Extracto
La expresión aberrante de microARN-146a (miR-146a) se ha informado a participar en el desarrollo y la progresión de diversos tipos de cánceres. Sin embargo, su papel en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) no ha sido dilucidado. El objetivo de este estudio fue investigar la contribución de miR-146a a diversos aspectos del fenotipo maligno de NSCLC humanos. En experimentos funcionales, miR-146a suprimió el crecimiento celular, la apoptosis celular inducida y aguas abajo de señalización inhibido EGFR en cinco líneas celulares de NSCLC (H358, H1650, H1975, H292 y HCC827). miR-146a también inhibió la capacidad de migración de estas células de NSCLC. Por otro lado, miR-146a aumentó la inhibición de la proliferación celular por fármacos dirigidos a EGFR, incluyendo tanto TKIs (gefitinib, erlotinib, y afatinib) y un anticuerpo monoclonal (cetuximab). Estos efectos fueron independientes del estado de mutación de EGFR (de tipo salvaje, la sensibilización de la mutación o mutaciones de resistencia), pero fueron menos potente en comparación con los efectos de siRNA dirigidos de EGFR. Nuestros resultados sugieren que estos efectos de miR-146a son, debido a su orientación de la señalización de EGFR y NF-kB. También encontramos, en parafina fijados con formol y embebidos clínica muestras (FFPE) de cáncer de pulmón, que la baja expresión de miR-146a se correlacionó con estadios TNM clínico avanzado y metástasis a distancia en el CPNM (
P Hotel & lt; 0,05). Los pacientes con alta expresión de miR-146a en sus tumores mostraron supervivencia libre de progresión más larga (25,6 semanas en los pacientes de alto miR-146a frente a 4,8 semanas en pacientes de bajo miR-146a,
P Hotel & lt; 0,05). Por lo tanto, el miR-146a es un fuerte candidato biomarcador pronóstico en NSCLC. Por lo tanto inducir miR-146a podría ser una estrategia terapéutica para el NSCLC
Visto:. Chen G, Umelo IA, Lv S, Teugels E, K Fostier, Kronenberger P, et al. (2013) miR-146a inhibe el crecimiento celular, la migración celular e induce la apoptosis en células no pequeñas células del cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (3): e60317. doi: 10.1371 /journal.pone.0060317
Editor: P. Srikumar Chellappan, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 4 de octubre de 2012; Aceptado: February 25, 2013; Publicado: 26 Marzo 2013
Derechos de Autor © 2013 Chen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por el fondo de investigación de Boehringer Ingelheim GmbH. No se recibió financiación externa adicional para este estudio. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores recibieron fondos de una fuente comercial: Boehringer Ingelheim GmbH. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) comprende 75-85% de los recién diagnosticado los cánceres de pulmón. Más del 70% de los pacientes con CPNM presentan con enfermedad avanzada, y la tasa de supervivencia global a 5 años para el NSCLC es sólo el 16%. Para el cáncer de pulmón localmente avanzado en estadio temprano o, la cirugía es el tratamiento más eficaz, y la quimioterapia de combinación es el enfoque estándar adyuvante. Durante la fase III /IV NSCLC, la quimioterapia combinada basada en platino es el tratamiento de referencia actual, pero con mucho margen de mejora [1], [2]. Pulmón carcinogénesis es un proceso de múltiples etapas, que resulta de la activación de oncogenes y la inactivación de genes supresores de tumores. Los mecanismos moleculares que subyacen en el desarrollo de NSCLC se encuentra todavía poco conocidos. Por lo tanto, una mejor comprensión de estos mecanismos será útil para desarrollar nuevas dianas y estrategias terapéuticas para el tratamiento del NSCLC humano [3], [4], [5].
En los últimos años, los microARN (miARN) han recibido una atención creciente en la investigación del cáncer. Estos ARN pequeños, no codificantes pueden inhibir la expresión del gen diana mediante la unión a la región no traducida 3 'del ARNm diana, dando como resultado o bien la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción. MiRNAs juegan papeles importantes en muchos procesos biológicos normales que implican una proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la resistencia al estrés [6], [7]. Sin embargo, los estudios también han demostrado que la expresión de los genes miARN aberrante o mutación se correlaciona con el desarrollo y progresión de cánceres. El miRNAs pueden tener actividades supresores de tumores oncogénicos o, y por lo tanto miRNAs están emergiendo como objetivos para la terapia del cáncer [8]. Además, los miRNAs podrían ser utilizados como biomarcadores de pronóstico y diagnóstico de cáncer.
La expresión de miR-146a se ha encontrado para ser de hasta reguladas en el carcinoma papilar de tiroides [9], cáncer de tiroides anaplásico [10] y cáncer de cuello uterino [11], lo que sugiere miR-146a podría funcionar como un miARN "oncogénico" en estos tipos de cáncer. Sin embargo, se informó de una menor expresión de miR-146a en el cáncer de próstata [12], el cáncer de páncreas [13] y el cáncer gástrico [14], [15]. Por lo tanto, el papel de miR-146a puede variar en diferentes tipos de cánceres. Además, el nivel de miR-146a se ha encontrado que se correlaciona con la progresión metastásica de los tumores orales [16]. Funcionalmente, las células-146a-expresión de miR muestran notablemente afectada la invasión y capacidad de migración en relación con las células control tanto en el cáncer de mama [17] y el cáncer de páncreas [13]. Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que la modulación de los niveles de miR-146a tiene un potencial terapéutico para suprimir la invasión y metástasis. Sin embargo, hasta donde sabemos, ningún estudio ha evaluado la asociación entre el miR-146a y células de NSCLC. Además, no hay datos disponibles sobre los efectos de miR-146a sobre la biología de las células NSCLC. miR-146a puede dirigirse a EGFR, basado en el emparejamiento de bases predicho mediante el uso de análisis miRBase [18], que ha sido confirmado funcionalmente en el cáncer de mama [17], [19] y el cáncer de páncreas [13]. EGFR desempeña un papel crítico en NSCLC y la actividad de inhibidores de la tirosina quinasa del EGFR (TKIs) en NSCLC, especialmente en la presencia de mutaciones activadoras de EGFR [20]. La vía de señalización EGFR transducción complejo implica la cascada de Ras /MAPK, fosfatidil inositol 3-quinasa (PI3K), transductor de señales y activador de la transcripción (STAT), y la proteína quinasa aguas abajo C (PKC) [21]. Además, EGFR activa NF-kappa B mediante la fosforilación de I? B [22]. Por otra parte, el miR-146a juega un papel en la regulación de NF-kB [13], [17], [19], [23] en diferentes tumores malignos, aunque NF-B no es un objetivo directo de miR-146a. Además, la relación entre el miR-146a y la señalización del EGFR o NF-kB no ha sido dilucidado.
La importancia potencial de este miARN en particular, miR-146a, nos llamó la atención en los experimentos que hemos realizado y que antedated el descubrimiento de su papel en otros tumores malignos o su relación con el mRNA EGFR. En estos experimentos no publicados, perfilamos miARN expresión en células Ba /F3 transfectadas con los genes de tipo salvaje y mutantes EGFR, respectivamente, utilizando una matriz basada en perlas líquido descrito anteriormente [24]. perfiles comparativos miARN se obtuvieron en condiciones de línea de base y en tratamiento con ITC del EGFR. La plataforma era una plataforma propiedad de la casa e incluyó 425 miRNAs. miR-146a era el miARN que más fuertemente correlacionada con el estado mutacional de EGFR, y tenía la mayor variación en respuesta al tratamiento TKIs en células de NSCLC mutantes EGFR y células Ba /F3 transfectadas con EGFR mutante en comparación con las células de tipo salvaje de EGFR. Al mismo tiempo se identificó la homología de secuencia con EGFR [18].
Impulsada por estos resultados, se determinó adicionalmente el efecto de miR-146a sobre el crecimiento celular, la apoptosis y la motilidad de células de NSCLC humanos. Además, los efectos de un imitador miR-146a se examinó cuando se combina con EGFR TKI (gefitinib, erlotinib, y afatinib) y un anticuerpo monoclonal (cetuximab), específicamente en las líneas celulares de NSCLC que son resistentes a EGFR TKIs. Por último, la relación entre la expresión de miR-146a y los parámetros clínicos y el pronóstico también se exploró usando (FFPE) muestras de cáncer de pulmón en parafina fijados con formol.
Materiales y Métodos
Líneas celulares y reactivos
las líneas celulares de cáncer humanas H358, H1650, H1975, H292 HCC827 y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (
ATCC, Países Bajos
) y se cultivaron como se ha descrito anteriormente [25], [ ,,,0],26]. El cetuximab anticuerpo monoclonal-EGFR específico (2 mg /ml), EGFR TKIs gefitinib y erlotinib, y un inhibidor de panHER de EGFR, HER2 y HER4 cinasas, afatinib (BIBW 2992, Boehringer Ingelheim GmbH), se prepararon como se describe anteriormente [25] , [26].
Re-expresión y la inhibición de miR-146a en las células NSCLC
células de NSCLC se sembraron en una placa de 24 pocillos (2,5 x 10
4 células por pocillo ) o una placa de 96 pocillos (2,5 x 10
3 células por pocillo) y se incubaron a 37 ° C durante 24 hrs. Las células fueron transfectadas con un imitador de miR-146a, un miARN imitan control negativo, un inhibidor de miR-146a, o un control negativo inhibidor de miARN (
Ambion, Life Technologies Europe BV, Gent, Bélgica
), respectivamente, en una concentración final de 60 nmol /L utilizando Lipofectamine
TM 2000 (
Cat. No. 11668-019, Invitrogen Merelbeke, Bélgica
). Las células fueron transfectadas con los genes miARN imitan o miARN inhibidor diaria. Después de 5 días de la transfección, las células se dividieron y se transfectaron de nuevo diariamente hasta el día 10 [13]. El siRNA EGFR se describió anteriormente [25], [27] (secuencia: GCAAAGTGTGTAACGGAATAGGTAT). El siRNA EGFR se transfectó en células de NSCLC con el mismo método que el anterior
Las muestras de tejido
recogidos tejidos de 101 pacientes consecutivos. (Rango de edad de 29 a 83 años, con una media de 68,3 años) que habían sido sometidos a resección quirúrgica o biopsia para el NSCLC en las dos instituciones. Una muestra de tejido pulmonar normal no afectado también se recogió de 76 pacientes y se utiliza como control emparejado. Todas las muestras se procesaron para examen patológico. El protocolo de estudio fue aprobado por los comités éticos locales del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Guangxi, China y Universitair Ziekenhuis Brussel (UZ Brussel), Bélgica. consentimientos informados escritos fueron obtenidos de todos los pacientes. Los parámetros clínico se describen en la Tabla 1.
RT-qPCR
in vitro
experimentos en el aislamiento de ARN, ARN, la normalización y la transcripción reversa fueron las descrito anteriormente [25], [27], [28]. Para el tejido FFPE clínica, los bloques se seccionaron a un espesor de 10 micras (3 secciones para el aislamiento de ARN total). El tejido se desparafina por xileno y etanol. El RNA total se aisló de secciones de tumor utilizando el Kit miRNeasy FFPE (
QIAGEN, KJ Venlo, Países Bajos
) de acuerdo con las instrucciones del fabricante con modificaciones cambiando el tiempo de incubación después de la mezcla con proteinasa K a 36 horas a 55 ° C, por su parte, la adición de proteinasa K cada 12 horas para mantener su concentración. Dependiendo del tamaño de la muestra de tumor, la concentración de ARN osciló entre 20 ng /l a 2 g /l detectada por Nanodrop 2000 (
Wilmington, DE 19810 EE.UU.
). Intrón-que abarca RT-PCR primers específicos para EGFR o ARNm de GAPDH fueron descritas anteriormente [25], [28], [29]. Los cebadores para miR-146a y RNU6B se incluyeron en TaqMan
® Micro RNA ensayos (
4427975-000.468, Applied Biosystems, Life Technologies Europa BV, Gent, Bélgica
). Los cebadores inversos también se utilizaron en la etapa de transcripción inversa con TaqMan
® Micro RNA transcripción reversa Kit (
4366596, Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Gent, Bélgica
), en un volumen total de 10 l . En tiempo real qPCR para EGFR mRNA se realizó de la Roche LightCycler
® 1,5 instrumento con detección de verde SYBR y análisis de curva de fusión, como se describe anteriormente y para miRNA, se utilizó [28] Applied Biosystems PCR7900. El ARNm diana o abundancia miARN en cada muestra se normalizó a GAPDH su referencia o RUN6B según ha informado [25], [27], [30].
El crecimiento celular
El crecimiento celular se evaluó mediante un tetrazolio colorimétrico (MTS) ensayo (
una solución acuosa CellTiter96 ensayo de proliferación celular G3580, Promega, Madison, EE.UU.
). El miARN mímica, el inhibidor de miARN o siRNA fueron transfectadas al día durante 0, 5 y 10 días. Para los experimentos que combinan imitador miR-146a y otros agentes (EGFR TKIs y mAb), el imitador miR-146a fue transfectado inicialmente en las células, y, posteriormente, las células se cultivaron durante 7 días. Se añadieron los otros agentes en el 7
º día, y el cultivo celular se prolongó durante otros 3 días. El protocolo fue como se describe anteriormente [25].
La viabilidad celular
Para confirmar aún más los datos del ensayo de MTS, la viabilidad celular fue detectado por detección fluorimétrica de resorufina (
CellTiter-Blue Ensayo de viabilidad celular, G8080, Promega, Madison, EE.UU.
) como se ha descrito anteriormente [25].
caspasa-3/7 actividad de detección
se midió la actividad de caspasa-3/7 usando una rodamina sintético marcado sustrato de la caspasa-3/7 realizado inmediatamente después de la detección de la viabilidad celular en los mismos pozos como se describe anteriormente [25].
evaluación microscopía fluorescente de la apoptosis celular y la morfología
la efectos de la mímica de miR-146a, o un inhibidor de EGFR o siRNA sobre la apoptosis y la morfología nuclear en las células fueron evaluados por Hoechst 33342 y yoduro de propidio (PI) doble tinción fluorescente de la cromatina como se describe anteriormente [25].
Wound- curación de ensayo
Las células se sembraron en pocillos individuales de una placa de cultivo de 6 pocillos. La transfección se realizó como arriba. Antes de la transfección, una punta de pipeta de 10 l estéril se utiliza para rascar una franja longitudinal de diámetro constante en la monocapa confluente. Los restos de células y medio se aspiró de distancia y se reemplaza con 2 ml de medio fresco. Las fotografías fueron tomadas a los 0, 36, 72 y 108 horas después de la herida. Para el análisis estadístico, diez campos seleccionados al azar a lo largo de cada herida fueron marcados, y se midió el área de la herida y la media se calculó como el área de la herida de esta herida. El = área de la herida de curación de heridas área de la zona de 0 hrs-herida de 36, 72 o 108 horas, respectivamente, de cicatrización de heridas área se comparó primero a la zona de la herida de 0 horas, y, finalmente, en comparación con el control simulado.
Western blot
Después de ser tratado por los períodos indicados, las células se lavaron con PBS y se lisaron en un tampón que contiene Tris /HCl (pH 7,6) 20 mM, NaCl 150 mM (pH 6,85), EDTA 1 mM (pH 8), TRITON-X 1%, Na-pirofosfato 2,5 mM, ortovanadato de sodio (Na3VO4) 1 mM, leupeptina 1 mg /ml, cócteles de inhibidores de proteasa 1% y el inhibidor de fosfatasa cócteles 1% (
Sigma -Aldrich NV /SA, Bornem, Bélgica
). Los lisados se centrifugaron a 12.000 xg durante 10 min a 4 ° C y se hirvieron durante 5 min. La concentración de proteína del lisado se detecta mediante el ensayo de proteínas Bradford de Bio-Rad (
Nazaret Eke, Bélgica
) y 25 g de proteína desnaturalizada se sometió a SDS-PAGE (gel 10% SDS-acrilamida) con una tampón de carga que contiene 80 mM Tris-HCl (pH 6,8), 5% SDS, 10% de glicerol, EDTA 5 mM (pH 8), 5% de 2-mercaptoetanol, 0,2% Bromophenolblue y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM como se describe anteriormente [25]. La membrana se incubó con los siguientes anticuerpos primarios como se indica: EGFR (
Señalización Celular
), fosfo-EGFR (Tyr1173, clon 9H2,
Upstate
), fosfato ERK1 /2 (pTpY185 /187,
Invitrogen
), fosfo-AKT /PKB (Ser473,
Invitrogen
), fosfo-STAT3 (Tyr705, 3E2,
señalización celular
), fosfo-STAT5 ( Tyr694,
BD Biosciences
), fosfo-I? B? (Ser32 /36, 5A5,
señalización celular
), I? B? (L35A5,
señalización celular
), fosfo-NF kappa B p65 (Ser536,
señalización celular
), NF-kB (
señalización celular
), fosfo-IRAK-1 (Ser376,
Santa Cruz Biotechnology
), IRAK- 1 (
Santa Cruz Biotechnology
) y β-actina (
Sigma-Aldrich NV
.).
El análisis estadístico
SPSS19.0 se utilizó para análisis estadístico. Los resultados fueron representativos de tres experimentos independientes a menos que se indique lo contrario. Los valores se presentan como la media ± desviación estándar (SD). Una forma de análisis de la prueba de varianza (ANOVA) se utilizó para analizar la significación entre los grupos. El método de mínima diferencia significativa (LSD) de comparaciones múltiples con el grupo de los padres y de control se aplicó cuando la probabilidad de ANOVA fue estadísticamente significativa. El análisis de supervivencia se realizó mediante la prueba de log-rank y el enfoque de Kaplan-Meier parcelas. La significación estadística se determinó a un
P Hotel & lt; 0,05. En el análisis de aditividad y sinergia, el teórico cero interacción (exactamente aditivo) dosis-respuesta de la curva para cada combinación de miR-146a imitan + fármaco se calculó aplicando la dicha criterio de independencia [31], [32]. La evaluación estadística del efecto aditivo o sinérgico se hizo comparando cada miR-146a imitan + curva dosis-respuesta del fármaco con la curva de la independencia de Bliss. La sinergia se concluye cuando el miR-146a curva dosis-respuesta de drogas imitan + es más alto que los intervalos de confianza del 95% a la respectiva curva de la independencia de Bliss, mientras que la aditividad es cuando la curva dosis-respuesta de drogas imitan miR-146a + es inferior a la de la dicha curva de la independencia y más alta que la curva de tratamiento individual. El análisis de la aditividad y sinergia también se evaluó por el programa Biosoft Calcusyn (Ferguson, MO, EE.UU.). El índice de combinación (CI) se utilizó para expresar sinergismo (CI & lt; 1), efecto aditivo (IC = 1), o el antagonismo (CI & gt; 1). [33]
Resultados
MIR -146a inhibe el crecimiento celular e induce la apoptosis celular en las células NSCLC
en primer lugar la expresión de línea de base de miR-146a se evaluó en todas las líneas celulares estudiadas por el tiempo real el ensayo de RT-qPCR. La eficacia de transfección de la mímica de miR-146a y el inhibidor también se verificó por primera vez por el ensayo de RT-qPCR. Se analizó el nivel de expresión de miR-146a a los 5 y 10 días después de la transfección. Después de la transfección con el inhibidor de miR-146a, ΔΔCq fue 1.82 (71.68% miR-146a knock-down) para H358, 1,09 (53,02% knock-down) para H1650, 2.4 (81.05% knock-down) para H1975, 1.92 (73.57 % miR-146a knock-down) para HCC827, y 1,89 (73,02% knock-down) para H292 10 días después de la transfección. Después de la transfección de la mímica de miR-146a durante 10 días, los niveles de miR-146a se incrementaron fuertemente, con ΔΔCq -14,69 (26431.0372 pliegues) para H358, -10.97 (2005,8528) para los pliegues H1650, -12.78 (7032,3681) para los pliegues H1975, -13.25 (9741.9847 pliegues) para HCC827 y -13,81 (14362.3081 pliegues) para H292. Los controles negativos no tuvieron cambios del nivel de miR-146a (datos no mostrados). Con el inhibidor de miR-146a, la proliferación celular fue ligeramente mayor en todas las líneas celulares ensayadas, pero sin diferencia significativa en comparación con los controles simulados. Después de la transfección con el sinóptico miR-146a, una reducción significativa en la proliferación se observó en el 10
TH días en todas las cinco líneas de células, aunque menos de lo que se observa con siRNA dirigidos a EGFR (Figura 1, Figura 2). Para verificar estos resultados, el efecto sobre la viabilidad se evaluó usando un ensayo fluorimétrico resorufina viabilidad (CellTiter Azul, Promega, datos no mostrados), y por recuento microscópico de las células viables (Hoechst 33342 positivo /negativo PI) (Figura 3, Figura 4) . En ambos ensayos los resultados reflejan en gran medida los resultados del ensayo de tetrazolio MTS. Para verificar si miR-146a es capaz de inducir la apoptosis, el ensayo CellTiter Blue fue multiplexada con un fluorescente caspasa 3/7 de ensayo (Apo One, Promega). Los resultados muestran que el inhibidor de miR-146a no aumentó la actividad de caspasa-3/7. Sin embargo, el imitador de miR-146a mejorado significativamente /7 actividad en las cinco líneas celulares de cáncer probadas 3 caspasa, pero el efecto fue mucho menos de lo que se ve con siRNA dirigidos a EGFR (Figura 5, Figura 6). El efecto sobre la apoptosis se confirmó microscópicamente por Hoechst 33342 y PI doble tinción fluorescente (Figura 3, Figura 7).
células de NSCLC (H358, H1650 y H1975) se incubaron en presencia del inhibidor de miR-146a, mímica , EGFR siRNA y diferentes controles, de 0, 5 y 10 días. El crecimiento celular se midió usando el ensayo colorimétrico de tetrazolio (MTS) (CellTiter96 acuosa Una solución Ensayo de proliferación celular). Control negativo 1 es un inhibidor miARN control negativo y el control negativo 2 es miARN imitan control negativo. *
P
. & Lt; 0,05, en comparación con el ensayo en blanco, en el mismo punto de tiempo
células de NSCLC fueron tratados como se indica en la figura 1. *
P & lt
;. 0,05 comparado con el control en blanco en el mismo punto de tiempo
células de NSCLC se trataron como se ha mencionado en la figura 1, y el efecto sobre la apoptosis se evaluó y se comparó con el control simulado en 0, 5 y 10 días después de la transfección con Hoechst 33342 y PI doble tinción fluorescente.
El efecto de miR-146a sobre el crecimiento celular (H358, H1650 y H1975) se ensayó con Hoechst 33342 y PI doble tinción fluorescente. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 en comparación con el ensayo en blanco, en el mismo punto de tiempo
células de NSCLC fueron tratados como se menciona en la Figura 1, y la actividad de la caspasa-3/7 se examinó y se compararon con los controles simulados. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 en comparación con el ensayo en blanco, en el mismo punto de tiempo
células de NSCLC (HCC827 y H292) fueron tratados como se mencionó anteriormente. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P
. & Lt; 0,01 en comparación con el ensayo en blanco, en el mismo punto de tiempo
El efecto de miR-146a en apoptosis en H358, H1650 y H1975 se examinó con Hoechst 33342 y PI de doble tinción fluorescente. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con el ensayo en blanco, en el mismo punto de tiempo
miR-146a suprime la motilidad. células de NSCLC
a continuación, se evaluó el efecto de la función de miR-146a sobre la motilidad de tres líneas celulares de NSCLC H358, H1650 y H1975. En los controles simulados, las células no transfectadas H358 necesitan más tiempo para sanar (& gt; 108 horas). Por el contrario, las células H1975 sanados el más rápido (& lt; 72 horas). El inhibidor de miR-146a causado una tasa de curación de la herida acelerado marcado en células H358, y tuvo poco efecto en las células H1650 y H1975. El imitador de miR-146a condujo a una tasa de curación de heridas moderadamente disminución de las células H358 y H1650, respectivamente. Sin embargo, el imitador de miR-146a no tenía ninguna influencia sobre la motilidad celular en las células H1975. El siRNA dirigidos EGFR inhibe la tasa de cicatrización de heridas en todas las líneas celulares de la prueba, con un efecto mucho más fuerte que el imitador de miR-146a (Figura 8, Figura 9).
células de NSCLC se incubaron en presencia de inhibidor de miR-146a, miR-146a mímica, EGFR siRNA y diferentes controles de 0, 36, 72 y 108 horas después de la transfección. Motilidad se detectó usando el ensayo de curación de heridas. Las imágenes de un campo de un representante pozo de diez campos de visión en un pozo se muestran (× 100). M: Control de simulacro; C: Control negativo del miARN mímica; INHI: inhibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si: siRNA-EGFR específico. La tasa de curación de heridas se expresa en relación al control simulado.
células de NSCLC se trataron como en los experimentos representados en la Figura 8. La tasa de curación de heridas se expresa en relación al control simulado. La relación media se calculó a partir de diez campos y los experimentos se repitieron en tres pocillos independientes. *
P Hotel & lt; 0,05, **
P Hotel & lt; 0,01 en comparación con el ensayo en blanco, en el mismo punto de tiempo
miR-146a provoca la inhibición del EGFR. y señalización NF-kB en las células NSCLC
para investigar el papel de miR-146a en la regulación de la señalización celular, las células transfectadas con CPNM con inhibidor de miR-146a y la mímica, y se cultivaron las células durante un período de hasta a 10 días. Se encontró que el aumento de la expresión de miR-146a en las células de NSCLC como resultado la baja regulación de EGFR tanto en el ARNm (datos no mostrados) y los niveles de proteína (Figura 10). Importante, hemos encontrado que el EGFR fosforilado también se downregulated después de miR-146a transfección imitan similar a siRNA-EGFR específico en diferentes líneas celulares (Figura 10). Al mismo tiempo, la señalización aguas abajo (AKT, ERK y STAT) fue también el regulado por la mímica de miR-146a, con un efecto más débil en comparación con siRNA-EGFR específica. Para confirmar los efectos de miR-146a en EGFR, transfectadas las células de NSCLC con el inhibidor de miR-146a y encontramos que la inhibición de miR-146a aumentó los niveles de p-EGFR, EGFR y señalización corriente abajo (Figura 10). Estos resultados apoyan los efectos inhibidores de miR-146a en la autofosforilación de EGFR y la señalización aguas abajo. Debido a que el miR-146a se informó de regular también la expresión de IRAK-1, que puede activar NF-kB de señalización [13], [34], [35], se investigaron los efectos de miR-146a en la NF-kappa B vías de señalización las líneas celulares de cáncer. mímica miR-146a reduce la fosforilación del inhibidor de NF-kB I? B, pero no el total de I? B. Por otra parte, el nivel de fosfo-NF-kappa B, el total de NF-kB y el total de IRAK-1 también se redujeron después de miR-146a transfección mímica (Figura 11, Figura 12), lo que indica que el miR-146a regula NF-kB y la IRAK-1 señalización.
líneas celulares de cáncer fueron transfectadas con inhibidor de miR-146a, 146a imitan miR-, siRNA-EGFR específico y diferentes controles negativos y western blot se ensayó 10 días después de la transfección. Los anticuerpos incluyen fosfo-EGFR (p-EGFR), EGFR, p-ERK1 /2, p-AKT, p-STAT3, p-STAT5 y β-actina. M: Control de simulacro; C1: Control negativo del inhibidor de miARN; C2: Control negativo del miARN mímica; INHI: inhibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si:. SiRNA-EGFR específica
líneas celulares de cáncer fueron tratados como en la Figura 4. Los anticuerpos incluyen fosfo-I? B? (P-I? B?), I? B, p-NF-B, NF-kB y β -actina. M: Control de simulacro; C1: Control negativo del inhibidor de miARN; C2: Control negativo del miARN mímica; INHI: inhibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si:.-EGFR siRNA
líneas celulares de cáncer fueron tratados como en la Figura 4. Los anticuerpos incluidos fosfo-IRAK-1 (S
376), IRAK-1 y β-actina. C1: Control negativo del inhibidor de miARN; C2: Control negativo del miARN mímica; INHI: inhibidor de miR-146a; Mimi: miR-146a mímica; Si:. SiRNA-EGFR específica
imitan miR-146a realza el efecto inhibidor de la proliferación de células de ITC y cetuximab
En trabajos anteriores hemos examinado los efectos de peinar EGFR siRNA con EGFR ITC o cetuximab. Entre todos los agentes ensayados, afatinib, un inhibidor de la familia ErbB, tenía el efecto inhibidor del crecimiento más fuerte [25]. Hemos tratado de investigar cómo podría comparar con el efecto de la combinación de la mímica de miR-146a y el ITC (gefitinib, erlotinib, afatinib) o cetuximab, usando el ensayo de proliferación de formazano MTS colorimétricos. La inhibición de la proliferación celular fue mucho mayor cuando imitan el miR-146a se combinó con afatinib, en comparación con un solo fármaco o de un solo imitan miR-146a en todas las líneas celulares ensayadas, especialmente a concentraciones más bajas, sub-molares de afatinib. Sin embargo, no toda la curva de crecimiento de células de la proliferación fue superior a la curva de la dicha independencia, lo que indica el efecto de la combinación fue aditivo (Figura 13). Los efectos de la combinación de miR-146a imitan con otros TKIs o cetuximab fueron similares pero más débil que la de afatinib (datos no mostrados). De este modo imitan el miR-146a aumenta el efecto inhibidor de la proliferación celular ITC y cetuximab. Para verificar el aditivo o sinérgico de combinar la naturaleza con ITC /cetuximab con la mímica de miR-146a, un IC se calculó [31], [32]. Esto demuestra claramente que el efecto es aditivo (datos no mostrados).
MTS se llevó a cabo como anteriormente y se calculó la tasa de inhibición de la proliferación. *
P Hotel & lt; 0,05, en comparación con los agentes por separado. criterio de independencia de Bliss se realizó para calcular el efecto aditivo teórico. - - - - -, Dicha curva de independencia, que indica la situación teórica en la que el efecto combinado de imitador miR-146a y otro agente es exactamente aditivo. • +, drogas miR-146a imitan. ▾drugs + sinóptico Control negativo. ▪ fármacos solos. ◊miR-146a imitan solo (60 nM). Los puntos de datos representan los valores medios de los pocillos por triplicado, y las barras de error son SD
La exploración inicial de la importancia clínica de la expresión de miR-146a en los casos de NSCLC
A continuación examinó el miR-146a FFPE expresión en las biopsias de 101 casos de NSCLC. Las biopsias se obtuvieron antes de cualquier tratamiento sistémico. En la serie, 76 casos estaban disponibles con los correspondientes tejidos pulmonares normales adyacentes. La expresión de miR-146a con relación era global significativamente menor en los tejidos de NSCLC que en los tejidos pulmonares normales (5.20 vs 14.01,
P Hotel & lt; 0,001) (Figura 14). En la serie de 76 pacientes con una muestra emparejada, también había una expresión de miR-146a significativamente menor en los tejidos de cáncer en comparación con pulmonar normal (5,91 vs 14,01,
P = 0,005
, Figura 14). los niveles de miR-146a fueron significativamente mayores (
P
= 0,001) en los casos con unos estadios TNM clínicos I y II comparado con los estadios III y IV (Tabla 1, Figura 15A). Por otra parte, la expresión de miR-146a fue significativamente mayor (
P
= 0,001) en los casos sin metástasis a distancia que aquellos con metástasis (Tabla 1, Figura 15B). Por otra parte, los 32 pacientes con una mayor expresión de miR-146a (más alto que el nivel medio) tuvieron una supervivencia libre de progresión más tiempo que los pacientes con una baja expresión. tiempo de supervivencia global de los pacientes con alta expresión de miR-146a era más larga que la de los pacientes con baja expresión (25,6 semanas en los pacientes de alto miR-146a frente a 4,8 semanas en pacientes de bajo miR-146a,
P = 0,038
, Figura 15C). La expresión de miR-146a no estaba relacionada con otros parámetros clínico-patológicos, como el género, la edad, la expresión de la proteína EGFR, la amplificación del gen EGFR o estado de mutación de EGFR (Tabla 1).
niveles de miR-146a (normalizados a RNU6B) visitada por RT-qPCR en 101 casos de cáncer de los tejidos de NSCLC y 76 casos de los tejidos del pulmón no cancerosas (panel a). la expresión de miR-146a se comparó en los pares de 7 casos. *
P
. & Lt; 0,05
niveles de miR-146a que se accede por RT-qPCR en estadios I y II vs estadios III y IV (Grupo A), sin metástasis a distancia y con metástasis (Panel B). Kaplan-Meier de supervivencia global en función del nivel de miR-146a en el Panel C
Discusión
En el presente trabajo hemos explorado el papel de miR-146a en NSCLC humanos. En primer lugar se identificaron de forma independiente miRNA-146a como el más fuerte correlacionada miARN con el estado de activación de EGFR y la inhibición del EGFR farmacológica en una pantalla que involucró a una serie de 425 miRNAs en una serie de líneas celulares NSCLC y transfectantes BA /F3 con varios estados genómico EGFR (datos no publicados en archivo). Esto llevó a la actual investigación para confirmar estos hallazgos y seguir explorando el papel de este miARN en el CPNM. Funcionalmente, miR-146a suprime el crecimiento celular, la migración celular inhibida, la apoptosis celular inducida y la señalización aguas abajo inhibido EGFR en líneas celulares de NSCLC. Además, miR-146a aumentó la inhibición de la proliferación celular causada por fármacos dirigidos a EGFR, incluyendo TKIs (gefitinib, erlotinib, y afatinib) y un anticuerpo monoclonal (cetuximab). También se encontró en las muestras clínicas FFPE que la baja expresión de miR-146a se correlacionó con estadios TNM clínico avanzado y metástasis a distancia en el CPNM.