Extracto
Antecedentes
Hay varios tratamientos de pulmón de células no pequeñas cáncer (NSCLC) son dependientes de la histología, y la necesidad de marcadores relacionados con la histología-va en aumento. Los microARN (miRNA) son marcadores moleculares prometedores en varios tipos de cáncer y muestran diferencias en la expresión dependiendo del subtipo histológico. La familia miARN miR-200 se ha asociado con la regulación de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) /mesenquimal-epitelial (MET). EMT implica profundos cambios fenotípicos que incluyen la pérdida de adhesión célula-célula, la pérdida de la polaridad celular, y la adquisición de propiedades migratorias e invasivas que facilita la metástasis. Un doble papel de la familia miR-200 en el pronóstico de varios tumores ha sido relacionada con el origen de las células tumorales. Sin embargo, el papel pronóstico y la función de miR-200 familia en las primeras etapas del adenocarcinoma de NSCLC y carcinoma de células escamosas (SCC) no han sido bien establecida.
Métodos
se determinó la expresión de los genes miARN utilizando TaqMan Los ensayos en 155 tumores de pacientes con CPNM resecado. Se llevaron a cabo estudios funcionales en tres líneas celulares de cáncer:. H23, A-549 y HCC-44
Resultados
High miR-200c expresión se asoció con una menor supervivencia global (SG) en la totalidad cohorte (p = 0,024). Alta miR-200c (p = 0,0004) y la expresión de miR-141 (p = 0,009) se correlacionaron con el sistema operativo más corto en el adenocarcinoma - pero no en SCC. En el análisis multivariado, una puntuación de riesgo basado en el miR-141 y la expresión de miR-200c surgió como un factor pronóstico independiente para el sistema operativo en toda la cohorte (O, 2,787; p = 0,033) y en pacientes con adenocarcinoma (OR, 10,649; p = 0,002). Análisis funcional mostraron que el miR-200c, estaba relacionado con la transición mesenquimal-epitelial (MET) y la migración celular y la E-cadherina afectadas, mientras que la sobreexpresión de miR-141 reduce
KLF6
los niveles de proteína y producen un aumento de la secreción de
VEGFA in vitro gratis (H23, p = 0,04; a-549, p = 0,03; HCC-44, p = 0,02) y se asoció con una mayor densidad de la sangre de los microvasos en muestras de tumores de pacientes (p & lt; 0,001) .
Conclusión
High miR-141 y miR-200c expresión están asociados con el sistema operativo más corto en pacientes con CPNM con adenocarcinoma través de MET y la angiogénesis
Visto:. Tejero R, Navarro A, Campayo M, Viñolas N, Marrades RM, Cordeiro A, et al. (2014) miR-141 y miR-200c como marcadores de la supervivencia global en la etapa temprana de células no pequeñas de cáncer de pulmón adenocarcinoma. PLoS ONE 9 (7): e101899. doi: 10.1371 /journal.pone.0101899
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Febrero, 2014; Aceptado: June 12, 2014; Publicado: 8 Julio 2014
Derechos de Autor © 2014 Tejero et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI0900547), SDCSD de la Universidad de Barcelona y la AECC-Catalunya 2013. Rut Tejero, Anna Cordeiro, Marc Ruiz-Martínez son semejantes APIF de la Universidad de Barcelona. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer, con más de 226.000 casos nuevos en los Estados Unidos en 2012 [1]. El ochenta por ciento de los cánceres de pulmón son el cáncer no microcítico de pulmón de células (CPNM) [2], que tiene una supervivencia a los 5 años de sólo el 10% en general y del 60-70% en pacientes en estadio I, poniendo de relieve la necesidad de una novela de diagnóstico y terapéutico estrategias. La resección quirúrgica, siempre que sea posible, sigue siendo el único tratamiento curativo para las primeras etapas del NSCLC. Sin embargo, casi el 50% de los pacientes resecados experimentar recurrencia y tienen un mal pronóstico [2]. Varios nuevos tratamientos en NSCLC son histología-dependiente, y el carcinoma de células escamosas (SCC) responde de manera algo diferente de adenocarcinoma a ciertos regímenes de tratamiento [3], [4] [5]. Sin embargo, son pocos los biomarcadores pronósticos histológicos dependientes están disponibles para su uso rutinario en la práctica clínica, especialmente en pacientes resecables.
En los últimos años, los microARN (miARN) han surgido como marcadores moleculares prometedores en varios tipos de cáncer, incluyendo NSCLC [6 ]. miRNAs específicos se han descrito como marcadores pronósticos de histología específica para SCC (miR-146b y miR-155) [7] o adenocarcinoma (miR-21) [8].
La familia de miR-200 se compone de cinco miembros ubicados en dos grupos diferentes: el miR-200a, miR-200b y miR-429 comprenden el grupo 1 (cromosoma 1), y miR-200c y miR-141 comprenden el grupo 2 (cromosoma 12). Los cinco miRNAs se han asociado con la regulación de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) /mesenquimal-epitelial (MET) [9]. EMT implica profundos cambios fenotípicos que incluyen la pérdida de adhesión célula-célula, la pérdida de la polaridad celular, y la adquisición de propiedades migratorias e invasivas [10]. Este proceso es fundamental para el desarrollo embrionario y también está involucrada en la invasión tumoral y la metástasis [11]. El acto de la familia miR-200 a través de sus objetivos y ZEB1 ZEB2 [9] y TGF-β2 [12]. El miRNAs son por lo tanto capaces de hacer cumplir el fenotipo epitelial mediante la represión post-transcripcional de estos genes, lo que permite la expresión de E-cadherina y de factores de polaridad necesarias para la formación de uniones célula-célula. La familia de miR-200 parece tener un doble papel en el pronóstico del paciente. La sobreexpresión de la familia miR-200 actúa como un marcador de mejor resultado en el cáncer gástrico y de ovario [13], [14], [15]. En el cáncer de mama [16] y NSCLC [17] Por el contrario, una alta expresión de la familia de miR-200 se asocia con una supervivencia más corta. En el cáncer de mama, la familia miR-200 promueve la metástasis a través de un mecanismo no relacionados con E-cadherina, la orientación
SEC23A
, que media en la secreción de las proteínas de metástasis supresor [16]. Sin embargo, el papel de los altos niveles de miR-200 en el CPNM aún no se ha dilucidado.
En el presente trabajo, hemos analizado el papel de los miembros de la familia de miR-200 en tumores de pacientes con CPNM resecado y correlacionado nuestros hallazgos con la supervivencia global (OS) después de la cirugía, tanto en toda la cohorte y de acuerdo con los subtipos histológicos. Además, se han estudiado las implicaciones funcionales de los marcadores de pronóstico en líneas celulares de cáncer.
Resultados
Los pacientes
La Tabla 1 muestra las principales características clínicas de los 155 pacientes. La mediana de edad fue de 65 años (rango, 35-85) y el 87% eran varones. Veintiún (13,6%) pacientes tenían estatus del Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) funcional (PS) 0, y 132 (85,2%) tenían PS 1. El noventa y cuatro (60,6%) pacientes tenían enfermedad en estadio I. Setenta y tres (47,1%) pacientes tenían adenocarcinoma y 70 (45,1%) SCC. Ciento treinta y ocho (89%) pacientes eran fumadores actuales o anteriores. Veinte (12,9%) pacientes recibieron quimioterapia adyuvante (16 para el estadio II o III de la enfermedad y cuatro para la enfermedad en estadio I con T & gt; 4 cm). La mediana de seguimiento fue de 43 meses (rango, 2-160). Después de un seguimiento de 160 meses, 70 (45,2%) pacientes habían recidivado.
expresión familia y clínicas características de miR-200
pares de muestras tumorales y el tejido normal se obtuvieron de 155 pacientes con CPNM. Los cinco miembros de miR-200 se encuentran en dos grupos: el miR-200a /b, y miR-429 (grupo 1) y miR-200c y miR-141 (grupo 2). Todos los miembros de la familia miR-200, a excepción de miR-141, fueron regulados a la baja en el tumor en comparación con el tejido normal (miR-200a, p = 0,043; miR-200b, p & lt; 0,001; miR-429, p = 0,003; miR-200c , p. & lt; 0,001) (Figura S1)
los pacientes con PS 1-2 mostraron mayores niveles de miR-429 (p = 0,039) que aquellos con PS 0. los fumadores actuales tenían niveles más bajos de miR-200a ( p = 0,027) y miR-429 (p = 0,032) que los no fumadores o ex fumadores.
miR-141 y miR-200c como marcadores de OS de prueba
Uso de los puntos de corte definidos por el paquete Maxstat de R, que clasifica los pacientes que tienen altos o bajos niveles de expresión de los cinco miRNAs. Entre los 155 pacientes en la cohorte completa, aquellos con altos niveles de miR-200c tuvieron una supervivencia general más corta (p = 0,024; Figura 1A). Entre los 94 pacientes con enfermedad en estadio I, los altos niveles de miR-200c (p = 0,019; Figura 1B) y miR-141 (p = 0,03; Figura 1C) se asociaron con el sistema operativo más corto. No se observaron diferencias significativas en la SG fueron identificados de acuerdo con los niveles de expresión de los miRNAs restantes
OS acuerdo con (a) los niveles de expresión de miR-200c en toda la cohorte (N = 155).; (B) los niveles de expresión de miR-200c en pacientes en estadio I (N = 94); y (C) de miR-141 niveles de expresión en pacientes en estadio I (N = 94).
miR-141 y miR-200c en el adenocarcinoma
No se observaron diferencias en el sistema operativo de acuerdo a los niveles de expresión de cualquiera de miR-141 o miR-200c en pacientes con SCC (Figura 2A y 2B). Sin embargo, entre los pacientes con adenocarcinoma, los miRNAs identificaron dos grupos bien diferenciados. OS significar para los pacientes con adenocarcinoma con alta expresión de miR-200c fue de 61,2 meses (IC del 95% = 42,9-79,5), mientras que fue 145,5 meses (IC del 95% = 134,4 a 156,6) para aquellos con niveles bajos (P & lt; 0,001; Figura 2C ). OS significar para los pacientes con adenocarcinoma con alta expresión de miR-141 fue de 71,7 meses (IC del 95% = 44,9-81,6), mientras que fue 136,9 meses (IC del 95% = 110,9 a 1162,9) para aquellos con niveles bajos (p = 0,009; Figura 2D )
La supervivencia global según (a) los niveles de expresión de miR-200c en pacientes con SCC (N = 70).; (B) de miR-141 niveles de expresión en los pacientes con SCC (N = 70); (C) los niveles de expresión de miR-200c en pacientes con adenocarcinoma (N = 73); y (D) de miR-141 niveles de expresión en los pacientes con adenocarcinoma (N = 73).
A continuación, se analizó el efecto combinatorio de miR-141 y miR-200c mediante la generación de una puntuación de riesgo basado en la expresión los niveles de ambos miRNAs. Los pacientes con altos niveles de ambos miRNAs fueron clasificados como de alto riesgo, aquellos con niveles bajos de ambos miRNAs como de bajo riesgo, y aquellos con otras combinaciones como de riesgo intermedio. Cinco años de SG fue de 49,4% en los pacientes de alto riesgo, el 66,7% de los pacientes con riesgo intermedio, y el 100% para los pacientes de bajo riesgo (p = 0,002; Figura 3).
miR-200c tiene un mayor impacto en la migración de células de miR-141
la migración celular se midió por
in vitro
ensayo de cero después de la transfección con pre-miR-200c, pre-miR-141 o pre-miARN negativo controlar. Los altos niveles de miR-200c reducen la migración de células en comparación con el control en la línea de células H23 (p = 0,005), A-549 (p = 0,0085) y HCC-44 (p = 0,013) (Figura 4A). No se observaron diferencias significativas para el miR-141, excepto en A-549 (p = 0,043). Después de la transfección, los niveles de E-cadherina se analizaron por inmunohistoquímica (Figura 4B) y no se observaron mayores niveles en las células transfectadas con pre-miR-200c.
(A) después de 36 o 48 horas de la transfección con pre-miRNAs en las líneas celulares de cáncer, la migración celular se midió por
in vitro
ensayo de cero. Los altos niveles de miR-200c reducen la migración celular en comparación con el control en todas las líneas celulares (H23, p = 0,005; A-549, p = 0,0085; HCC-44, p = 0,013), mientras que los altos niveles de miR-141 reduce celular migración sólo en a-549 (p = 0,04). (B) los niveles de E-cadherina Se evaluaron por inmunohistoquímica y se observaron niveles aumentados en células transfectadas con pre-miR-200c en comparación con las transfectadas con pre-miR-141 o pre-miR-control en todas las tres líneas celulares.
miR-141 regula negativamente KLF6, lo que lleva a un aumento de los niveles de VEGFa
in vitro
, y se relaciona con una mayor densidad de microvasos en muestras de pacientes
Dado que el miR-141 sobreexpresión tenido previamente ha relacionado con la formación de vasos sanguíneos más altos en los tumores de ovario de modelos de ratones [18], se analizó el impacto potencial de este mecanismo en el papel pronóstico de miR-141 en el CPNM. Usando TargetScan 6.2, identificamos KLF6 como putativo objetivo de miR-141, pero no de miR-200c. La inmunotransferencia de KLF6 en H23 células transfectadas con pre-miR-200c pre-miR-141or mostró que sólo el miR-141 redujo significativamente los niveles de proteína KLF6 a las 24 h (Figura 5A). Desde KLF6 regula la expresión y secreción de VEGFA, un factor angiogénico crítica [19], hemos examinado el efecto de aumentar el miR-141 en los niveles de expresión
VEGFa
niveles. Overexpressed líneas celulares tanto de miR-141 y miR-200C en el H23, A-549 y HCC-44 CPNM y las células tratadas con DFX para producir hipoxia. Después de 48 horas, se analizaron los niveles de proteína de VEGFA en el sobrenadante de estas células. La sobreexpresión de miR-141 produjo un aumento medio del 28% en la liberación de VEGFA (H23, p = 0,04; A-549, p = 0,03, HCC-44, p = 0,02), mientras que no se observaron diferencias significativas para miR 200c, excepto en la línea celular HCC-44 (p = 0,04) (Figura 5B).
(a) la inmunotransferencia de KLF6 en las células transfectadas con el control de pre-miR-negativo o pre-miR-141 /200c . miR-141 redujo significativamente el nivel de proteína KLF6 en las tres líneas celulares. (B) Después de 48 h de transfección con pre-miRNAs en condiciones de hipoxia, la concentración VEGFA en el sobrenadante del cultivo se midió por ELISA. Todos los resultados representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. (C) Un total de 29 secciones de tejido tumoral de adenocarcinoma se analizaron por inmunohistoquímica con CD34 + como marcador buque; se muestran dos casos representativos con bajos niveles altos /de miR-141. (D) No se observaron diferencias significativas en la densidad de los microvasos sanguíneos entre los adenocarcinomas con altos niveles de miR-141 y aquellos con bajos niveles de miR-141 (p & lt; 0,001).
A continuación, trataron de determinar si existe una relación entre los niveles de expresión de miR-141 y el número de vasos sanguíneos en muestras de pacientes. Después de determinar el número de vasos sanguíneos en muestras tumorales de 29 pacientes mediante técnicas de inmunohistoquímica, usando un anticuerpo contra CD34 +, que es un marcador del endotelio de los vasos sanguíneos (Figura 5C), se clasificaron las muestras tumorales en dos grupos: los niveles altos o bajos de miR-141. La media del número de vasos sanguíneos en los tumores con niveles altos fue 22% más alta que la media en los tumores con niveles bajos (P & lt; 0,001; Figura 5D)
Los análisis multivariados
En el análisis multivariante. en toda la cohorte, se incluyeron todos los factores clínicos y biológicos con P≤0.1 uni y la puntuación de riesgo basado en el miR-141 y miR-200c expresión. El /miR-200c puntuación de riesgo de miR-141 (de alto riesgo frente a otros) surgió como un marcador pronóstico independiente del sistema operativo más corto (OR: 2,787; IC del 95% = 1,087-7,148; p = 0,033), junto con el estadio & gt; I y la edad & gt;. 65 (Tabla 2) guía empresas
En el análisis multivariado incluyendo sólo los pacientes con adenocarcinoma, la puntuación de riesgo /MIR-MIR-200c 141 también fue un factor pronóstico independiente para el sistema operativo (O, 10.649; 95% CI = 2,433 a 46,608; p = 0,002), junto con la edad & gt;. 65 (Tabla 2)
Discusión
En el presente trabajo, hemos encontrado que la alta miR 141 y la expresión de miR-200c están asociados con una menor supervivencia en pacientes con CPNM resecado adenocarcinoma, incluyendo aquellos con enfermedad en estadio temprano. Por otra parte, el efecto combinatorio de los dos miRNAs fue un factor pronóstico independiente para el sistema operativo. Diferentes mecanismos están implicados en el efecto de estos miRNAs; mientras que el miR-141 parece actuar a través de la inhibición de la angiogénesis por
KLF6
y el aumento de
VEGFa
niveles, miR-200c juega un papel en la regulación de la economía de mercado.
Recientemente, una plasticidad fenotípica se ha postulado para los procesos de EMT-MET transitorios [20]. La inducción de la MET por la sobreexpresión de miembros de la familia miR-200 es importante en un momento posterior en el proceso de metástasis. Mientras EMT permite a la célula para migrar desde el tumor primario, MET permite colonizan y producen metástasis en órganos distantes [10], [11]. De este modo, tanto la regulación negativa y la sobreexpresión de miembros de la familia miR-200 se han relacionado con un peor pronóstico. Con el fin de investigar si la regulación de MET por el miR-141 y miR-200c era la histología dependiente, se analizó su valor pronóstico en los dos principales subtipos histológicos y encontramos tanto el miR-141 y miR-200c se relacionaron con sistema operativo sólo en el adenocarcinoma pacientes. Se ha observado que NSCLC adenocarcinoma es una mesenquimales-como el tipo más tumor, ya que se ha observado que la vimentina, un marcador de células mesenquimales, se sobreexpresa en adenocarcinomas bien diferenciados y en el H23, A-549 y las líneas celulares de HCC-44 , pero no se detectó en los tejidos de SCC [21], [22]. De acuerdo con nuestros resultados, miR-200c sobreexpresión como un marcador de mal pronóstico se informó previamente en una cohorte de 70 pacientes con CPNM que constan de dos adenocarcinoma y histologías SCC [17], pero su valor pronóstico no fue examinada en el subgrupo de pacientes con adenocarcinoma. En otros modelos de tumores, como el cáncer de mama, la sobreexpresión de miembros de la familia miR-200 conducido a un aumento de la metástasis [23] y se asocia con un mal pronóstico [16]. Además, los niveles séricos elevados de miR-141 se han asociado con un mal pronóstico en el cáncer de colon [24] y los altos niveles de miR-200c con mal pronóstico en cáncer gástrico [25]. Por el contrario, una obra utilizando datos de una base de datos TCGA en línea informó que los niveles bajos de miR-200b *, miR-200a y miR-429 se relacionaron con una SG más corta en una cohorte heterogénea de pacientes con CPNM que incluyó aquellos con enfermedad metastásica [26] .
Desde miRNAs modular los niveles de varias proteínas diana en función de su secuencia, su efecto es dependiente de las proteínas expresadas en cada tipo celular [27]. Tanto el miR-141 y miR-200c están situados en la región cromosómica misma (12p13.31) y comparten el mismo sitio de partida de la transcripción [28], pero si agrupamos los miRNAs de la familia miR-200 de acuerdo a la similitud de sus semillas secuencia, podemos identificar dos grupos diferentes - miR-200 AC /429 y miR-200a /141 - que se diferencian por un cambio de nucleótido único [29]. A pesar de que el miR-141 y miR-200c están regulados transcripcionalmente de la misma manera, se diferencian en sus objetivos. Cuando analizamos el papel de miR-141 y miR-200c en EMT /MET en el H23, A-549 y HCC-44 líneas celulares, influenciado solamente miR-200c de la EMT en las tres líneas celulares. La sobreexpresión de miR-200c aumenta los niveles de la proteína E-cadherina y reduce la capacidad de migración de las células tumorales, como se demostró anteriormente por Ceppi
et al
en un panel diferente de líneas celulares de NSCLC. Ceppi
et al
investigó la expresión de miR-200C
in vitro Opiniones y en
in vivo
y una fuerte correlación inversa con la invasión se detectó. Reintroducción de miR-200c en células de NSCLC altamente invasivos /agresivos indujo una pérdida del fenotipo mesenquimal mediante la restauración de la E-cadherina y la reducción de la expresión de N-cadherina, e inhibido
in vitro
invasión de las células, así como
In vivo
metástasis formación [30]. Por otra parte, Pacurari et al. encontró que la regulación a la baja de miR-200c en muestras de tumores pulmonares SCC se correlacionó con el aumento de los niveles de DCL1, ATRX y HFE -. biomarcadores relacionados con la EMT [31]
A pesar de que el miR-141 es un miembro de la familia miR-200, se no estuvo involucrado en la EMT /MET. El
in vitro
sobreexpresión de miR-141 se relaciona con la reducción de los
KLF6
los niveles de proteína, produciendo un aumento en la secreción de
VEGFA
. Por otra parte, los tumores con altos niveles de miR-141 tenían un mayor número de vasos sanguíneos. Se ha demostrado que los fibroblastos asociados con el cáncer (CAF) aislado de los adenocarcinomas de pulmón murino secretadas abundante VEGFA y una mayor invasión de células tumorales en los estudios de cocultivo [32]. Cuando analizamos la expresión de miR-141 en el tumor y el tejido normal emparejado, no se observan diferencias significativas en los niveles de expresión, que nos lleva a especular que el papel pronóstico de miR-141 puede estar relacionado con su expresión en las células de la CAF en lugar de en células tumorales. La sobreexpresión de miR-141 podría dar lugar a la sobreproducción de VEGFA y el aumento de la neoangiogénesis, que previamente se han relacionado con el pronóstico en NSCLC [33]
Materiales y Métodos
Estudio de la población y la ética comunicado.
ciento cincuenta y cinco pacientes adultos diagnosticados con NSCLC que fueron sometidos a resección quirúrgica completa en el hospital Clínic de Barcelona, España entre marzo de 1996 y diciembre de 2009 se incluyeron en el estudio. Se obtuvo la aprobación para el estudio de la junta de revisión institucional del centro, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada participante, de conformidad con la Declaración de Helsinki.
La extracción de RNA y análisis de miARN
El ARN total y detección miARN se realizó a partir de tejidos tumorales FFPE como se describe anteriormente [34]. detección de miARN se ha realizado mediante ensayos comerciales (ensayos TaqMan microARN, Appplied Biosystems) guía
Western Blot análisis
Se realizó un análisis de transferencia de Western como se describe anteriormente [35] utilizando los siguientes anticuerpos primarios:. sc KLF6 -7158 (Santa Cruz Biotechonology) y α-tubulina (Sigma).
La inmunohistoquímica
El ensayo inmunohistoquímico, se llevaron a cabo como se describe anteriormente [36] utilizando una clase CD34 Flex monoclonal de ratón anti-humano II clon QBEND 10 listos para el uso (Dako) y anticuerpo monoclonal de ratón anti-humano-cadherina e clon NCH-38 (Dako).
cuantificación de los vasos sanguíneos
se seleccionaron cuatro áreas independientes bajo un campo de 40X y un campo 200X (0,785 mm
2 por campo) y se utiliza para contar los vasos CD34-positivas en cada una de estas áreas. Dos patólogos independientes examinaron las diapositivas, y se registró el promedio de cuatro 200X campo cuenta de vasos CD34-positivas.
Las líneas celulares, miARN transfección y cuantificación de VEGF
H23 (American Type Culture Collection) y HCC-44 (DSMZ) las células se cultivaron en RPMI 1640 (Invitrogen) que contenía suero de ternera fetal al 10% (Invitrogen). (DSMZ) las células-549 A se cultivaron en DMEM (Invitrogen) que contenía suero de ternera fetal al 10%
.
Un día antes de la transfección, 7 × 10
4 células fueron sembradas en placas de 6 pocillos. Al día siguiente, las células fueron transfectadas con 100 nM de pre-miR-141 /200c o Control pre-miR-Negativo#2 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A las 24 h post-transfección, las células fueron tratadas con 400 mM de deferoxamina para inducir condiciones de hipoxia. Después de 24 h de incubación, la concentración de VEGF en los sobrenadantes se midió por triplicado utilizando el VEGF humano Elisa Kit (ab100662, Abcam).
análisis de migración de la célula
La migración celular se midió por
in vitro ensayo de cero
[37]. 5 * 10
5 células se sembraron en una placa de un día de 12 mucho antes de la transfección con pre-miRNAs. Veinticuatro horas después de la transfección, la monocapa de células se raspó en una línea recta para crear un "cero" con una punta de pipeta de p100. La distancia de migración (micras) se evaluó a las 36 h (HCC-44) o a las 48 h (H23 y A-549) después de la transfección usando el software de Entrada cellSense 1,7 (Olympus).
Los análisis estadísticos
OS se calcula a partir del momento de la cirugía a la fecha de la muerte o el último seguimiento. Las curvas de Kaplan-Meier para la vía oral, con sus intervalos de confianza del 95% (IC), se extrajeron y se compararon mediante una prueba de log-rank. Todos los factores con un valor de p & lt; 0,1 en el análisis univariante se incluyeron en la regresión multivariante de Cox análisis para OS de prueba
se utilizó la prueba t pareada para comparar los niveles de expresión de miRNAs entre tejido tumoral y tejido normal emparejado.. Se utilizó la prueba t no pareada para comparar las diferencias entre los dos grupos. los puntos de corte óptimos de los datos de expresión de genes miARN para OS fueron evaluados por medio de la estadística log-rank máximo seleccionados utilizando el paquete de Maxstat (R paquete). La aplicabilidad de estos puntos de corte fue confirmada por el método de Kaplan-Meier. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS v18 (SPSS) y R v2.8.1. El nivel de significación se fijó en ≤0.05.
Información de Apoyo
figura S1.
Los niveles de expresión de los miembros de la familia miR-200 obtuvieron a partir de 155 emparejados tumor de NSCLC y el tejido normal. (A) Grupo 1: miR-200a, miR-200b, y miR-429. (B) Grupo 2:. MiR-141 y miR-200c
doi: 10.1371 /journal.pone.0101899.s001 gratis (TIF)