con pre-miR-control, pre-miR-135b, anti-miR-control o anti-miR-135b. (E) La unión directa de la TGFBR2 3'-UTR de miR-135b. células HT-29 y SW-480 se cotransfectaron con un reportero de luciferasa de luciérnaga que contiene ya sea de tipo salvaje (WT) o mutante sitios (Mut) miR-135b de unión en la TGFBR2 3'-UTR y, o bien pre-miR-control o pre-miR-135b. Veinticuatro horas después de la transfección, se evaluaron las células usando un kit de ensayo de luciferasa. Los resultados se muestran como la relación de la actividad de luciferasa de luciérnaga en las células miR-135b-transfectadas a la de las células de control. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0,01; *** P & lt; 0.001.
Para determinar si los efectos reguladores negativos de miR-135b en la expresión TGFBR2 estaban mediados por la unión de miR-135b a los sitios objetivo previsto en la 3'-UTR del ARNm TGFBR2, la longitud total 3'-UTR de TGFBR2 que contiene el sitio de unión de miR-135b predicho se insertó aguas abajo del gen de luciferasa de luciérnaga en un plásmido reportero. El plásmido resultante se co-transfectaron en HT-29 y células SW-480 con un plásmido de control de transfección (β-gal) y, o bien pre-miR-135b o un ARN control negativo revueltos. Como era de esperar, la actividad luciferasa se redujo notablemente en las células transfectadas con pre-miR-135b. Además, introdujimos mutaciones puntuales en los sitios complementarios correspondientes en el 3'-UTR de TGFBR2 para interrumpir los sitios de unión de miR-135b predichos. Este indicador de luciferasa mutado no se vio afectada por la sobreexpresión de miR-135b (Fig 3E). Este hallazgo sugiere que el putativo miARN sitios de unión de TGFBR2 contribuyen fuertemente a esta interacción miARN-mRNA, que media la represión post-transcripcional de la expresión TGFBR2. En conclusión, nuestros resultados demostraron que miR-135b se une directamente al extremo 3 'UTR de la transcripción TGFBR2 mRNA para suprimir la expresión en las células TGFBR2 CRC.
miR-135b promueve la proliferación e inhibe la apoptosis de las células de CRC por la orientación TGFBR2
a continuación analizaron las consecuencias biológicas de la represión impulsada por el miR-135b de Tgfbr2 expresión en células de CRC. Lo primero que investigó si la sobreexpresión o el silenciamiento de TGFBR2 afecta a la proliferación de células HT-29 y la apoptosis. Para derribar Tgfbr2 expresión, la secuencia de siRNA dirigidos a diferentes sitios de TGFBR2 cDNA humano fue diseñado y se transfectó en células HT-29. Para sobreexpresar TGFBR2, un plásmido que expresa el ORF TGFBR2 se transfectó en células HT-29. La sobreexpresión eficiente de TGFBR2 se demuestra en la figura 4A y 4B. De acuerdo con estudios anteriores que muestran que TGFBR2 inhibe la proliferación celular [3], las células HT-29 en el que la expresión TGFBR2 fue derribado usando siRNA proliferó a una velocidad significativamente mayor, mientras que las células transfectadas con el plásmido de sobreexpresión TGFBR2 exhibido reducido significativamente la proliferación (Fig 4C y 4D). De manera similar, células HT-29 en el que la expresión TGFBR2 fue derribado usando siRNA exhibió aumentado significativamente la apoptosis, mientras que las transfectadas con el plásmido de sobreexpresión TGFBR2 exhibido reducción de la apoptosis (Fig 4E).
(A y B) análisis de transferencia de Western de los niveles de proteína TGFBR2 en células HT-29 tratadas con siRNA control mezclado, TGFBR2 siRNA, el control vectorial o vector TGFBR2. A: imagen representativa; B: análisis cuantitativo. ensayos (C) CCK8 de viabilidad celular se realizaron 12, 24, 36, 48 y 60 h después de la transfección de células HT-29 con cualquiera de los controles revueltos siRNA o TGFBR2 siRNA. (D) los ensayos de viabilidad celular se realizaron CCK8 12, 24, 36, 48 y 60 h después de la transfección de células HT-29, ya sea con vector de control o vector TGFBR2. ensayos de (E) Apoptosis se realizaron después de la transfección de células HT-29 con control mezclado siRNA, TGFBR2 siRNA, vector control o vector TGFBR2. Panel izquierdo: imagen representativa; Panel derecho: análisis cuantitativo. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.
A continuación analizaron las consecuencias biológicas de la supresión mediada por miR-135b de Tgfbr2 expresión en células de CRC. En apoyo de la idea de que las funciones de miR-135b como un miARN proto-oncogénica clave [32], las células HT-29 transfectadas con pre-miR-135b mostraron aumento de la proliferación; Por el contrario, desmontables de miR-135b tuvo el efecto opuesto sobre la proliferación celular (Fig 5A). Por otra parte, en comparación con las células transfectadas con pre-miR-135b, las células co-transfectadas con pre-miR-135b y el plásmido sobreexpresión TGFBR2 exhibió una tasa de proliferación reducida significativamente (Fig 5F), lo que sugiere la expresión TGFBR2 que miR-135b resistente rescató a la supresión de la expresión TGFBR2 por miR-135b y atenuado el efecto pro-proliferativa de miR-135b.
(a) CCK-8 ensayos de viabilidad celular se realizaron 12, 24, 36, 48 y 60 h después la transfección de células HT-29 con pre-miR-control, pre-miR-135b, anti-miR-control o anti-miR-135b. (B-E) Ensayos de apoptosis se realizaron 24 h después de la transfección de células HT-29 con pre-miR-control, pre-miR-135b, anti-miR-control o anti-miR-135b. B: porcentaje representativo de las células HT-29 apoptóticos utilizando análisis de citometría de flujo; C: porcentaje representativo de las células HT-29 apoptóticos mediante DAPI; D: imagen representativa utilizando el análisis de citometría de flujo; C: imagen representativa de células HT-29 apoptóticos mediante DAPI. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01. Se realizaron 8-CCK ensayos de viabilidad celular (F) 12, 24, 36, 48 y 60 h después de la transfección de células HT-29 con el control mezclado miARN y el vector de control, el control mezclado miARN y el vector TGFBR2, pre- miR-135b y el vector de control, o pre-miR-135b y el vector TGFBR2. ensayos (GJ) Apoptosis se realizaron 24 h después de la transfección de células HT-29 con el control mezclado miARN y el vector de control, el control mezclado miARN y el vector TGFBR2, pre-miR-135b y el vector de control, o pre-MIR -135b y el vector TGFBR2. G: porcentaje representativo de las células HT-29 apoptóticos utilizando análisis de citometría de flujo; H: porcentaje representativo de las células HT-29 apoptóticos mediante DAPI; I: imagen representativa utilizando el análisis de citometría de flujo; J: imagen representativa de células HT-29 apoptóticos mediante DAPI. * P & lt; 0,05; ** P & lt; 0.01.
Se investigaron los efectos de miR-135b en la apoptosis de las células CRC a través de análisis de citometría de flujo y tinción DAPI. Los resultados mostraron que el porcentaje de células apoptóticas fue significativamente menor entre las células HT-29 transfectadas con pre-miR-135b, pero fue mayor entre las células HT-29 transfectadas con anti-miR-135b (figura 5B, 5C, 5D y 5E ). Además, cuando las células HT-29 se transfectaron simultáneamente con pre-miR-135b y el plásmido sobreexpresión TGFBR2, el efecto anti-apoptótico de miR-135b fue atenuada drásticamente (Fig 5G, 5H, 5I y 5J). Estos resultados indicaron que el miR-135b podría modular la apoptosis de las células mediante la regulación negativa TGFBR2 en las células de CRC.
Discusión
La vía de señalización de TGF-β juega un papel complejo en la progresión maligna de los tumores, y su efectos, tales como la inhibición del crecimiento, la apoptosis, la diferenciación y otros procesos de TGF-ß-regulada, parecen ser dependientes del contexto [33]. se requiere la expresión TGFBR2 para la señalización para regular la especificidad de su activación de la vía de señalización y sus efectos biológicos [34] TGF-β.