Extracto
Antecedentes
Micro ARN son pequeños no codificantes, ARN, de cadena simple que regulan negativamente la expresión génica a nivel post-transcripcional. Dado que el miR-143 se encontró que se redujeron reguladas en las células de cáncer de próstata, quisimos analizar su expresión en el cáncer de próstata humano, y poner a prueba la capacidad de miR-43 para detener el crecimiento de células de cáncer de próstata in vitro e in vivo.
resultados
La expresión de miR-143 se analizó en los cánceres de próstata humanos por PCR cuantitativa, y por hibridación in situ. miR-143 se introdujo en células de cáncer in vivo por electroporación. Se utilizaron análisis de la bioinformática y ensayos basados en luciferasa para determinar el miR-143 objetivos. Se demuestra en este estudio que los niveles de miR-143 están inversamente correlacionados con estados avanzados de cáncer de próstata. Rescate de expresión de miR-143 en las células cancerosas como resultado la detención de la proliferación celular y la supresión del crecimiento tumoral en ratones. Además, se muestra que los efectos de miR-143 están mediados, al menos en parte por la inhibición de la quinasa-5 actividad extracelular regulada por señales (ERK5). Mostramos aquí que ERK5 es un objetivo de miR-143 en el cáncer de próstata
Conclusiones
miR-143 es como una nueva diana para el tratamiento del cáncer de próstata
Visto:.. Clapé C, Fritz V, HENRIQUET C, Apparailly M, Fernández PL, Iborra F, et al. (2009) miR-143 interfiere con ERK5 señalización y abroga la próstata progresión del cáncer en ratones. PLoS ONE 4 (10): e7542. doi: 10.1371 /journal.pone.0007542
Editor: Chad Creighton, Baylor College of Medicine, Estados Unidos de América
Recibido: 23 Junio, 2009; Aceptado: September 29, 2009; Publicado: 26 Octubre 2009
Derechos de Autor © 2009 Clapé et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los proveedores de fondos tenido ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de la Agence Nationale pour la Recherche (ANR physio2006), Instituto Nacional del Cáncer (INCA) Asociación para la Investigación del Cáncer contre le (ARC), y la Fundación para la Investigación Médica (FRM). CC está apoyado por una beca de la Región Languedoc-Roussillon, y ARC. PLF es apoyado por el Ministerio de Ciencia e Innovacion FIS-PI080274
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
El cáncer de próstata (CaP) es el cáncer más frecuente y la segunda causa principal de muerte por cáncer en los hombres en los países occidentales. receptor de andrógenos (AR) es probablemente un factor crucial en la progresión del cáncer de próstata. El cáncer de próstata es dependiente inicialmente en andrógenos para el crecimiento, y la terapia de ablación de andrógenos causa regresión del tumor [1], probablemente a través de la inactivación de la transcripción de los genes diana de AR. Sin embargo, la respuesta a esta terapia es a menudo transitoria y muchos hombres desarrollan cáncer de próstata independiente de andrógenos recurrente, que tiene un pronóstico muy pobre, porque no hay un tratamiento eficaz está disponible (ver [2] para su revisión).
Recientemente, una nueva clase de pequeños RNAs se ha descrito, denominado microRNAs, que se encuentran para regular la función de ARNm mediante la modulación tanto la estabilidad del ARNm y la traducción [3], [4]. MiRNAs son pequeños no codificantes, ARN, de cadena simple de $ ~ $ 22 nucleótidos que regulan negativamente la expresión génica a nivel post-transcripcional, principalmente a través de apareamiento de bases de la región no traducida 3 '(UTR) del ARNm diana. La creciente evidencia indica que miRNAs controlan las funciones celulares básicas, que van desde la proliferación a la apoptosis [5], [6], [7]. Aproximadamente el 50% de los genes miARN se encuentran en regiones genómicas asociadas con el cáncer o en sitios frágiles [8] y algunos de ellos han mostrado estar directamente involucrados en el desarrollo y progresión del cáncer [9]. los perfiles de expresión de microARN también clasifican los tumores de linaje de desarrollo y estado de diferenciación [10]. Múltiples microRNAs han demostrado tener propiedades oncogénicas o actuar como genes supresores de tumores [9], [11]. Este es el caso de miR-15A y miR-16-1, que la expresión se pierde en el cáncer de próstata avanzado. Estos dos miRNAs muestran actividad anti-oncogénica a través de la orientación de la ciclina D1 y Wnt3A, que son mediadores de la proliferación de células cancerosas y la supervivencia [12]. Disminución de la expresión de otros miRNAs, como miR-23b, -100, -145, -221 y -222 también se ha documentado. Por otra parte, la expresión ectópica de estos miRNAs como resultado la inhibición de células de cáncer de próstata [13]. Contrariamente a estos miARN anti-oncogénicos, oncogénica miR-106b, o miR-32 han sido identificados en el cáncer de próstata. Estos proliferación celular miARN apoyo y la supervivencia de las células cancerosas Trough la orientación de p21 /WAF1 y proteínas Bim, respectivamente [14]. Lo más interesante es la observación de que algunos de los genes miARN, como miR-141 son secretadas por las células del cáncer, y se encuentran en el suero de pacientes con cáncer de próstata. Estos resultados establecen la medición de miRNAs derivados del tumor en suero o plasma como una herramienta de diagnóstico novedoso para un método no invasivo de detección de cáncer humano [15].
Hemos demostrado previamente que un tratamiento de combinación utilizando PPAR? agonistas y HDAC inhibidores de resultado en la inhibición del crecimiento de células de cáncer de próstata en ratones [16]. El análisis global de la expresión micro ARN en estas células tratadas correlacionada incrementó el miR-143 con la detención del crecimiento. En el presente estudio se determinó la expresión de miR-143 en el cáncer de próstata y se encontró que el nivel de expresión de miR-143 se redujo significativamente. Además, el nivel de expresión se correlacionó inversamente con el grado histopatológico en el cáncer de próstata humano. La transfección de células LNCaP y C4-2 in vitro con el precursor de miR-143, o la electroporación de miR-143 en xenoinjertos de cáncer de próstata en ratones demostró que el miR-143 contribuye negativamente al crecimiento de células de cáncer de próstata. Por último, la bioinformática análisis identificaron ERK5 como un gen diana potencial para MIR-143. ERK5 es conocido por promover el crecimiento y la proliferación celular en respuesta a factores de crecimiento y activación de la tirosina quinasa. Por lo tanto, persistente disminución de los niveles de miR-143 en las células cancerosas pueden estar directamente implicados en la carcinogénesis a través de la activación de la cascada activada por mitógenos proteína quinasa (MAPK) a través de ERK5. Tomados en conjunto estos resultados sugieren que miR-143 podría ser un supresor tumoral y un marcador de diagnóstico o pronóstico novela potencial en el cáncer de próstata.
Resultados
miR-143 expresión se reduce durante la progresión del cáncer de próstata
Una primera indicación de la participación de miR-143 en el cáncer de próstata se observó la disminución de la expresión de este miRNA en LNCaP y C4-2 cáncer de próstata, en comparación con las líneas de células epiteliales normales, tal como se analizó por RT-PCR cuantitativa (Fig. 1A). En consonancia con esta observación, la expresión de miR-143 se redujo fuertemente en el cáncer de próstata humano, en comparación con tejidos de la próstata normal (Fig. 1B). Además, los niveles de transcrito de miR-143 se correlacionaron inversamente con el grado histológico de cáncer de próstata humano, alcanzando el límite de detección de cánceres de alto grado (Gleason & gt; 7; Fig. 1B). Para analizar con más precisión la expresión de miR-143,
in situ
La hibridación se realizó en arrays de tejido de alta densidad, que contiene 40 tejidos de cáncer de próstata en comparación con 10 tejidos normales de la próstata. miR-143 expresión no se pudo detectar específicamente en las células de cáncer de próstata de alto puntaje de Gleason, mientras que el miR-143 se expresa en el epitelio normal de la próstata y las glándulas prostáticas (Fig. 1C). Estos resultados sugieren que la regulación a la baja de la expresión de miR-143 podría ser un evento que requiere el desarrollo o progresión del cáncer.
Un
, Cuantitativo PCR en tiempo real (qPCR) de miR-143, normalizado a la cantidad de diana RNU48 en líneas celulares de cáncer de próstata. Los niveles relativos de expresión de los genes miARN se midieron mediante la determinación de los valores de Ct de la línea celular indicada frente a las células PNT2. Los datos son medias ± SEM de tres experimentos independientes. La significación estadística, aquí y en las figuras posteriores, * & lt; 0,05; ** & Lt; 0,01; *** & Lt; 0,001.
B Opiniones, QPCR de miR-143, normalizado a la cantidad de diana RNU48 en muestras de tejido de la próstata. Los niveles relativos de expresión de los genes miARN se midieron mediante la determinación de los valores de Ct del cáncer de próstata de Gleason se indica frente a la próstata normal. Los datos son medias ± SEM de once muestras de próstata para cada grupo.
C
, Representante
In situ
tinción de hibridación de miR-143 en no tumoral humana y el tejido prostático tumoral. TMA presenta 40 tejidos de cáncer de próstata en comparación con 10 tejidos normales de la próstata. (TMA, ampliación, 400 ×).
disminución de la proliferación y el aumento de la apoptosis en el miR-143 que expresan las células de cáncer de próstata
disminución de la expresión en el cáncer de próstata sugiere que el miR-143 podría tener efectos antiproliferativos. Para probar esta hipótesis miR-143 se expresó ectópica en líneas celulares de cáncer de próstata LNCaP y C4-2. miR-143 se expresó de 5 y 12 veces mayor en LNCaP transfectadas y células C4-2, respectivamente, en comparación con las células control transfectadas con cualquiera de miARN no relevante, o con anti-miR-143, que es un inhibidor de miR-143 (Fig. 2A). No se observaron diferencias en el número de células cuando se utilizaron no relevante miARN o anti-miR-143 en estas células. En agudo contraste, el número de células se correlaciona inversamente con los niveles de expresión de miR-143 en ambos LNCaP y C4-2 líneas celulares (Fig. 2B-C). Esto sugirió que miR-143 regula negativamente la proliferación celular. En consonancia con esto, los experimentos de incorporación de BrdU demostraron que los genes miARN expresión da como resultado la inhibición de la síntesis de ADN, y por lo tanto la abrogación de la proliferación celular en estas líneas celulares de cáncer (Fig 2D). Curiosamente, estos efectos citostáticos también se correlacionaron con el aumento de la muerte celular en las células que expresan los genes miARN de cáncer de próstata, tal como se evaluó mediante experimentos de azul de tripano (Fig. 2E). Además, el análisis del ciclo celular mostró un aumento en la G
0-G
1 población, concomitantes a una disminución de la fase S en miR-143 que expresan las células (Fig. 2F). Curiosamente, el análisis FACS indicó un aumento en la muerte celular (Fig. 2G). La apoptosis fue, sin embargo, no cambió en miR-143, en comparación con las células de control según la evaluación de los experimentos de incorporación de anexina (datos no mostrados), o por el nivel de caspasa 3 48 h después de la transfección (Fig. 2H). Esto sugiere que la muerte celular observada no depende de la apoptosis, sino más bien necrosis eventos. En conjunto, estos datos sugieren que el miR-143 controla negativamente la proliferación celular y controla positivamente la muerte celular de las células de cáncer de próstata.
Un
, QPCR de miR-143 en células C4-2 (barras blancas ) y las células LNCaP (barras negras), normalizados a RNU48 48 h después de la transfección con el miR revueltos (control), miR-143 precursor o antimiR-143. Los datos son medias ± SEM de cinco experimentos independientes.
B-C
, el crecimiento celular en LNCaP (B) o C4-2 (C) células durante 48 h después de la transfección con el miR revueltos (rombo negro), el miR-143 precursora (cruz de color negro) o antimiR-143 (triángulo blanco). Los datos son medias ± SEM de tres experimentos independientes.
D
, la cuantificación de la incorporación de BrdU 48 horas después de la transfección en células C4-2 y LNCaP en ausencia de miR-143 (arriba), en presencia de miR-143 (medio) o antimiR-143 (parte inferior). Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
E
, las células con azul de tripano incorporación de C4-2 (barras blancas) y LNCaP (barras negras) 48 h después de la transfección en ausencia o presencia de miR-143 o en presencia de antimiR-143.
F
, porcentaje de células en diferentes fases del ciclo celular en las líneas celulares LNCaP y C4-2 36 horas después de la transfección con el control 5 (no relevante), el miR-143 o antimiR-143. Se obtuvieron resultados similares en dos experimentos independientes. Los resultados se expresan como media ± SEM (n = 2-4).
G
, FACS análisis de la apoptosis en C4-2 (barras blancas) y LNCaP (barras negras), las células 48 h después de la transfección en ausencia o presencia de miR-143 o en presencia de antimiR-143.
H
, relativa concentración activa la caspasa 3 en C4-2 (barras blancas) y LNCaP (barras negras) las células 48 h después de la transfección en ausencia o presencia de miR-143 o en presencia de antimiR-143. La concentración de las caspasas activas 3 se normaliza con la concentración global de proteína.
ERK5 es un miR-143 gen diana
El objetivo fue identificar el miR-143 objetivos que podrían estar implicados en la progresión del cáncer de próstata. Bioinformática análisis indicó que el 3 'UTR del gen ERK-5 humano alberga un sitio consenso putativo para (nucleótidos 2917-2932) (Figura 3A) miR-143 de unión. Para validar experimentalmente este objetivo, analizamos primera expresión ERK5 en líneas celulares de cáncer de próstata. proteína ERK5 fue altamente aumentada en LNCaP y las células de cáncer de próstata C4-2, en comparación con no cancerosas PNT2 células epiteliales prostáticas (Fig. 3B). Curiosamente, la expresión ERK5 se correlacionó inversamente con la expresión de miR-143 en estas líneas celulares (Fig. 1A). Un análisis más detallado en el cáncer de próstata humano en arrays de tejido de alta densidad mostró que la expresión ERK5, como se analizó por IHC fue altamente aumentó en el cáncer, en comparación con el tejido de la próstata normal (Fig 3C, paneles inferiores). Sorprendentemente, la expresión ERK5 se correlacionó inversamente con la expresión de miR-143, como se analizó por hibridación in situ, lo que sugiere que podría ser una ERK5
bona fide
miR-143 objetivo (Fig. 3C, comparar superior a los paneles inferiores). Para probar esta hipótesis se realizaron experimentos de sobreexpresión. La expresión ectópica de miR-143 en LNCaP, y líneas celulares de cáncer de próstata C4-2 dieron como resultado una disminución significativa en la expresión de la proteína ERK5, en comparación con las células transfectadas con los genes miARN no relevante, o con el antisentido miR-143. (Fig. 3D). Disminución de la expresión ERK5 correlacionado con disminución de la proliferación en estas líneas celulares después de la expresión de miR-143 (Fig. 2). Por otra parte, la disminución de la ERK 5 expresión en mir-143 células tratadas también se correlaciona con una disminución de la expresión de Jun, que es un objetivo conocido ERK5 (fig. 3E).
Un
, Representación esquemática de la predicho sitio diana de miR-143 en el 3 'UTR del mRNA ERK5. secuencia de semillas de coincidencia se indica. H.s ERK5 3'UTR es el Homo Sapiens 3'UTRsequence.
B Opiniones, análisis de transferencia de Western de la expresión endógena ERK5 en líneas de células normales y cancerosas de la próstata. Las expresiones relativas, normalizado a GAPDH, se midieron mediante el software Image J como un pliegue de la situación indicada en comparación con el miR revueltos. Los datos son medias ± SEM de tres experimentos independientes. C, tinción inmunohistoquímica Representante de ERK5, e hibridación in situ de miR-143 en tramos consecutivos de matriz de tejido de alta densidad.
D
, análisis de transferencia de Western de la expresión endógena en las células ERK5 C4-2 y LNCaP 48 h después de la transfección transitoria de la indicada miR-143. Expresión relativa, cuantificado por el software Image J está normalizado a GAPDH, y medidos por pliegue de la situación indicada en comparación con el miR revueltos. Los datos son medias ± SEM de tres experimentos independientes.
E
, Medida de la actividad de la luciferasa en células COS transfectadas con un gen de la luciferasa pGL3 reportero fusionado a la ERK-5 3 'UTR mutado o no con concentraciones crecientes o miR-143 (0; 25; 50; 100 Nuevo Méjico). Los valores se normalizan a la actividad de beta-galactosidasa y se expresa en pliegue o la ausencia de miR-143. barras negras, ERK5 3'UTR, barras blancas, mutante UTR 3 '; los datos son medias ± SEM para cuatro experimentos realizados por triplicado.
F
, Western blot de la expresión de c-Jun endógeno en células LNCaP 48 h después de la transfección transitoria de la indicada miR-143. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
G
, QPCR de ERK5 en las células C4-2 (barras blancas) y células LNCaP (barras negras), normalizados a 18 s gen 48 h después de la transfección con pSuper-shNeo (control) o pSuper-shERK5. Los datos son medias ± SEM de tres experimentos independientes.
H
, la cuantificación de la incorporación de BrdU en las células C4-2 (barras blancas) y las células LNCaP (barras negras) 48 después de la transfección con pSuper-shNeo (control) o pSuper-shERK5. Los datos son representativos de tres experimentos independientes.
A continuación, para demostrar aún más la hipótesis de que los efectos observados en la proliferación son el resultado de la inhibición ERK5, se realizaron experimentos de silenciamiento. expresión shRNA dirigido a ERK5 resultó en una disminución significativa en la proliferación celular en LNCaP y C4-2, en comparación con las células transfectadas con no relevante shRNA (Fig. 3F). nivel de expresión ERK5 se redujo aproximadamente un 90% en ambas líneas celulares transfectadas con el específico shERK5 (Fig. 3G).
Por último, para demostrar, además, que es un ERK5 miR-143 del gen diana experimentos de transfección transitoria se realizaron utilizando el región 3'UTR de ERK5 que contiene el miR-143 sitio coincidente putativo, mutado o no, aguas abajo del marco de lectura abierto de la luciferasa. La actividad de luciferasa de la construcción 3 'UTR ERK-Luc se redujo en presencia de miR-143, mientras que la actividad luciferasa de constructo -Luc mutado no se vio afectada, lo que sugiere que miR-143 modular la expresión ERK5 mediante la unión a ERK5-3'UTR ( la figura 3F).
rescate de expresión de miR-143 disminuye la progresión tumoral en ratones
Para investigar el efecto de miR-143 en el crecimiento del tumor, los ratones desnudos atímicos se injertaron subcutáneamente con cáncer de próstata LNCaP y células C4-2. Dos semanas después de la inoculación de las células, cuando los tumores alcanzaron un volumen medio de 392 mm
se realizaron 3, miR-143 experimentos de rescate. La inyección intratumoral de miR-143, seguido por electroporación como se describe en la sección de material y métodos resultó en la supresión o disminución en el crecimiento del tumor en ratones injertados con células LNCaP y C4-2 respectivamente (Fig. 4A y 4B), mientras que la electroporación de control no pertinentes a la PI MIR no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento tumoral (Fig. 4A y 4B). A pesar de la miR-143 rápida degradación esperada in vivo, la expresión de miR-143 se mantuvo aumentó significativamente en miR-143 tumores electroporadas (Fig. 4C). Consistente con la disminución observada en el crecimiento del tumor, la relación de proliferación de los tumores LNCaP y C4-2 también se redujo, como se cuantifica por tinción con PCNA en los tumores electroporadas con miR-143 (Fig. 4D). Por último, el análisis del nivel de proteínas mediante técnicas de inmunohistoquímica ERK5 indicó que la expresión ERK5 se redujo en presencia de miR-143 en tumores LNCaP y C4-2 (Fig. 4E). Tomados en conjunto estos resultados demostraron que el miR-143 funciona como un supresor de tumores en las células de cáncer de próstata.
A-B
, el crecimiento tumoral de LNCaP (A) o C4-2 células (B) inyecta por vía subcutánea y a electroporación tres veces con no relevante MIR (control, blanco cuadrado) o miR-143 precursora (rombo negro). Los datos son medias ± SEM de siete ratones analizados por cada grupo.
C
, QPCR análisis de miR-143 expresión en C4-2 (barras blancas) y xenoinjertos de LNCaP (barras negras), normalizado a RNU48. Los datos son medias ± SEM de siete ratones analizados por cada grupo.
D
, Análisis de la proliferación celular por tinción con PCNA en secciones de xenoinjertos de ratones desnudos atímicos inyecta por vía subcutánea con C4-2 (barras blancas) o LNCaP (barras negras) de las células después de tres electroporaciones con el miR revueltos o miR-143 precursor . Los datos son medias ± SEM de siete ratones analizados por cada grupo.
E
, tinción inmunohistoquímico Representante de ERK5 en tumores LNCaP y C4-2. ratones desnudos inyectados por vía subcutánea con C4-2 (barras blancas) o LNCaP (barras negras) después de tres células electroporaciones con el miR revueltos o miR-143 precursora. Los datos son representativos de siete ratones analizados por cada grupo. (Ampliación de 400 ×).
Discusión
Hemos analizado la expresión y los efectos de miR-143 en el desarrollo del cáncer de próstata y la progresión. Algunos estudios han demostrado previamente que el miR-143 podría desempeñar un papel en la tumorigénesis ya que su expresión se reduce en varios tipos de cáncer [19]. Se presentan dos conclusiones principales de este estudio. En primer lugar, nos muestran que la expresión de miR-143 está claramente regulado por disminución en la progresión del cáncer de próstata. estrategias de cribado han resultado en la detección del cáncer de próstata en las etapas anteriores y progresivamente menores niveles de riesgo pronóstico [20]. En muchos hombres, el cáncer de próstata tiene una larga historia natural, mientras que otros entrarán en fase metastásica y morir a causa de su enfermedad (revisado en [21]). A pesar del valor aceptado para medir los niveles de antígeno de la próstata (PSA)-specifc para la detección de diagnóstico de cáncer de próstata, su valor como marcador pronóstico sigue siendo un tema de debate. Otros parámetros relacionados con el tumor, incluyendo la estadificación clínica utilizando el sistema TNM, el grado Gleason de la biopsia y el nivel (PSA) en suero pretratamiento del antígeno prostático específico se utilizan actualmente para clasificar a los pacientes como al bajo, intermedio o alto riesgo para el desarrollo de cáncer agresivo [22] - [24]. Ningún análisis es capaz, sin embargo, para identificar adecuadamente a todos los pacientes con cáncer de próstata localizado que tienen una alta probabilidad de progresión después de la terapia. Nuestra conclusión de que el miR-143 se encuentra en el límite de detección de cáncer de próstata agresivo podría ayudar a identificar a estos pacientes. En concordancia con nuestros hallazgos expresión de miR-143 se ha encontrado para ser disminuido también en otros tipos de cáncer, como el cáncer de colon [25], tumores malignos de células B [26], cáncer de próstata [27], tumores de la hipófisis [28], o de cuello de útero cáncer [29]. Esta baja regulación de miR-143 en muestras de cáncer de próstata se ha sugerido para reflejar la etapa de diferenciación inferior del tejido tumoral en comparación al tejido normal [30]. Otros estudios prospectivos para validar el miR-143 como un objetivo predictivo de la progresión del cáncer de próstata están garantizados.
El segundo hallazgo importante de nuestro estudio es la observación de que el rescate de miR-143 expresión en células de cáncer de próstata en los resultados de la abrogación de crecimiento de células de cáncer, tanto in vitro como en ratones. Hemos demostrado, por primera vez, que el miR-143 es un supresor de tumores en ratones. Otros estudios han apuntado a una función supresora de tumores de miR-143 en dos puntos, y otras células del cáncer [26], en particular mediante la inhibición de KRAS, y las proteínas ERK5 [26], [31]. Se ha demostrado que ERK5 podría ser un objetivo directo o indirecto de miR-143 [32]. Mostramos ahora y nos proporcionan pruebas suficientes para demostrar que ERK5 es un objetivo directo de miR-143 en el cáncer de próstata. Esto es apoyado por la presencia de miR-143 en el sitio de unión 3'UTR del ARNm ERK5. Además, miR-143 inhibe la expresión de una proteína indicadora cuando este sitio de unión sustituye a la 3'UTR del ARNm de luciferasa. Por último, la expresión de la proteína ERK5 está inversamente correlacionada con la expresión de miR-143 en los cánceres de próstata humanos. ERK5 ha sido implicado en la regulación de la proliferación celular, y es el más MAPKK identificado recientemente [33]. Las actividades de varios factores de transcripción, en su mayoría implicados en el cáncer se ha demostrado que ser regulada por ERK5, incluyendo MEF2, c-Fos y FRA1, Sap-1, c-Myc y NF-kappaB [34] - [37]. De acuerdo con nuestra sobreexpresión resultados ERK5 está asociado con cáncer de próstata metastásico e induce la proliferación, la motilidad y la invasión en las células de cáncer de próstata [38].
En resumen, hemos demostrado que miR-143 es un supresor de tumor miARN en cáncer de próstata , que controla la proliferación celular y la supervivencia a través de la modulación de, por lo menos en parte la expresión ERK5. Rescate de los genes miARN expresión en los tumores de próstata se debe, por tanto, considerarse como nueva diana para el tratamiento del cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Ética declaración
Todas las muestras humanas fueron adquiridos. Nuestros proveedores de Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA) tiene los permisos requeridos.
Las muestras clínicas
Treinta y siete (13 normales y 24 ARN no apareadas de tumores de diferentes pacientes ) y uno emparejado tumor de próstata y sus ARN de tejidos no afectados de los alrededores se obtuvieron de Biochain (Hayward, CA), Cytomix (Lexington, MA).
Animals., y la electroporación in vivo
atímicos macho los ratones nude (Foxn1 nu /nu) (Harlan, Grannat, Francia) se utilizaron a la edad de 7 semanas. Todos los procedimientos se realizaron en cumplimiento de la Convención Europea para la Protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y aprobados por el Comité d'Ethique du IRCM de Montpellier, que es el comité de ética local. Xenoinjertos fueron establecidos por inyección subcutánea de 2 x 10
6 LNCaP o C4-2 células en 100 ul de una solución de Matrigel. mediciones de volumen del tumor se tomaron cada dos días justo antes de la electroporación. En la eutanasia, los tumores fueron extirpados y congelados, ya sea para la extracción de RNA o fijados en formalina al 4% para el análisis inmunohistoquímico. Para la electrotransferencia intra-xenoinjerto, los ratones se anestesiaron por inyección intra-peritoneal de una mezcla de ketamina (30 mg /kg) y xilazina (/10 mg Kg) solución. 500pmole del precursor de miR-143 o revueltos MIR se inyectaron en 100 l de PBS en el xenotrasplante. Antes de las inyecciones, se aplicó gel ecográfico, pulsos eléctricos transcutáneos se aplicaron usando dos electrodos de placa de acero inoxidable a medida colocados a ambos lados del xenoinjerto como se describió previamente (Takei et al., 2008). En pocas palabras, 8 de onda cuadrada pulsos eléctricos de 50 ms de longitud, y una tensión de salida de 100 V /cm fueron generados por un electropulsator ECM-830 (BTX, San Diego, CA, EE.UU.).
Cultivo de células y transfección
PNT2 de próstata línea de células epiteliales se obtuvo de ECACC (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia). El LNCaP andrógeno-sensibles y las líneas de células independientes de andrógenos C4-2 humanas de carcinoma de próstata fueron adquiridos de ViroMed Laboratorios (Minnetonka, MN). se mantuvieron Estas líneas celulares como se describe anteriormente [16]. Las transfecciones con miR-143 precursor, anti-MIR 143 (HSA-mir-143, Ambion) se realizaron a una concentración de 50 nM con Dharmafect 2 (Dharmacon, Lafayette, CO). El control es un precursor de miR no relevante, que se maduró en una forma estable por la maquinaria de RNAi. El anti-miR-143 es capaz de inhibir miR-143 presente en las células por hibridación. Para desmontables transfecciones nivel de proteína ERK5 se realizaron con 2 g de plásmido pSuper-shERK5 o con un control negativo, pSuper-shNeo con JetPEI transfectante. Después de 48 h, las células se trataron con BrdU y luego se fijaron con 4% de paraformaldehído para el análisis adicional.
aislamiento de ARN, la transcripción y cuantitativa en tiempo real inversa se realizaron PCR
experimentos
RNA total y QPCR como [17] .Las secuencias de oligonucleótidos descritos utilizados para diversos experimentos en este manuscrito están disponibles bajo petición.
cuantitativa en tiempo real PCR para madura microARN
cDNA se transcribe de forma inversa a partir de 10 ng del total las muestras de ARN utilizando cebadores específicos de Taq Man microARN ensayos y reactivos del kit de microARN transcripción inversa Taq Man (Applied Biosystems). El ADNc resultante se amplificó por PCR usando cebadores Taq hombre MicroARN de ensayo con Taq hombre universal PCR Master Mix y se analizó con las instrucciones de un 7,300 Sistema Detector de Secuencia ABI PRISM acuerdo de fabricación (Applied Biosystems). Utilizando el método comparativo CT, se utilizó control endógeno (RNU48) para normalizar los niveles de expresión de los genes miARN. Los nombres de ensayo para el miR-143 y U48 fueron los siguientes:. HSA-mir-143 para el miR-143 y RNU48 para U48 ARN
objetivo de predicción MicroARN
Se utilizó Objetivos miRBase (http: //microrna.sanger.ac.uk/targets/v5/) y TargetScan (http://www.targetscan.org/) para la predicción de destino microARN.
miR indicador de luciferasa Los ensayos
el 3'UTR o mutante 3'UTR de ERK5 se clonaron en el sitio XbaI del pGL3-control Vector, inmediatamente aguas abajo del codón de parada de la secuencia codificante de luciferasa. Las células COS se co-transfectaron con 0,5 g de vectores basados en pGL3 y diferentes concentraciones de miR-143 precursor como se indica, utilizando Lipofectamine 2000. mediciones de la actividad de la luciferasa se normalizaron para la actividad de β-galactosidasa para corregir las diferencias en la eficiencia de la transfección.
inmunotransferencias
La extracción de proteínas y Western blot análisis se realizaron como se describe anteriormente [18]. Los filtros se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo de conejo anti-ERK5 (Cell Signalling Technology, Danvers, MA) y después de 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con peroxidasa. El complejo se visualiza con un aumento de quimioluminiscencia (Interchim, Montluçon, Francia).
Array inmunohistoquímica de ERK5
Las matrices tisulares (TMA) que contiene 7 AccuMax normal y 39 puntos de adenocarcinoma de diferentes pacientes se obtuvieron de Alphelys (Plaisir, Francia). Para la tinción inmunohistoquímica, las TMA se agotaron de parafina con xileno, rehidrata y se hierve (95 ° C, 30 min) en tampón de citrato 0,01 M de sodio. Después del bloqueo de los receptores Fc con PBS que contenía 5% de suero de cabra, las secciones se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-ERK5 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante la noche a 4 ° C. La inmunotinción se reveló utilizando conjugado con peroxidasa anti-conejo o anti-ratón anticuerpo secundario (Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pennsylvania) y diaminobencidina cromógeno (Dako, Carpinteria, CA) como sustrato. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina (Vector, Burlingame, CA). solución de montaje (Dako) y la cubierta se desliza y se añadieron a las secciones.
BrdU tinción
se incubaron células
La proliferación C4-2, LNCaP y PNT2 durante 6 h con BrdU. Las células cultivadas en cubreobjetos se fijaron con 4% de formaldehído en PBS durante 15 min a 4 ° C y después se lavaron en PBS y se permeabilizaron durante 10 minutos en 0,25% de Triton X-100 en PBS. Después de permeabilización, el ADN fue desnaturalizado en HCl 2N durante 10 min, y las células se incubaron con tampón de bloqueo (PBS-1% BSA). entonces BrdU se detectó con el anticuerpo monoclonal anti-BrdU (Dako, Carpinteria, CA) y se visualizó con un anticuerpo secundario FITC anti-ratón (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA).
La hibridación in situ
sondas LNA-modificados (Exiqon) eran extremo 3 'marcado con digoxigenina-ddUTP con transferasa terminal usando el kit de etiquetado de extremo 3' Dig (Roche Diagnostics, Francia). 5 secciones micras-delgadas se agotaron de parafina con xileno y se rehidrataron en una dilución en serie de etanol (2 × 100%, 75%, 50%, 25%). Los portaobjetos se lavaron con PBS, se digirieron con proteinasa K (10 mg /ml) durante 5 min a 37 ° C, se enjuagaron en 0,2% de glicina /PBS a continuación en PBS, y postfijo con 10% de formaldehído en PBS (10 min). Los portaobjetos se aclararon con PBS (2 X). Las láminas fueron entonces hibridaron previamente a 54 ° C durante 2 horas en tampón de hibridación (50% formamida, 5 x SSC, 0,1% de Tween-20, se ajustó a pH 6,0 con ácido cítrico 9,2 mM, 50 mg /ml de heparina, 500 g /tRNA de levadura ml) . A continuación, los portaobjetos se hibridan en cámaras de incubación durante la noche a 54 ° C en un horno con movimiento constante, por medio de 2 l de sonda en ~ 200 l de tampón de hibridación precalentado. Las secciones se enjuagaron dos veces en 2 x SSC, seguido de 3 lavados de 30 min a 54 ° C en formamida al 50% /2xSSC. Las secciones se enjuagaron a continuación 5 veces en PBS /0,1% Tween-20 (PBST), y se bloquearon durante 1 h en solución (2% de suero de oveja, 2 mg /ml de BSA en PBST) de bloqueo.