Extracto
(miARN) ha sido implicado en la patogénesis del cáncer. Estudios recientes han demostrado que el clúster miR-17-92 se sobreexpresa en muchos tipos de cáncer. La función oncogénica de miRNAs maduro codificado por el cúmulo de miR-17-92 se ha identificado desde el brazo 5 'de seis precursores. Sin embargo, se desconoce la función de los miRNAs producidos a partir de brazo 3 'de estos precursores. El presente estudio demuestra que el miR-17 * es capaz de suprimir las enzimas mitocondriales primarios críticos antioxidantes, tales como superóxido de manganeso dismutasa (MnSOD), glutatión peroxidasa 2 (GPX2) y tiorredoxina reductasa-2 (TrxR2). La transfección de miR-17 * en células de cáncer de próstata PC-3 reduce significativamente los niveles de las tres proteínas antioxidantes y la actividad del informador de la luciferasa bajo el control de miR-17 * secuencias localizadas en las regiones 3 'no traducidas de los tres genes diana de unión . El disulfiram (DSF), un fármaco dithiolcarbomate demostrado tener un efecto contra el cáncer, induce el nivel de madurez de miR-17 * y la muerte celular en células de CaP, que puede ser atenuada por la transfección de antisentido de miR-17 *. El aumento de miR-17 * en las células PC-3 por un sistema de expresión condicional basada en el Tet suprime notablemente su tumorigencity. Estos resultados sugieren que el miR-17 * puede suprimir la tumorigenicidad de cáncer de próstata a través de la inhibición de las enzimas antioxidantes mitocondriales
Visto:. Xu Y, Fang F, Zhang J, Josson S, St. Clair WH, St. Clair DK (2010) miR-17 * Suprime tumorigenicidad de cáncer de próstata mediante la inhibición de enzimas mitocondriales antioxidantes. PLoS ONE 5 (12): e14356. doi: 10.1371 /journal.pone.0014356
Editor: Andrei L. Gartel, Universidad de Illinois en Chicago, Estados Unidos de América
Recibido: 24 Julio, 2010; Aceptado: 20 Octubre 2010; Publicado: December 22, 2010
Derechos de Autor © 2010 Xu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud de subvención CA115801 a William H. St. Clair y conceder CA 049.797 a daret K. St. Clair. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
micro ARN (miARN), moléculas de ARN $ ~ $ 22 nucleótidos que generalmente reprimen la traducción de ARN mensajero diana, está implicada en varios aspectos de la physiogenesis y la patogénesis [1] - [2]. El cúmulo de miR-17-92 codifica seis miRNAs, incluyendo el miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, 19b-MIR-1 y miR-92, que se amplifica en más tipos de tejidos de cáncer que en las correspondientes tejidos normales [3] - [5]. Proto-oncogén c-MYC-regula la transcripción de la agrupación de miR-17-92 y da como resultado la baja regulación de E2F1 por miR-17 [6], de PTEN por miR-19 [7], y de Rb1 por miR 20a [8], lo que sugiere que el miR-17-92 funciona como un factor oncogénico. Hasta la fecha, la mayoría de miRNAs identificados por tener la capacidad de alterar el fenotipo y el desarrollo de cáncer se genera a partir de brazo 5 'de los genes miARN precursores. Sin embargo, la producción y la función de la 3 'brazo miARN (miARN *) siendo difícil de alcanzar.
La desregulación del estado redox está involucrado en una variedad de pathogeneses incluyendo el cáncer. Especies reactivas de oxígeno (ROS) generadas a partir del metabolismo de oxígeno se desintoxica por múltiples vías antioxidantes [9]. enzimas antioxidantes mitocondriales, incluyendo la superóxido dismutasa de manganeso (MnSOD), la glutatión peroxidasa dependiente (GPX) y thioredoxin- peroxidasa dependiente (TrxR2), comprenden un sistema de defensa primario en las mitocondrias y son esenciales para la desintoxicación contra ROS [10] - [12]. A consecuencia del alto el metabolismo de las células cancerígenas de rápido crecimiento es la rápida generación de ROS celular. Por lo tanto, las células de cáncer requieren un sistema de defensa antioxidante de alta para hacer frente a los altos niveles de producción de ROS [13], [14]. Por lo tanto, la inhibición selectiva de los sistemas antioxidantes es una opción para la intervención del cáncer.
El cáncer de próstata (CaP) es una enfermedad común en los hombres de América del Norte. Debido CaP desarrolla un fenotipo resistente a la castración, los niveles de proteínas antioxidantes se incrementan y se correlacionan para adquirir capacidades, como el crecimiento autosuficiente, la reducción de la apoptosis, angiogénesis sostenida, invasión mejorada y la metástasis, así como la resistencia de células cancerosas al tratamiento [15 ] - [17]. En este estudio, utilizamos cuatro enfoques complementarios para identificar los mediadores para el tumor efecto de miR-17 * supresión. Los resultados demuestran que la supresión de enzimas antioxidantes mitocondrial es un mecanismo para la función supresora de tumores de miR-17 *. Este es el primer informe que revela la relación entre el estrés oxidativo y la función supresora de tumores de miARN producido a partir de brazo 3 'de la agrupación de miR-17-92.
Resultados
miR-17 * reprime tres proteínas antioxidantes mitocondriales
Una serie de estudios han reportado que el miR-17 es altamente expresado en los tumores malignos incluyendo CaP, pero el nivel de su socio, el miR-17 *, es normalmente baja en los cánceres [18 ]. Esta evidencia predice que los niveles de miR-17 y miR-17 * están regulados diferencialmente y que la relación de los dos miRNAs pueden ser importantes para la regulación de diferentes conjuntos de genes diana durante la tumorigénesis. Las expresiones de ambos miRNAs en diferentes células de la próstata, incluyendo normal del epitelio, estroma, células de CaP, sensibles a andrógenos y andrógeno-independiente transformadas virales, se han cuantificado en tiempo real RT-PCR. El nivel de miR-17 y la relación de miR-17 y miR-17 * en células de CaP fueron más altos que los niveles en las células no cancerosas (Fig. 1A). Mediante la búsqueda en miRBase, se encontró que MnSOD, Gpx2 y TrxR2, tres importantes proteínas antioxidantes mitocondriales que son esenciales para la desintoxicación de O
2
.- y H
2O
2, son objetivos potenciales de MIR -17 *. Para verificar que el miR-17 * es capaz de reprimir proteínas antioxidantes, maduro miR-17 * se transfectó en células PC-3, que tienen un bajo nivel de endógena de miR-17 *. La expresión de las tres proteínas antioxidantes se redujo por el miR-17 transfectadas * de una manera dependiente de la dosis. Considerando que la transfección de los genes miARN de control y antisentido miR-17 * no tuvo efecto sobre los objetivos (Fig. 1B), los estímulos de estrés oxidativo, tales como las citoquinas son capaces de inducir la expresión de la
SOD2
génica a través de la activación del NF -κB vía [19] señalización. La transfección de miR-17 * reprimida significativamente TNFa inducida por
SOD2
expresión de una manera dependiente de la dosis (Fig. 1C). Para confirmar que la reducción de las proteínas antioxidantes por miR-17 * está mediada por la represión de traducción, los extremos 3 'regiones no traducidas, incluyendo el putativo miR-17 * focalización sitios de los genes que codifican para las tres enzimas antioxidantes, se clonaron aguas abajo de la gen informador. Un vehículo y un sitio de segmentación de miR-377 situada en la región 3 'no traducida del gen
SOD1
se incluyeron como control del vehículo y el control negativo no propio. Como se muestra en la Fig. 1D, el clonaron secuencias de direccionamiento de miR-17 * son necesarios para la represión de las respuestas reportero transfectadas por el miR-17 *.
A, los niveles de miR-17 y miR-17 * expresadas en el CaP y de células de control líneas se midieron por RT-PCR. se presenta la relación de miR-17 y miR-17 * en cada línea celular. B y C, la transfección de miR-17 * en las células PC-3 para validar su función en la represión de la expresión de proteínas antioxidantes y disminuyendo la inducción MnSOD mediada por TNF. D, el efecto represivo de miR-17 * de las proteínas antioxidantes se estima mediante el ensayo indicador de luciferasa cuantitativa. RNU24 y β-actina se utilizaron como controles internos para normalizar los niveles de miARN (A), los niveles de proteína (B y C). Imágenes se normalizaron con los controles internos y luego normalizado por PrEC (A), por el control de los genes miARN (B), y por la ausencia de tratamiento TNF (C). β-gal actividad se utilizó para normalizar las actividades luciferase reportero (D). Tres muestras (n = 3) fueron utilizados en los experimentos y se pliegan los cambios en las transferencias Western se indican. * (P & lt; 0,05) y ** (p & lt; 0,01) indican significados en comparación con los controles: PrEC (A), el control de los genes miARN (B) y (D), y las muestras sin tratar (C)
.
DSF induce miR-17 * expresión
DSF es un fármaco dithiolcarbomate que se ha demostrado que suprimir fenotipos cancerosas mediante la inducción de la ruta apoptótica [20]. Se encontró que el DSF inhibe las tres proteínas antioxidantes en células de CaP. Después de las células PC-3 y DU-145 se trataron con DSF durante 24 h, la reducción de los niveles de las proteínas antioxidantes correspondió significativamente con las concentraciones de DSF (Fig. 2A). Sin embargo, los niveles de mRNA de los genes antioxidantes no cambiaron en células DSF-tratada (Fig. 2B). Curiosamente, RT-PCR y Northern blots muestran que DSF induce miR-17 *, pero no tiene efecto sobre los niveles de expresión de miR-17 (Fig. 2C). La inducción de miR-17 * por DSF se ve confirmado por las respuestas reportero que están regulados por miR-17 * direccionamiento de secuencias (Fig. 2D). Por otra parte, para verificar que el efecto negativo de la DSF en la expresión de proteínas antioxidantes está mediada por la inducción de miR-17 *, las células PC-3 fueron transfectadas con antisentido hsa-miR-17 * seguido de un tratamiento DSF. Los resultados indican que el antisentido hsa-miR-17 * es capaz de reducir el efecto DSF (Fig. 2E). Estos resultados sugieren que la reducción de las proteínas antioxidantes por DSF se produce, al menos en parte, a través de miR-17 * mediada por la represión de traducción.
A, células de CaP se trataron con DSF a las concentraciones indicadas. Los niveles de las tres proteínas antioxidantes se midieron mediante transferencias Western. B, los niveles de mRNA de los tres genes antioxidantes se cuantificaron por RT-PCR. C, los niveles de miR-17 y miR-17 * en las células tratadas con DSF se cuantificaron por RT-PCR. Los niveles de miR-17 * fueron confirmados por transferencias Northern. Se determinó D, el efecto del DSF inducida por el miR-17 * en las respuestas reportero. E, después transfectadas anti-miR-17 *, PC-3 células fueron tratadas con DSF. El efecto de anti-miR-17 * en la restauración de proteínas antioxidantes se cuantificó mediante transferencias Western. β-actina se utilizó para normalizar los niveles de proteínas (A), (E), y los niveles de mRNA (B). Los cambios veces se indican. RNU24 se utilizó para normalizar los niveles de miR-17 y miR-17 * (C). β-gal actividad se utilizó para normalizar las actividades luciferase reportero (D). Tres muestras (n = 3) fueron utilizados en los experimentos (con la excepción de transferencia de Northern). * (P & lt; 0,05) y ** (p & lt; 0,01) indican significados en comparación con ningún tratamiento DSF (A), (C), (D), y en comparación con no DSF y no hay muestras miRNA transfectadas (E)
miR-17 * induce la muerte celular en células de CaP
para determinar la toxicidad DSF a células de CaP, PC-3 y DU-145 células fueron tratadas con DSF y se cultivan hasta que las colonias formadas. Debido a que la densidad celular utilizado para el análisis de la formación de colonias era 100 veces menor que la densidad se muestra en la Fig. 2, el intervalo de concentración de DSF se redujo 100 veces en experimentos de formación de colonias. Los resultados de la fracción de supervivencia indican que las células de CaP son extremadamente sensibles a DSF. Más de 95% de las células murieron por tratamiento con 1 DSF mu M (Fig. 3A). Para verificar si el miR-17 * contribuye a la muerte celular mediada por DSF, las células PC-3 fueron transfectadas con * antes del tratamiento-miR-17 contra DSF miR-17 * y. el análisis de supervivencia de colonias muestra que miR-17 * aumenta la toxicidad de DSF, mientras que anti-miR-17 * es capaz de rescatar células del efecto DSF (Fig. 3B). A fin de verificar que la reducción de proteínas antioxidantes es una causa principal de la toxicidad de miR-17 *, las células PC-3 fueron co-transfectadas con miR-17 * y ADNc ectópica expresando las tres proteínas antioxidantes que no son susceptibles de miR 17 * Reglamento. análisis de citotoxicidad por el ensayo de exclusión de azul de tripano muestra que la expresión de los tres genes antioxidantes rescata la supervivencia celular de la toxicidad de miR-17 * (Fig. 3C). Los correspondientes niveles de las proteínas antioxidantes en las células PC-3 transfectadas fueron verificadas por transferencias de Western (Fig. 3D).
A, las células de CaP se trataron con DSF a las concentraciones indicadas para el análisis de supervivencia de la colonia. Las colonias formadas se contaron y se representan gráficamente en una escala logarítmica. B, las células PC-3 fueron transfectadas con miR-17 y * de control miRNAs antes del tratamiento de DSF. Se determinaron los efectos de miR-17 * y antisentido de miR-17 * de supervivencia de la colonia. C y D, el miR-17 * fue co-transfectadas con construcciones para la expresión de las tres proteínas antioxidantes. Las proteínas antioxidantes sobreexpresados fueron confirmados por Western blots con normalización β-actina y se indican plegables cambios (D). Los efectos protectores de las enzimas antioxidantes en las células transfectadas contra miR-17 * toxicidad se determinaron mediante un ensayo de exclusión de azul de tripano (C). Tres muestras (n = 3) fueron utilizados en los experimentos. * (P & lt; 0,05) y ** (p & lt; 0,01) indican significados en comparación con muestras de control miARN (B) y en comparación con muestras de control de vehículo (C), (D)
miR. 17 * suprime la tumorigenicidad de CaP
Para determinar el efecto de miR-17 * sobre el crecimiento tumoral, la secuencia de madura miR-17 * se clonó en un vector de expresión lentiviral basado en el Tet. El lentivirus que expresan el miR-17 * fue transducido en células PC-3, y se identificó una línea celular estable con la expresión de RFP basado Tet-a. El efecto de miR-17 * de las tres proteínas antioxidantes en virtud de las condiciones Tet-inducible se confirmó mediante transferencias Western (Fig. 4A). Un modelo de tumor de xenoinjerto en ratones se utilizó para evaluar el efecto de miR-17 * en el crecimiento del tumor. Cuando el clon se inyecta por vía subcutánea en ratones machos desnudos, la expresión de miR-17 *
in vivo
fue inducida mediante la administración de Dox agua que contiene. Un vehículo de control se incluyó para controlar el efecto tóxico de Dox. Como se muestra en la Fig. 4B, el tiempo medio para que los tumores llegar a 500 mm
3 en el control del vehículo y miR-17 * sin grupos de control Dox es de 12 a 13 días (control del vehículo sin Dox, 12,2 ± 2,1; control del vehículo con Dox, 12,3 ± 2,8; y miR-17 * sin Dox, 12,6 ± 2,8). Cabe destacar que el número de días para el miR-17 * Dox con el grupo para llegar a 500 mm
3 tamaño del tumor es de 24 ± 4,9, que es dos veces más que los grupos de control. Para medir continuamente el crecimiento del tumor, los ratones en los grupos de control se mantuvieron durante 18 días después de la inyección, cuando el tamaño del tumor alcanza el tamaño máximo permisible de 2.000 mm
3. Las tasas de crecimiento del tumor se muestran en la Fig. 4C indican que el crecimiento del tumor en el miR-17 * con el grupo Dox se retrasó significativamente en comparación con el crecimiento del tumor en los grupos de control. Para verificar si la expresión de miR-17 * resultados en la reducción de las proteínas antioxidantes en el miR-17 * tejidos tumorales expresados, se cuantificaron los niveles de actividad de las enzimas antioxidantes en los tejidos tumorales de miR-17 * y. En correspondencia con el aumento de los niveles de miR-17 * en el grupo tratado-Dox, las actividades de las tres enzimas antioxidantes se redujeron significativamente en comparación con el grupo no tratado (Fig. 4D). Tomados en conjunto, estos resultados demuestran que la expresión de miR-17 * en células PC-3 reduce la tumorigenicidad, al menos en parte, mediante la inhibición de la función antioxidante mitocondrial. Este resultado sugiere que, en contraste con el efecto oncogénico de miR-17, miR-17 * juega un papel supresor tumoral en células de CaP.
A, ha-miR-17 fue clonado * en un Tet-en lentiviral vector de forma estable y secciona en células PC-3. El clon se puso a prueba mediante cribado RFP bajo Dox- condiciones inductivas y luego confirmó mediante la medición de la expresión de los tres genes diana utilizando transferencias Western con la normalización β-actina. B y C, el clon generado se inyectó en ratones desnudos macho para determinar su tumorigenicidad. Se incluyó la control del vehículo. El número de días necesarios para el tamaño del tumor para llegar a 500 mm
3 se muestra en (B) y las tasas de crecimiento de tumor calculados en (C). D, el ARN total y las proteínas fueron aisladas de los tejidos tumorales y el nivel de miR-17 * y las actividades correspondientes de las tres proteínas antioxidantes se cuantificaron. Tres muestras (n = 3) fueron utilizados en las pruebas del generada miR-17 * clon inducible (A). Nueve animales de control del vehículo (n = 9) con o sin tratamiento DOX y dieciocho años de miR-17 * expresaron los animales (n = 18) con o sin tratamiento DOX se utilizaron para probar el efecto de miR-17 * sobre el crecimiento tumoral (B), (DISCOS COMPACTOS). * (P & lt; 0,05) y ** (p & lt; 0,01) indican significados en comparación con el control sin DOX (A) y (C) guía empresas
Discusión
miARN generalmente funciona como. un represor posttranscriptional, que se cree que es un importante mecanismo de regulación de genes. miARN la biogénesis incluye la transcripción de los genes miARN primaria canónica, Drosha hendiduras /Dicer-mediada, y Strand selección preferencial a través Argonauta (hace) las proteínas [21]. Cuando se selecciona una de las cadenas para la represión de los objetivos, su hebra pareja se presume que se degrade [22]. Sin embargo, estudios recientes han detectado tanto miR-17 y miR-17 * en muchos tipos de tejidos humanos [23]. En todas las líneas celulares ensayadas, nuestros resultados demuestran que el miR-17 * está presente a un nivel más bajo que el miR-17. Sin embargo, los niveles de ambos miRNAs son más altos en células de CaP que en las células de control (datos no mostrados). Dado que el nivel de miR-17 es mayor que el miR-17 *, la relación de miR-17 y miR-17 * en células de CaP se incrementa, lo que sugiere que el miR-17 es una hebra preferentemente seleccionado, aunque tanto el miR-17 y miR -17 * precursores se transcriben. Estudios recientes han demostrado que media la producción AGO1 miARN en Drosophila, mientras que AGO2 se asocia con miARN * de producción [24]. Sin embargo, el mecanismo exacto por el cual AGO regula la biogénesis miARN necesita ser determinado para descubrir la acumulación preferencial de hebras miARN en diferentes condiciones.
Nuestros datos demuestran que el miR-17 * suprime la tumorigenicidad de células de CaP, lo que sugiere que la función de miR-17 * es opuesta a la función oncogénica de miR-17. Expresión de la agrupación miR-17-92 está estrechamente regulada en respuesta a los ambientes intercelulares y extracelulares. La transcripción de este grupo es hasta reguladas por c-Myc en condiciones oxidantes, [25] y el regulado por p53 en condiciones de hipoxia [26]. Curiosamente, DSF, un dithiolcarbomate, induce sólo el nivel de miR-17 * y no miR-17. Esta inducción selectiva es consistente con el efecto supresor del tumor de miR-17 * y está de acuerdo con la anterior conclusión de que DSF induce la apoptosis en las células del cáncer [20]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que DSF puede ser eficaz como un agente contra el cáncer, en parte por inducción de miR-17 *.
represión de genes basados en miARN se considera que es un destino de la célula regulador fundamental de control. Sin embargo, es un sistema de regulación complicada porque un gen puede ser regulado por múltiples miRNAs y uno miRNA tiene muchos objetivos diferentes. En general, el efecto de los genes miARN en la regulación de genes es dependiente de los tipos específicos de tejidos, estados de desarrollo o estímulos. Por lo tanto, la identificación de los genes miARN objetivos es fundamental para definir las funciones reales de miARN en condiciones fisiológicas o patológicas. Nuestro estudio demuestra que el miR-17 * es un regulador negativo de tres importantes enzimas antioxidantes localizados en la mitocondria. Estas enzimas antioxidantes son los principales componentes del sistema antioxidante primario y trabajan en concierto para eliminar de forma segura ROS generado en la mitocondria. La inhibición de estas proteínas debería conducir, por lo tanto, a una acumulación de ROS, lo que resulta en la citotoxicidad. Nuestros hallazgos sugieren un nuevo enfoque terapéutico para mejorar la muerte celular por miR-17 * como meta. Además, un estudio reciente demostró que miR-17 es capaz de silenciar la expresión de HIF-1α, un factor de transcripción para el mantenimiento de la homeostasis redox y la supervivencia celular en condiciones de hipoxia [27]. En conjunto, estos resultados predicen que la relación de miR-17 y miR-17 * puede tener un papel importante en la regulación del estado redox celular.
A pesar de que el efecto Warburg, una alta tasa de glucólisis aeróbica en los tumores, se ha observado en varios tipos de cáncer, los cánceres tienen mitocondrias funcionales y la respiración mitocondrial es necesaria para la proliferación de las células del cáncer [28]. Además, las células cancerosas tienen altos niveles de ROS y también expresan altos niveles de proteínas antioxidantes para desintoxicar las elevadas tasas de generación de ROS [29]. Por ejemplo, MnSOD se expresa en un alto nivel en células de CaP agresivos, que es esencial para la protección de células de CaP contra la radiación inducida por ROS [30]. Por lo tanto, la activación de vías de señalización pro-apoptóticos por la orientación mitocondrias enzimas antioxidantes también podría considerarse una estrategia terapéutica contra el cáncer. Nuestros resultados, que demuestran que la inhibición de miR-17 * de proteínas antioxidantes mitocondriales suprime la tumorigenicidad de células de CaP en vivo, proporcionan evidencia experimental para la prueba de concepto de que los miARN * puede funcionar como un supresor de tumores mediante la inhibición de la capacidad de defensa mitocondriales.
Materiales y Métodos
cultivo de células y análisis de toxicidad celular
PrEC, próstata humano las células epiteliales primarias (Cambrex Corp.), y el PRSC, células estromales de próstata humanos (Clonetics), fueron cultivadas en medio PrEBM (Lonza). PZ-HPV-7, HPV-18 transformadas las células epiteliales de la próstata humano (American Type Culture Collection, ATCC), se cultivó en medio de queratinocitos-SFM (Invitrogen). células de carcinoma epitelial Humanos LNCaP, DU-145 y de adenocarcinoma de células PC-3 (ATCC) se cultivaron en medio RPMI (Invitrogen) que contiene 10% de FCS (Hyclone). ensayo de formación de colonias se utilizó para cuantificar la toxicidad de miR-17 * de células de CaP en placas de 6 pocillos a densidades bajas. Para inducir la expresión * miR-17, las células de CaP se trataron con DSF en un intervalo de concentración de 0 a 1 M durante 24 h. Las colonias se lavaron con 1 x PBS y se tiñen con un colorante cristal violeta. La fracción superviviente se calculó como la relación del número de colonias formadas para el número de células de manera eficiente chapados. Se usó un ensayo de exclusión con azul de tripano para determinar los efectos protectores de aumento de las enzimas antioxidantes sobre la toxicidad de miR-17 *. Las células fueron co-transfectadas con miR-17 * y construcciones de expresión de los tres genes antioxidantes. Después del cultivo durante 48 h, las células transfectadas se tiñeron con un colorante azul de tripano al 0,4% y se contaron usando un analizador de la viabilidad celular Vi-Cell (Beckman Coulter).
Micro expresión del ARN de ensayo indicador
para probar si el miR-17 * regula la expresión de los genes diana, las regiones 3 'no traducidas de los genes diana que contienen los sitios de unión putativa * miR-17 se clonaron entre los
Sac
y
Hind
III sitios del vector PMIR-reportero (Ambion). Las construcciones de reportero de expresión de miRNA generados fueron co-transfectadas con el vector de control interno β-gal (Ambion) en células PC-3 usando lipofectamina (Invitrogen). Después de cultivo durante 36 h, se recogieron las células; la actividad de luciferasa se midió usando un kit de ensayo de luciferasa (Promega); y la actividad β-gal se midió usando clorofenol rojo-a-D-glactopyranoside sustrato monosódico (Roche Molecular bioquímicos). las respuestas relativas de luciferasa fueron estimados por la actividad de la luciferasa β-gal-normalizada.
La expresión de miR-17 *
Para aumentar el nivel de miR-17 * en células de CaP, miR-17 * moléculas y los controles (Ambion) se transfectaron en las células utilizando oligofectamine (Invitrogen). Para inducir miR-17 * expresión en células de CaP, las células fueron tratadas con disulfiram (Sigma) a una concentración de 0 a 100 mM durante 24 h. Para expresar de forma estable el miR-17 * en células de CaP, un miR-17 * secuencia madura atravesado por Drosha y Dicer sitios de escisión se clonó en un Tet-El vector lentiviral inducible, TRIPZ (Open Biosystems), utilizando XhoI y sitios EcoRI. Secuencia de inserto que contiene el miR-17 * (mostrado por un subrayado) es CTCGAGTGCTGTTGACAGTGAGCGAACTGCAGTGAAGGCACTTGTAGTAGTGAAGCCACAGATGTACTACAAGTGCCTTCACTGCAGTCTGCCTACTGCCTCGGAGAATTC. El miR-17 * clonado fue empaquetado usando un sistema de envasado translentiviral (Open Biosystems). El miR-17 * lentivirus se concentró y se tituló con anterioridad a la transducción en las células de menos de 2 mg /ml de puromicina condiciones selectivas. El clon * miR-17 fue seleccionado además por Tet-en la expresión inducible de una proteína de fluorescencia roja etiqueta (RFP) utilizando un medio que contiene 1 mg /ml de doxiciclina (Dox). El clon estable se verificó mediante el cribado de la expresión de los objetivos mediante transferencias Western.
La expresión de enzimas antioxidantes
Para rescatar supervivencia de las células de la toxicidad de miR-17 *, construcciones de ADNc para la expresión de las tres proteínas antioxidantes se transfectaron en células PC-3 tratamiento DSF anterior. Las proteínas antioxidantes ectópica expresó no están afectadas por cuenta-miR-17 *, debido a que las construcciones de ADNc no tienen las regiones 3'-untranslational donde se identifican los sitios de unión para tener-miR-17 * de unión.
animales
Cuatro semanas de edad de sexo masculino NCRNU (nu /nu atímicos) los ratones fueron adquiridos de Taconic (Hudson, Nueva York). 10
6 células mezcladas con Matrigel (BD Biosciences) se inyectaron en el flanco derecho de los ratones. Los ratones inyectados fueron separados en dos grupos: dos días antes de la inyección, un grupo de ratones comenzaron a beber agua que contiene 2 mg /L de doxiciclina y el grupo control continuó bebiendo agua regular. Los volúmenes tumorales se calcularon utilizando una fórmula estándar (A × B
2 × 0,52; A y B representan la longitud del tumor en diagonal)
transferencias de Western
Las proteínas se extrajeron de las células cultivadas. y los tejidos tumorales como se ha descrito previamente (11) y 100 g de proteínas extraídas se sometieron a electroforesis en un 8% (w /v) en gel de SDS-PAGE, se transfirió a una membrana de nitrocelulosa, y posteriormente se incubaron con anticuerpos primarios contra MnSOD (Upstate Biotech). , Gpx2 (Abcam), TrxR2 y β-actina (Santa Cruz Biotech). Las transferencias Western se visualizaron utilizando un sistema de detección de quimioluminiscencia (ECL, Amersham Pharmacia Biotech.).
-PCR en tiempo real (RT-PCR)
Para enriquecer miARN en la preparación de ARN, el ARN total fue aislado de las células cultivadas y los tejidos tumorales usando un kit de aislamiento de mirVana miRNA (Ambion). Para la cuantificación de miR-17 y miR-17 *, el ARN se analizó utilizando un kit de transcripción inversa TaqMan microARN con controles internos RNU6B, RNU24 y RNU48 (Applied Biosystems). Para cuantificar los niveles de mRNA de los genes diana miR-17 *, el ARN se analizó mediante TaqMan transcripción reversa Reactivos (Applied Biosystems) y RT-PCR con el ProbeLibrary Set universal (Roche Applied Science). RT-PCR se realizó en una mezcla maestra TaqMan PCR Universal 480 utilizando un sistema de PCR en tiempo real LightCycler (Roche Applied Science).
transferencias Northern
El nivel de miR-17 * se cuantificó utilizando un kit miRtect TI-miARN etiquetado y detección (USB Corp.) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
la actividad enzimática de ensayo
MnSOD actividades se midieron por el nitroazul de tetrazolio (NBT) -bathocuproin sulfonato método de inhibición de la reducción (BCS). cianuro de sodio (2 mM) se utilizó para inhibir la actividad de Cu /ZnSOD [31]. actividad GPx se midió mediante el uso de una mezcla de reacción que consiste en 0,2 mM H
2O
2, GSH 1,0 mM, 0,14 U de la glutatión reductasa (GR), NADPH 1,5 mM, azida de sodio 1,0 mM, y 0,1 M de tampón de fosfato (pH 7,4) y 1 mg /ml de proteína sobrenadante [32]. TrxR actividad se midió usando tiorredoxina reductasa Actividad Kit de ensayo (Redoxica) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
análisis estadístico de datos
experimentos independientes múltiples se realizaron para cada conjunto de datos. Imágenes en transferencias Northern y Western blots se cuantificaron utilizando el software Carestream Molecular Imaging (Carestream Health Inc.). La significación estadística se analizaron mediante ANOVA de una vía y la prueba de comparación múltiple de Tukey, seguido de análisis de datos GraphPad Prism.