Extracto
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes que juegan un papel importante en la carcinogénesis y la progresión tumoral. En este estudio, hemos investigado las funciones y mecanismos de miR-140 en el cáncer humano de pulmón no microcítico (CPNM). Encontramos que el miR-140 está regulada negativamente de manera significativa en los tejidos y líneas celulares de NSCLC. Tanto el aumento de la función de los estudios y la pérdida de función demostró que el miR-140 suprime la proliferación de células NSCLC, la migración y la invasión in vitro. Es importante destacar que, la sobreexpresión de miR-140 reprimida con eficacia el crecimiento del tumor y la metástasis en modelos de ratón desnudo. análisis integrado identificó IGF1R como objetivo directo y funcional de miR-140. Desmontables de IGF1R inhibe la proliferación celular y la invasión parecida a la de la sobreexpresión de miR-140, mientras que la sobreexpresión de IGF1R atenúa la función de miR-140 en células de NSCLC. En conjunto, nuestros resultados ponen de manifiesto la importancia de miR-140 y IGF1R en el desarrollo y progresión del NSCLC
Visto:. Yuan Y, Shen Y, Xue L, H Fan (2013) miR-140 suprime el crecimiento tumoral y metástasis de células no pequeñas de cáncer de pulmón por la orientación de crecimiento insulínico tipo 1 del receptor del factor. PLoS ONE 8 (9): e73604. doi: 10.1371 /journal.pone.0073604
Editor: Stephanie Filleur, Universidad Tecnológica de Texas Health Sciences Center, Estados Unidos de América
Recibido: 26 de mayo de 2013; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 10 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Yuan et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores no tienen financiación o apoyo al informe
Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa número uno de cáncer-. muerte relacionada con todo el mundo, y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa al menos el 80% de todos los casos de cáncer de pulmón [1,2]. A pesar de los recientes avances en el diagnóstico y tratamiento de este tipo de cáncer, la tasa de mortalidad global del NSCLC sigue siendo alta, y la tasa de supervivencia global a los 5 años asociado a NSCLC es un triste 11% [3]. Teniendo en cuenta esto, se necesita urgentemente una buena comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen en el desarrollo y la progresión del NSCLC.
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeñas moléculas de ARN no codificantes que regulan negativamente la expresión de genes diana ya sea por la degradación del ARNm o inhibición de la traducción [4]. miRNAs pueden regular la expresión de una amplia variedad de los genes diana; por lo tanto, están involucrados en una amplia gama de procesos biológicos incluyendo la proliferación celular, apoptosis, diferenciación y migración [5-7]. Recientemente, la creciente evidencia indica que la expresión anormal de miRNAs se correlaciona con una variedad de tipos de cáncer, y que miRNAs puede funcionar como oncogenes y supresores de tumor [8,9]. En el cáncer de pulmón, múltiples miRNAs, como let-7 de la familia, el miR-200, miR-486 y miR-146a han sido identificados como supresores de tumor [10-14]; Por otro lado, el miR-31, miR-212 y miR-196a se encontraron para promover la carcinogénesis NSCLC [15-17].
miR-140 ha llamado mucho la atención debido a que está involucrado en el desarrollo y progresión de diversos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama, osteosarcoma, cáncer de colon y carcinoma hepatocelular [18-20]. Estos hallazgos sugieren que las funciones de miR-140 como un papel supresor de tumores en estos tipos de cáncer; Sin embargo, hasta donde sabemos, sus funciones y los mecanismos potenciales en NSCLC sigue siendo poco clara. En este estudio, proporcionar la primera evidencia de un papel de miR-140 en el CPNM tumorigénesis y progresión, y aclara parcialmente el mecanismo molecular que subyace a este efecto. Encontramos que el miR-140 está regulado por disminución en los tejidos y líneas celulares de NSCLC. La sobreexpresión de miR-140 inhibió el crecimiento tumoral, la invasión y la metástasis de células de NSCLC. Además, hemos identificado IGF1R como un gen diana de miR-140 y miR-confirmó que 140 ejerce su efecto en la inhibición del crecimiento tumoral y la metástasis mediante la regulación negativa IGF1R. Nuestros resultados demuestran un nuevo papel de miR-140 como un supresor de tumores en el CPNM.
Materiales y Métodos
Las muestras de pacientes y líneas celulares
NSCLC humano y sus tejidos normales emparejados (por lo menos 5 cm de distancia del tumor primario) se obtuvieron de 30 pacientes en el hospital Zhongshan, Universidad de Fudan (Shanghai, china). Los tejidos se snap-congelado en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C hasta la extracción de ARN. escrito el consentimiento informado se obtuvo de cada paciente y de este estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica y ensayo en humanos en el Hospital Clínico de Zhongshan. Cinco líneas celulares de cáncer (A549, SK-MES-1, H157, H520 y H460) y un bronquio de pulmón de células epiteliales normales BEAS-2B se adquirieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en DMEM (Thermo HyClone Científica, Pekín, China) suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U /ml de penicilina, y 100 mg /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Todas las células se incubaron en 5% de CO
2 atmósfera húmeda a 37 ° C.
aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real PCR (qRT-PCR)
ARN fue extraído a partir de tejidos y líneas de células usando el reactivo TRIzol (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La expresión de miRNAs maduros fue ensayada mediante ensayos TaqMan microARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). Una de dos pasos QRT-PCR se empleó con cebadores específicos para miR-140 diseñado por Applied Biosystems. U6 snRNA se amplificó como un control interno. análisis de QRT-PCR para
IGF1R
y
beta-actina se realizaron utilizando SYBR Premezcla Ex Taq (Takara Bio, Dalian, China). Los cebadores utilizados fueron los siguientes: cebador directo IGF1R, 5'-GAGAAGGAGGAGGCTGAATACCG-3 '; IGF1R cebador inverso, 5 'GTGATGTTGTAGGTGTCTGCGGC-3'; β-actina de cebador, 5'-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 '; y cebador inverso β-actina, 5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 '. PCR en tiempo real se realizó con el tiempo real de la máquina PCR ABI 7900. La expresión relativa de cada gen se calculó y se normalizaron utilizando la 2
-ΔΔCt método relativo a U6 snRNA o β-actina.
infección Lentivirus y transfección de oligonucleótidos
El precursor de miR-140 y IGF1R siRNA se adquirieron de Origene (Rockville, Maryland, EE.UU.). La secuencia pre-miR-140 y la secuencia de IGF1R siRNA construcciones fueron clonados en Pcdh-CMV-MCS-EF1-coGFP (Sistema de Biociencias, California, EE.UU.). La producción y purificación de lentivirus se realizaron descrito previamente [21]. Las células diana (1 × 10
6) estaban infectados con unidades de transducción 1 × 10
7 lentivirus en presencia de 10 mg /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, EE.UU.). vector lentiviral vacío se utilizó como control. El inhibidor de miR-140 y control negativo se obtuvieron de Genepharma (Shanghai, China). la transfección de oligonucleótidos se llevó a cabo usando el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células se recogieron 48 h después de la transfección.
Plásmido construcción y ensayos de reportero de luciferasa
La secuencia de codificación de IGF1R se adquirió de Origene y se clonó en pcDNA3.1 (+) para generar vectores de expresión de IGF1R. El IGF1R de tipo salvaje 3 'UTR (WT) se amplificó con los siguientes cebadores: 5'-ATACTCGAGTTTCCATGCAACCTCCTTCTGC-3' (hacia delante) y 5'-AGCAAGCTTTCCATCTTCCAAGGAGGAGGCT-3 '(hacia atrás). sitios de restricción de endonucleasa (
Xho
I /
Hin dIII
) fueron incorporados en los cebadores para facilitar la ligación en el vector pGL3 básico (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Mutagénesis dirigida de la secuencia de semillas de miR-140 en el IGF1R 3'-UTR (Mut) se realizó utilizando el ™ sitio mutagénesis dirigida kit QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Para los ensayos de luciferasa, el plásmido reportero se cotransfectaron con un vector de control de luciferasa Renilla en células A549 y H157 en presencia de cualquiera de miR-140 o miR-control. Después de 48 h, las células se recogieron y se midió la actividad luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega, Madison, WI, EE.UU.).
La proliferación celular, ciclo celular y la apoptosis de las células análisis
Las células (2 × 10
3) se sembraron en placas de 96 pocillos en 100 l de medio de cultivo y se cultivaron. La proliferación de las células fue ensayada en los puntos indicados de tiempo utilizando un kit de CCK-8 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para el análisis del ciclo celular, las células infectadas o transfectadas se fijaron en etanol al 75% y se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio (PI). La distribución del ciclo celular se analizó en un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Biosciences, Bedford, MD, EE.UU.). ensayos de apoptosis de las células se realizaron utilizando una anexina V FITC-PI Kit de detección /Apoptosis (BD Biosciences). 1 × 10
4 células se tiñeron de acuerdo con el protocolo del fabricante y después se analizaron con una citometría de flujo (BD Biosciences) equipado con un software CellQuest (BD Biosciences).
cicatrización de heridas y la invasión ensayos
migración celular se evaluó mediante ensayos de curación de heridas. Las células se sembraron en placas de seis pocillos y se cultivaron a 100% de confluencia. Las heridas se generan en la monocapa de células usando una punta de pipeta de plástico. Después las células se enjuagaron con PBS y se cultivaron durante otras 48 horas. Se observó la propagación de cierre de la herida y se fotografió con un microscopio. Para los ensayos de invasión, 1 × 10
se añadieron 5 células en medio libre de suero en la cámara superior de un inserto pre-revestido con Matrigel (BD Bioscience). La cámara inferior se llenó con DMEM con suero bovino fetal 10%. Después de 48 horas de incubación, se eliminó el resto de las células en la superficie superior de la membrana, mientras que las células que habían invadido través de la membrana se tiñeron con 20% de metanol y 0,2% de cristal violeta, la imagen formada, y se contaron bajo un microscopio (Olympus, Tokio, Japón).
se realizó transferencia Western
análisis de transferencia Western como se describe anteriormente [22]. Brevemente, las proteínas se extrajeron con tampón RIPA suplementado con inhibidores de proteasa y se cuantifica por el método BCA (Beyotime, Jiangsu, China). Los lisados (25 g) se separaron en SDS-PAGE y luego electrotransfirió a membranas de nitrocelulosa (Whatman, Maidstone, UK). Las membranas se bloquearon durante 2 h a temperatura ambiente con polvo descremada solución de leche 5% y luego a inmunotransferencia durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra IGF1R y β-actina (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA, EE.UU.). Después del lavado, las membranas se sondaron con anticuerpos secundarios conjugados con HRP. Las señales se visualizaron con el kit de quimioluminiscencia mejorada Plus (GE Healthcare).
Los experimentos con animales
Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Cuidado de Animales de Fudan, Shanghai, China. Para los ensayos de crecimiento tumoral, las células A549 infectadas con cualquiera de los lentivirus miR-140 que sobreexpresan o el lentivirus de control se inyectaron por vía subcutánea en los omóplatos derecho de ratones desnudos (5 semanas de edad BALB /c-nu /nu, 5 por grupo, 1,5 x 10
6 celdas para cada ratón). Los ratones se observaron más de 5 semanas para la formación de tumores. El volumen tumoral (V) se controló semanalmente y se calcula usando la fórmula: V = 0,5 x longitud x anchura
2. Para los ensayos de metástasis in vivo, se inyectaron 1,5 x 10
6 A549-miR-140 o-miR-A549 de control de células en la vena caudal de los ratones nude (5 por grupo). Después de 6 semanas, los ratones fueron sacrificados y los pulmones colonización metastásica se controló y se cuantificaron.
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± SD de al menos tres experimentos independientes. La diferencia entre grupos se analizaron mediante Estudiante
t-test
cuando se comparan sólo dos grupos o de un solo sentido el análisis de varianza cuando se comparan más de dos grupos. La correlación entre el miR-140 y la expresión de IGF1R se evaluó mediante análisis de correlación de Spearman.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
La expresión de miR-140 se disminuye en los tejidos y líneas celulares de NSCLC
Para estudiar la la expresión y la importancia de miR-140 en el CPNM carcinogénesis, que mide la expresión de miR-140 en 30 pares de tejidos de NSCLC y sus tejidos pulmonares normales emparejados utilizando PCR transcriptasa inversa cuantitativa (QRT-PCR). Los resultados mostraron que la expresión de miR-140 se redujo significativamente en los tejidos de NSCLC en comparación con sus tejidos normales emparejados (Figura 1A). Además, se determinó la expresión de miR-140 en cinco líneas celulares de NSCLC. Como se muestra en la Figura 1B, los niveles de expresión relativos de miR-140 en estas células de NSCLC significativamente se disminuyeron en comparación con la de la línea normal de las células BEAS-2B. Además, se analizó la correlación entre los niveles de expresión de miR-140 y parámetros clínico. El análisis estadístico reveló que la regulación a la baja de miR-140 se correlacionó significativamente con el estadio del tumor y la metástasis, mientras que no se observó correlación significativa en otros parámetros (Tabla 1). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la regulación a la baja de miR-140 puede desempeñar un papel importante en la carcinogénesis y la progresión de NSCLC.
(A) los niveles de expresión de miR-140 en 30 pares de tejidos de NSCLC y su pulmón normal emparejado los tejidos se midieron mediante qRT-PCR. U6 snRNA se utilizó como control interno. (B) los niveles de expresión de miR-140 en la línea de pulmón de células epiteliales normales (BEAS-2B) y 5 líneas celulares NSCLC (A549: línea celular de adenocarcinoma; H157, SK-MES1, H520: líneas de células cancerosas escamosas; H460: células grandes línea celular de cáncer). *
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Número
mediana de expresión
Characteristicof casesof miR 140
P
Edad (years)≥60180.4214±0.04680.4336<60120.3751±0.0291SexMale210.3972±0.04810.5377Female90.4226±0.0352Smoking statusNo80.4219±0.03930.1834Yes220.3723±0.0436HistologyAC160.3854±0.05020.3670SCC140.3578±0.0440StageI70.5539±0.03570.0059II130.3737±0.0406III100.3005±0.0251MetastasisNo130.4932±0.04560.0008Yes170.3104±0.0413Table 1. La relación entre la expresión de miR-140 y clínico-patológicas parámetros en NSCLC.
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miR-140 inhibe la proliferación de células de NSCLC in vitro
Para entender mejor el papel de miR-140 en el desarrollo de NSCLC, primero se construyó un vector lentiviral que expresa líneas celulares estables establecidas miR-140 y, indicada como A549-miR-140 y miR-H157-140 después de la infección por lentivirus. sobreexpresión exitosa de maduro miR-140 en estas células fue confirmada por qRT-PCR (Figura 2A). Como se muestra en la Figura 2B, la sobreexpresión de miR-140 proliferación celular suprimió de forma significativa de las células A549 y H157 en comparación con sus controles correspondientes. También se encontró miR-140 sobreexpresión de inducir la apoptosis celular en células A549 y H157 (Figura 2C). En consonancia con estos resultados, miR-140 sobreexpresión provocó una acumulación de células en fase G1, y disminuyó el número de células en fase S en ambas líneas celulares (Figura 2D). Por el contrario, desmontables de miR-140 utilizando anti-miR-140 en células H520 promovido el crecimiento celular, mientras que no se detectó ningún cambio significativo en el ciclo celular y la apoptosis celular (Figura S1). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que el miR-140 es capaz de regular el crecimiento celular de NSCLC.
células A549 y H157 (A) se infectaron con miR-140 o miR-control de los lentivirus, y la expresión de miR-140 se analizó mediante qRT-PCR. (B) ensayo de viabilidad celular (CCK-8). (C) los ensayos de apoptosis celular. análisis (D) del ciclo celular. *
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miR-140 suprime la migración celular y la invasión NSCLC in vitro
además, investigó si el miR-140 también podría inhibir la migración celular y la invasión en el CPNM. Usando el ensayo de curación de la herida, se encontró que la sobreexpresión de miR-140 suprimió drásticamente la movilidad de las células tumorales en las células A549 y H157 en comparación con sus controles correspondientes (Figura 3A). Del mismo modo, transwell ensayos con Matrigel demostraron que miR-140 disminuyó notablemente la capacidad invasiva de las células A549 y H157 (Figura 3B). Por el contrario, la cicatrización de heridas y la invasión de las células H520 se incrementó cuando endógena de miR-140 fue silenciado con anti-miR-140 (Figura S1). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el miR-140 puede suprimir la migración celular y la invasión NSCLC in vitro.
La herida ensayos (A) y ensayos de invasión (B) de A549 y células H157 infectadas con el miR-140 o la curación lentivirus de control MIR. Los ensayos de invasión se determinaron usando ensayos Transwell con Matrigel. Ampliación: 100 ×. **
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miR-140 inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis en las células NSCLC en ratones desnudos
A fin de determinar el efecto de miR 140 sobre el crecimiento tumoral y la metástasis NSCLC in vivo, A549-miR-140 células y células-miR-A549 de control se inocularon subcutáneamente en el flanco de ratones desnudos y los animales fueron estrechamente monitorizados para el crecimiento del tumor durante 5 semanas. Los resultados ilustran que los tumores miR-140 que sobreexpresan fueron significativamente más pequeños en tamaño y volumen del tumor en comparación con los tumores de control (Figura 4A y B). Además, se analizó el efecto de la sobreexpresión de miR-140 en NSCLC metástasis in vivo. A549-miR-140 células y células-miR-A549 de control se inyectaron en ratones desnudos por las inyecciones vena caudal. Los ratones se sacrificaron 6 semanas después de la inyección, y sus pulmones fueron extirpados para observar nidi metastásico en la superficie de ellos. Como se muestra en la Figura 4C, el número de nódulos metástasis de pulmón se redujo drásticamente en el grupo A549-miR-140 en comparación con el grupo de control-miR-A549. Tomados en conjunto, estos resultados indican que miR-140 sobreexpresión puede suprimir la tumorigénesis y la metástasis de células de NSCLC in vivo.
(A) Fotografía de tumores formados. curva de crecimiento (B), elaborado por la medición de los volúmenes tumorales en los días indicados. (C) representante de H & amp; secciones de los tejidos pulmonares aisladas de ratones (100 ×) E-manchadas. Se contaron el número total de lesiones metastásicas en los pulmones. **
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miR-140 downregulates IGF1R atacando directamente a su extremo 3 'UTR
Para dilucidar los mecanismos moleculares por los que el miR-140 ejecuta su función, se realizaron búsquedas de posibles objetivos de miR-140 utilizando diferentes métodos computacionales, tales como TargetScan y Miranda. En particular, nos centramos en los oncogenes. IGF1R fue identificado como un objetivo candidato de miR-140, debido a que la secuencia complementaria de miR-140 fue identificado en su extremo 3 'UTR mediante análisis TargetScan (Figura 5A). Se encontró que el nivel medio de expresión de IGF1R fue significativamente mayor en los tejidos de NSCLC que en los tejidos normales emparejados (Figura S2). Además, una correlación inversa estadísticamente significativa se observó por análisis de correlación de Spearman entre los niveles de expresión de miR-140 y mRNA IGF1R (Figura 5B). Además, QRT-PCR y análisis de transferencia de Western demostraron que la sobreexpresión de miR-140 disminuyó sustancialmente la expresión de IGF1R en células A549 y H157, y que desmontables de miR-140 aumento de la expresión de IGF1R en H520 células (Figura 5C y D). Para validar si IGF1R es el blanco aguas abajo directa de miR-140, un fragmento de UTR IGF1R 3 'que contiene el sitio de unión putativo miR-140 se clonó en un vector indicador de luciferasa. ensayos de reportero de luciferasa mostraron que la sobre regulación de miR-140 disminuyó significativamente la actividad de luciferasa relativa de IGF1R-3'UTR en células A549 y H157, pero no tuvo efecto en el mutante de IGF1R-3'UTR (Figura 5E). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que el miR-140 regula a la baja la expresión de IGF1R atacando directamente a su extremo 3 'UTR.
(A) secuencias de unión putativos de miR-140 en la IGF1R 3' UTR. La mutación fue generada en el IGF1R 3 'UTR mediante la mutación de 3 nt que es reconocido por miR-140. O bien de tipo salvaje (WT) o mutante (Mut) IGF1R 3 'UTR se subclonó en el vector de doble informador de luciferasa. (B) una correlación estadísticamente inversa entre los niveles de miR-140 y de ARNm de IGF1R en los tejidos de NSCLC mediante análisis de correlación de Spearman. (C, D) la expresión de IGF1R en el A549, H157 y H520 células después de la infección o transfección se midió mediante qRT-PCR y Western Blot. Ensayo de la luciferasa (E) en las células A549 y H157 co-transfectadas con miR-140 y un indicador de luciferasa que contiene el IGF1R 3'-UTR (WT) o un mutante (Mut). Las actividades de luciferasa se midieron 48 horas después de la transfección. **
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IGF1R está implicado en la supresión inducida por el miR-140 del crecimiento celular y la invasión NSCLC
Para examinar más a fondo si miR 140 ejerce su función supresora de tumores a través de la regulación a la baja de IGF1R, se realizó la ganancia de la función y el análisis de la pérdida de función. En primer lugar, las células A549 se infectaron con construcciones lentiviral que contiene IGF1R siRNA o el control negativo. análisis de transferencia de Western confirmó que la expresión de IGF1R fue suprimida (Figura 6A). Como era de esperar, IGF1R desmontables crecimiento significativamente inhibido celular, la detención en G1 inducido, y aumento de la apoptosis en las células A549 (Figura 6B, C y D). Además, los ensayos indicaron que Transwell IGF1R downregulation suprime la invasión de células de las células A549 (Figura 6E). Estos resultados fueron similares a los efectos de miR-140 sobreexpresión. Posteriormente, las células A549-miR-140 se transfectaron con plásmidos de IGF1R que carecen de 3 'UTR. Como se muestra en la Figura 6B, C y D, la sobreexpresión de IGF1R rescatado significativamente miR-140-indujo inhibición del crecimiento celular, la detención del ciclo celular y la apoptosis. El efecto inhibidor de miR-140 en la invasión de células también fue antagonizado por IGF1R sobreexpresión (Figura 6E). Tomados en conjunto, estos datos demuestran que IGF1R es un objetivo funcional de miR-140.
células A549 se infectaron con IGF1R si específico, o transfectadas con el plásmido que carece de IGF1R 3 'UTR junto con miR-140. (A) análisis de transferencia de Western. (B) ensayo de viabilidad celular (CCK-8). análisis (C) del ciclo celular. (D) los ensayos de apoptosis celular. ensayos de invasión (E) Transwell. *
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Discusión
miRNAs han informado a desempeñar un papel importante en carcinogénesis y la progresión tumoral [23,24]. Las alteraciones de la expresión de miRNAs están implicadas en casi todos los aspectos de la biología del cáncer, incluyendo el crecimiento celular, la apoptosis, la migración y /o la invasión, y pueden funcionar como supresores de tumores u oncogenes [25]. En el presente estudio, nos centramos en el miR-140, que se ha indicado que es un posible supresor de tumor en lesiones malignas humanas. Song et al. mostró que la sobreexpresión de la proliferación celular inhibida miR-140 en ambas líneas celulares de osteosarcoma y cáncer de colon [19]. Más recientemente, Yang y colaboradores informaron de que miR-140-5p se redujo significativamente en los tejidos y líneas celulares de HCC, y su sobreexpresión suprime el crecimiento tumoral y la metástasis por dirigido al factor de crecimiento transformante β receptor 1 y factor de crecimiento de fibroblastos 9 [20]. Hasta la fecha, sin embargo, el papel de miR-140 en el CPNM carcinogénesis y los mecanismos moleculares por los que el miR-140 ejerce sus funciones siguen sin estar claros.
En este estudio, hemos demostrado que la expresión de miR-140 se redujo significativamente en tejidos y líneas celulares NSCLC. La sobreexpresión de miR-140 podría inhibir de forma eficaz la proliferación de células NSCLC, inducir la detención del ciclo celular, potenciar la apoptosis y suprimir el crecimiento tumoral en ratones desnudos. Además, miR-140 sobreexpresión reprimida significativamente la motilidad celular y la invasión in vitro y metástasis tumoral in vivo. En consecuencia, desmontables de miR-140 promueve la proliferación celular y la invasión. Estos resultados sugieren que el miR-140 podría ser un nuevo supresor de tumores de miARN en el CPNM.
Para dilucidar los mecanismos subyacentes que implica la inhibición inducida por el miR-140 en el crecimiento y la metástasis NSCLC, utilizamos diferentes algoritmos de predicción de predecir objetivos de genes de miR-140. El oncogén similar a la insulina factor de crecimiento-1 receptor (IGF1R), que se sobreexpresa frecuentemente en muchos tumores malignos y funciones como un importante regulador de la proliferación celular, la supervivencia y metástasis [26-29], fue identificado como un objetivo corriente abajo crítica de MIR -140, y esta conclusión se apoya en las siguientes pruebas: (a) la secuencia complementaria de miR-140 se identifica en el 3 'UTR del ARNm de IGF1R; (B) la sobreexpresión de miR-140 redujo significativamente los niveles de IGF1R en las células NSCLC, mientras que desmontables de expresión de miR-140 enhancedIGF1R; (C) miR-140 sobreexpresión reduce la actividad de un informador de luciferasa que contiene el tipo salvaje 3 'UTR de IGF1R mRNA; (D) los efectos inhibidores de miR-140 en la proliferación de células NSCLC, la apoptosis y la invasión fueron invertidos por la sobreexpresión de IGF1R; (F) IGF1R se reguló en los tejidos de NSCLC e inversamente correlacionada con los niveles de expresión de miR-140. En conjunto, estos datos sugieren fuertemente que el miR-140 inhibe el crecimiento de NSCLC y metástasis a través de la regulación negativa de IGF1R.
En conclusión, el presente estudio mostró que el miR-140 está regulada negativamente de manera significativa en los tejidos y líneas celulares de NSCLC. La sobreexpresión de miR-140 inhibe el crecimiento tumoral y la metástasis del NSCLC través de la orientación directa IGF1R. Nuestros datos sugieren que la regulados a la baja frecuencia de miR-140 conduce al aumento de la expresión de IGF1R y, a su vez contribuye al desarrollo y la progresión del NSCLC.
Apoyo a la Información
Figura S1.
Konckdown de miR-140 promueve la proliferación celular, la migración y la invasión de las células H520. células H520 (A) fueron transfectadas con anti-miR-140 o anti-control, y la expresión de miR-140 se analizó mediante qRT-PCR. (B) ensayo de viabilidad celular (CCK-8). (C) los ensayos de apoptosis celular. análisis (D) del ciclo celular. (E) la curación de la herida ensayos. ensayos de invasión (F) Transwell. *
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figura S2 .
IGF1R es aumentada en los tejidos de NSCLC. La expresión de IGF1R en los tejidos de NSCLC y tejidos pulmonares normales emparejados se midió mediante qRT-PCR. **
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