Extracto
El grupo de miR-17-92 de microRNAs es elevada en el cáncer colorrectal, y tiene un papel causal en el desarrollo del cáncer. De los seis miR-17-92 miembros del clúster, miR-19a yb, en particular, son los promotores principales del desarrollo del cáncer y la proliferación celular, mientras que la evidencia preliminar sugiere que el miR-18a puede actuar en oposición a otros miembros del clúster para disminuir la proliferación celular. Se formuló la hipótesis de que el miR-18a puede tener una función homeostática para ayudar a contener el efecto oncogénico de todo el clúster de miR-17-92, y que la elevación de la actividad del clúster de miR-17-92 sin un aumento correspondiente en el miR-18a puede promover colorrectal la progresión del tumor. En las muestras de cáncer colorrectal y correspondiente mucosa colorrectal normal y miR-18a muestra la expresión general más bajo que otros miembros de la agrupación de miR-17-92. miR-18a ha demostrado tener un papel de oposición a otros miembros de la agrupación de miR-17-92, en particular, los miRNAs oncogénicos clave, miR-19a y b. La transfección de HCT116 y líneas celulares de cáncer colorrectal con LIM1215 imita el miR-18a disminución de la proliferación, mientras que un inhibidor de miR-18a aumento de la proliferación. miR-18a también fue responsable de la disminución de la migración celular, la alteración de la morfología celular, la inducción de la detención del ciclo G1 S /célula fase, el aumento de la apoptosis, y la mejora de la acción de un agente pro-apoptótica.
CDC42
, un mediador de la vía PI3K, fue identificado como un objetivo novedoso de miR-18a. La sobreexpresión de miR-18a reducida
CDC42
expresión, y un ensayo de luciferasa confirmó que el miR-18a se dirige directamente a la 3'UTR de
CDC42
. imita el miR-18a tuvieron un efecto similar sobre la proliferación como un inhibidor de molécula pequeña de CDC42. La inhibición de
es probable que sea un mecanismo clave por el que el miR-18a perjudica el crecimiento de células cancerosas, con un experimento protector de objetivo que revela influencias de miR-18a proliferación a través de la inhibición directa de
CDC42
CDC42
expresión. La inhibición de
CCND1 fotos: por miR-18a también puede ayudar en este efecto de supresión del crecimiento. La función homeostática de miR-18a dentro de la agrupación de miR-17-92 en células de cáncer colorrectal puede lograrse a través de la supresión de la
CDC42
y la vía PI3K
Visto:. Humphreys KJ, McKinnon RA , Michael MZ (2014) inhibe el miR-18a
CDC42
y juega un papel supresor tumoral en células de cáncer colorrectal. PLoS ONE 9 (11): e112288. doi: 10.1371 /journal.pone.0112288
Editor: Junming Yue, la Universidad de Tennessee Health Science Center, Estados Unidos de América
Recibido: 29 Junio, 2014; Aceptado: 9 Octubre 2014; Publicado: 7 Noviembre 2014
Derechos de Autor © 2014 Humphreys et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El estudio fue financiado por un centro de Flinders para la Innovación en la Investigación del Cáncer Grant. Este estudio fue realizado con el apoyo financiero y de otra del Proyecto de Cáncer Cáncer de Beat Consejo SA en nombre de sus donantes y el Gobierno del Estado de Australia del Sur a través del Departamento de Salud. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
La alteración de los niveles de expresión de los genes miARN normales se produce con frecuencia en el cáncer colorrectal (CCR) de desarrollo [1]. miRNAs, que son pequeñas secuencias de ARN no codificantes, pueden post-transcripcionalmente regular la expresión de genes diana mediante la unión a ARNm diana complementarias. Son capaces de romper los ARNm complementarios, o cuando existe una complementariedad imperfecta, pueden actuar a través de la inhibición de la traducción y la transcripción de desestabilización [2] - [4]. Mientras que los tumores humanos a menudo se caracterizan por un defecto en la producción general de miARN y miARN baja regulación global de miRNAs específicos [5], [6], numerosos estudios también han demostrado ser elevados en el CCR [1], [7]. Los niveles reducidos de miRNAs supresores de tumor, o sobre-expresión de miRNAs oncogénicos, contribuir a la progresión del tumor mediante la alteración de la expresión génica y que influyen en las vías de señalización [8], [9]. De hecho, algunos miRNAs se han demostrado para ser conductores del proceso oncogénico, y es esencial para la progresión del tumor [10] - [13].
Un ejemplo de un miARN con un papel causal en el desarrollo del cáncer es la MIR -17-92 grupo de miRNAs, que ha sido designado oncomir -1 debido a su potencial oncogénico [14]. El cúmulo de miR-17-92, que comprende el miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, 19b-MIR, y miR-92a, se eleva comúnmente en los linfomas y tumores sólidos, incluyendo tumores de colon [1 ], [14] - [17]. Las funciones de racimo durante tanto el desarrollo normal y la transformación oncogénica de promover la proliferación y la angiogénesis, e inhiben la diferenciación y la apoptosis [11], [12]. miRNAs en el clúster de miR-17-92 también se han asociado con la invasión y la metástasis de las células CRC [18], y con una peor supervivencia [19]. La agrupación se ha demostrado para coordinar múltiples vías oncogénicas, y la inhibición de estas vías tiene potencial terapéutico para el tratamiento de los cánceres causados por el miR-17-92 desregulación [13]
.
De los seis miR-17-92 miembros del clúster , miR-19a y b, en particular, son los promotores principales del desarrollo del cáncer y la proliferación de las células del cáncer [11], [12], [20]. En las células de CRC, hemos demostrado anteriormente que la de los miembros de la agrupación, el miR-19a y b son responsables del aumento de la proliferación [20]. Varios estudios también han demostrado que se requieren miR-19a y b y en gran medida suficiente para promover las propiedades oncogénicas de la agrupación en los modelos de linfoma [11], [12].
In vivo
, miR-19 se requiere para promover lymphomagenesis en un modelo de linfoma de células B de ratón Eμ-myc [11], [12]. miR-19 sobre-expresión altamente malignos llevó a linfomas B de aparición temprana, mientras que la desactivación de miR-19 resultó en la biogénesis de aparición retardada del tumor, penetrancia incompleta, y su vida útil prolongada [12]. Después de miR-17-92 deleción en células de linfoma, la reintroducción de crecimiento por sí solo restaurado miR-19 y suprime la apoptosis [11].
A diferencia de la acción pro-proliferativa de miR-19, la evidencia preliminar sugiere que el miR -18a puede actuar en contra de los otros miembros de clúster para disminuir la proliferación celular [20]. miR-18a puede ser menos elevado que otros miembros de la agrupación de miR-17-92 en los tumores colorrectales [17], y este aumento relativo de otros miembros de la agrupación de miR-17-92 podría favorecer una mayor proliferación. Se sabe que varios mecanismos de regulación post-transcripcional pueden dar lugar a diferentes niveles de los miembros individuales del clúster, con miR-18a el único miembro de la agrupación para requerir hnRNPA1 para el procesamiento [21]. La estructura terciaria de la plegada pri-miR-17-92 transcripción también puede contribuir a la transformación menos eficiente de miR-18a [22], [23]. Tenemos la hipótesis de que el miR-18a puede tener una función homeostática para ayudar a contener el efecto oncogénico de todo el clúster de miR-17-92, y que la actividad del clúster de miR-17-92 elevado sin un aumento correspondiente en el miR-18a puede promover tumor colorrectal progresión. Este estudio tuvo como objetivo determinar las propiedades supresoras de tumores de miR-18a en líneas celulares de CRC.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
células de carcinoma colorrectal HCT116 (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) se mantuvieron en medio de McCoy 5A (modificada) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contenía suero bovino fetal al 10% (Bovogen Productos Biológicos, Essendon, VIC, Australia). células de carcinoma colorrectal LIM1215 (ECACC, Salisbury, Wiltshire, Reino Unido) se mantuvieron en Dulbecco medio de Eagle modificado que contenía suero bovino fetal al 10%. Las células fueron cultivadas a 37 ° C y 5% de CO
2, se mantuvo a & lt; 80% de confluencia, y estaban libres de micoplasma
muestras de tejido colorrectal humano
Muestras de CRC y la correspondiente normal. mucosa colorrectal se obtuvieron del Banco de Tejidos Flinders (n = 30). Estas muestras se recogieron mediante disección roma de las resecciones quirúrgicas recientes, tras la aprobación ética del Comité de Ética del Sur Adelaida clínico humano de investigación y escrito el consentimiento informado de los pacientes. La aprobación específica estudio para examinar los cambios miARN en este tejido colorrectal se obtuvo del Comité Ético de Investigación Clínica del Sur Adelaida humano (número de autorización 204.13).
Las transfecciones
Las líneas celulares fueron transfectadas inversa con imita miARN, inhibidores de miRNA, siRNAs, constructos de plásmidos, y protectores de destino utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante, en 24 y 96 formatos de placas pocillos (100 000 y 20 000 células por pocillo, respectivamente). Para los experimentos imitan, miR-18a, miR-19a y b, y control negativo (NC) miARN dúplex de oligonucleótidos (GenePharma, Shanghai, China) se utilizaron a 20 nM cada uno. miR-18a y NC bloqueados inhibidores de ácido nucleico (LNA) (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) (IDS: 18a: 410101-00, Carolina del Norte: 199004-00) se utilizaron a 50 nM. Prediseñado Misión siRNAs para
CDC42 gratis (ciclo de división celular 42) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) (IDs: SASI_Hs01_00222990, SASI_Hs02_00332553) o un siRNA NC (ID: SIC001) se transfectaron inversa a una concentración total de 20 nM. co-transfección experimentos se realizaron con 200 ng de ADN plásmido (detalles de las construcciones más adelante) con 50 nM de miR-18a o NC miARN imita. Nuevos experimentos de co-transfección se realizaron con 20 nm de miR-18a o NC miARN imita y con miScript protectores de destino (Qiagen, Valencia, CA) diseñados para el miR-18a predijo gen diana
CDC42
, o un control negativo protector de objetivo miScript (ID: MTP0000002). protectores objetivo fue diseñada para los dos sitios de unión de miR-18a potenciales en el
CDC42
3'UTR usando un algoritmo de Qiagen, y se transfectaron inversa a la concentración recomendada de 500 nM para cada protector de destino. La secuencia de contexto protector de objetivo (la región de la UTR 3 'que flanquean el sitio de unión) para el primer sitio diana de la
CDC42
3'UTR fue 5'AATGAAGAAAAGTATTGCACCTTTGAAATGCACCAAATGA3', y para el segundo sitio diana de la
CDC42
3'UTR fue 5'GTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTG3 '. protectores objetivo adicionales fueron diseñados para el sitio de unión de miR-18a potencial individual en el
CCND1
3'UTR (secuencia de contexto: 5'TAGATGTGTAACCTCTTCACCTTATTCATGGCTGAAGTCA3 '), y los experimentos se llevaron a cabo como para
CDC42
anteriormente . Las células se cultivaron durante 24-48 h después de la transfección.
Cuantificación relativa en tiempo real de RT-PCR
reactivo TRIzol (Invitrogen) se utilizó para la lisis de las células cultivadas y muestras de tejidos humanos. El ARN total se extrajo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro Nanodrop-8000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Análisis de la expresión de los genes miARN se llevó a cabo mediante la cuantificación relativa en tiempo real RT-PCR utilizando ensayos TaqMan miARN (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). El ADNc se sintetizó a partir de 20 ng de ARN total usando cebadores miARN específicos según el protocolo TaqMan miRNA Ensayo, usando 3,5 l de la mezcla principal y 1,5 l de cebador RT en un volumen final l 7.5. PCR en tiempo real se llevó a cabo según el protocolo TaqMan, usando triplicado 10 reacciones mu l para cada biológica replicar incluyendo 1 l de producto de transcripción inversa, 0,5 l-miARN específico cebador y la sonda mezcla de ensayo (IDs de ensayo: miR-17: 002308, miR-18a: 002 422, miR-19a: 000 395, miR-20a: 000580, miR-19b: 000396, miR-92a: 000431), y 1 × TaqMan PCR universal Master Mix No se AmpErase UNG (Applied Biosystems). El ciclo térmico se realizó con un Rotor-Gene Q (Qiagen, Valencia, CA, EE.UU.). Los resultados se normalizaron con respecto a la endógeno ARN nuclear pequeño, RNU6B (ID ensayo: 001.093). los niveles de expresión relativos se calculan a partir de los valores de Ct usando Qgene [24].
Para el análisis de la expresión de ARNm, ARN fue tratado con DNasa I., y el ADNc se sintetizó a partir 1 g de ARN total usando M-MLV transcriptasa inversa, ARNasa H menos (Promega, Madison, WI, EE.UU.) y cebadores hexámeros aleatorios en una reacción de 25 microlitros. PCR en tiempo real se llevó a cabo según el protocolo Green Power SYBR (Applied Biosystems) con los siguientes cebadores para
CDC42
: 5'ACGACCGCTGAGTTATCCAC3 '(hacia adelante) y 5'GGCACCCACTTTTCTTTCACG3' (marcha atrás) y para
CCND1
: 5'GATCAAGTGTGACCCGGACTG3 '(hacia adelante) y 5'CCTTGGGGTCCATGTTCTGC3' (inverso), utilizando triplicado reacciones de 20 l incluidos 2 l de producto de transcripción inversa, 300 nM adelante y atrás primers, y 1 maestro de la mezcla de corriente × SYBR Green (Applied Biosystems). Los resultados se normalizaron con respecto al control endógeno
ACTB
niveles (ß-actina), utilizando los siguientes cebadores:. 5'TTGCCGACAGGATGCAGAAG3 '(hacia adelante) y 5'GCCGATCCACACGGAGTACT3' (inverso), y los niveles de expresión calculados usando Qgene
Western el análisis de transferencia
tampón RIPA se utilizó para obtener los extractos de proteínas de células enteras, que se cuantificaron utilizando un kit de cuantificación de proteína EZQ (Invitrogen). extractos de proteínas fueron resueltas por SDS-PAGE utilizando prefabricados Mini-Protean TGX manchas libres Geles (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.), y electro-transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno utilizando el sistema de transferencia de Trans-Blot Turbo y Mini paquetes de transferencia de PVDF (Bio-Rad). Las membranas se bloquearon con 5% de albúmina de suero bovino o leche en polvo descremada en TBS-T antes de la incubación durante la noche con monoclonal de conejo anti-CDC42 (11A11) (1:1000) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, EE.UU.). se utilizó conejo monoclonal anti-GAPDH (gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa) (D16H11) (1:1000) (Cell Signalling Technology) como control de carga. Se utilizó secundaria peroxidasa de rábano conjugada con IgG de cabra anti-conejo (Immunopure, Thermo Scientific, Rockford, IL) en conjunción con el sistema de quimioluminiscencia mejorada (ECL) (SuperSignal West Pico, Rockford, IL, EE.UU.) para visualizar las bandas utilizando el ChemiDoc MP sistema de imágenes (Bio-Rad). resultados de densitometría se normalizaron a los niveles de GAPDH.
Análisis de crecimiento de las células en tiempo real
La proliferación celular se midió utilizando el instrumento xCELLigence RTCA DP (ACEA Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Las células se sembraron a 20 000 células por pocillo de una placa de E-y se cultivaron con los tratamientos adecuados. Además de las transfecciones, los tratamientos también incluyen el uso de un inhibidor de molécula pequeña de la actividad de CDC42, ML141 (Sigma-Aldrich), a una dosis de 20 mM, o un vehículo de control DMSO [25], [26]. El crecimiento se midió cada 30 min durante 48 a 72 h. El sistema xCELLigence también se utilizó para medir la migración de más de 24 h utilizando la CIM de la placa 16 con las células sembradas en medio libre de suero en la cámara superior a 30 000 por pocillo, y suero bovino fetal al 10% utilizado como un atrayente en la cámara inferior. El Sistema Incucyte Kinetic Imaging (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, EE.UU.) se utilizó como medida de la proliferación adicional. Las células se sembraron a 100 000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos, y la imagen cada hora durante 48 h, con 9 imágenes por pocillo. Las imágenes de contraste de fase de células vivas se utilizaron para calcular la confluencia con el software Incucyte, y para proporcionar información morfología. Además de la formación de imágenes en vivo de células, las células también se fijaron con formaldehído a 48 h, y el citoesqueleto se tiñeron con fluorescencia con Alexa Fluor 488 faloidina (Cell Signalling Technology) a través de la unión de faloidina a F-actina, con células de imágenes utilizando una microscopio de fluorescencia Olympus BX63 con un 20 × objetivo (Olympus, Center Valley, PA, EE.UU.).
ensayos de apoptosis caspasa
la apoptosis se midió a las 24 h utilizando una caspasa-Glo 3/7 de ensayo ( Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con la señal luminiscente proporcional a la actividad de la caspasa-3/7. El Incucyte también proporcionó una medida adicional en tiempo real; se añadió la CellPlayer Caspasa 3/7 reactivo (Essen BioScience) a las células a una concentración final de 5 mM, y en tiempo real imágenes fluorescentes se tomaron cada hora durante 24 h. Estas imágenes se utilizaron para calcular el recuento de células fluorescentes, utilizando el software de análisis de conteo v2.0 IncuCyte objeto. La apoptosis se controló después de la transfección con imita miARN, con o sin tratamiento adicional con el butirato sódico agente pro-apoptóticos (Sigma-Aldrich), en el 2,5 mM durante 24 h.
citometría de flujo
Las células se cosecharon con tripsina 48 h después de la transfección, se lavaron con PBS, y se fijaron con formaldehído al 4% con 20 minutos de incubación en hielo. Las células fueron lavadas con PBS después se resuspendió en 0,2% de Triton X en 1% de BSA en solución de PBS, y se incubaron a temperatura ambiente durante 15 min. Las células se lavaron en solución de lavado de saponina al 1% con PBS, después se resuspendieron en PBS /yoduro de propidio /RNasa A y se incubaron durante 30 minutos, seguido por análisis de FACS utilizando un FACSCanto II citómetro de flujo BD (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) con filtro de 680/40 PI.
miARN objetivo de predicción
predicción de genes diana de miR-18a se obtuvieron utilizando miRwalk, que recopila datos de varios programas de predicción (DIANAmT, Miranda, miRDB, miRWalk, PICTAR5 , PITA, RNA22, y TargetScan) [27]. Se analizaron los genes comunes a tres o más programas de predicción mediante análisis Ingenuity Pathway (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) para identificar los genes implicados en la proliferación y el control del ciclo celular, y se expresan en células colorrectales.
Construcciones de plásmidos
El
CDC42
3'UTR (NM_001791.3) se amplificó usando los siguientes cebadores: 5'CTCTCCAGAGCCCTTTCTGC3 '(hacia adelante) y 5'CAAAGAATTGAGACATGAGAAAGC3' (inverso), utilizando
UFP
ADN polimerasa (Promega) y oligo dT cDNA cebada. El 3'UTR se clonó en el vector pGEM-T Easy (Promega), a continuación se subclonó en el vector psiCHECK-2 (Promega) utilizando
NotI
sitios de restricción, y se secuenciaron. psiCHECK-2 contiene Renilla luciferasa como un gen indicador primario, y la luciferasa de la luciérnaga como un reportero transfección normalización intra-plásmido. La
CDC42
3'UTR se clonó en la región de clonación múltiple localizado corriente abajo de la Renilla traslacional codón de parada, con la unión de los genes miARN a la 3'UTR prevé que como resultado la escisión y la posterior degradación de la transcripción de la fusión ARNm. Disminución de la actividad de luciferasa de Renilla se utilizó como indicador de la actividad de los genes miARN.
Mutagénesis
mutagénesis dirigida al sitio se realizó usando el QuikChange relámpago Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE.UU. ), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para eliminar sitios de unión secuencia de semillas de miR-18a en la
CDC42
3'UTR. Los cebadores para el primer sitio diana de la
CDC42
3'UTR (posición 822-844 de NM_001791.3) fueron: 5'CACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGTGAAATGCACCAAATGAATTGAGTT3 '(hacia adelante) y 5'AACTCAATTCATTTGGTGCATTTCACAATACTTTTCTTCATTTATCAGTG3' (inverso). Los cebadores para el segundo sitio diana de la
CDC42
3'UTR (posición 1295-1317 de NM_001791.3) fueron: 5'AAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCCCAAACCTAATTCTTGTAGATG3 '(hacia adelante) y 5'CATCTACAAGAATTAGGTTTGGGGGAAAGATTACCTCAACATTTTT3' (inverso). Los plásmidos se prepararon con sólo el primer sitio mutado, sólo el segundo sitio mutado, o ambos sitios mutados.
Luciferase ensayo
Después de co-transfección con construcciones psiCHECK-2 plásmido e imita miARN, luciferasa la actividad se midió después de 24 h, utilizando el kit de ensayo de luciferasa Dual-(Promega), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. la actividad de la luciferasa de Renilla se normalizó a la actividad luciferasa de luciérnaga para el mismo plásmido.
El análisis estadístico
Los datos se presentan como media ± error estándar de la media (SEM) de al menos tres réplicas biológicas, con gráficos preparados usando GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t de Student, con un valor de P & lt;. 0,05 consideró significativo
Resultados
miR-18a tiene una menor expresión en general en comparación con otros miembros de la agrupación de miR-17-92 en células colorrectales
muestras de bancos de tejidos humanos se utilizaron para investigar los niveles de miR-18a en el CCR y la mucosa colorrectal normal de, en relación con los niveles de otros miR-17-92 miRNAs en racimo. los niveles de miRNAs miR-17-92 de racimo se cuantificaron en temprano (Dukes A) y avanzado muestras (Dukes C) CRC y la mucosa colorrectal normal correspondiente. miR-17-92 miRNAs fueron elevados en muestras de CRC (Dukes A: miR-17 P = 0,01, miR-18a P = 0,01, miR-19a P = 0,005, miR-20a P = 0,002, miR-19b P = 0,009, miR-92a P = 0,07; Dukes C: miR-17 P = 0,0003, miR-18a P = 0,0005, miR-19a P = 0,0009, miR-20a P & lt; 0,0001, miR-19b P = 0,001, miR-92a P = 0,0007) en comparación con el tejido normal correspondiente, y tenía una expresión más alta en las muestras de Dukes C (Figura 1A y 1B). miR-18a tenía una menor expresión en general en comparación con otros miembros de la agrupación de miR-17-92, en tanto las muestras de Dukes A y C, y en el tejido normal correspondiente (Figura 1A y 1B).
(A) MIR -17-92 niveles de racimo miARN en Dukes A y muestras de tejidos normales adyacentes (B) los niveles de miR-17-92 clúster miARN en Dukes C y muestras de tejidos normales adyacentes. La media ± SEM de 30 pacientes se muestra y expresión se normalizó a RNU6B. * P & lt;. 0,05
miR-18a modula el crecimiento de células de cáncer colorrectal y la muerte
La transfección de células HCT116 con CRC imita miR-18a condujeron a la proliferación reducida durante un periodo de tiempo de 48 h , en comparación con las células transfectadas (NC imitan P & lt; 0,0001) (Figura 2A). Se observó un efecto antiproliferativo similar para miR-18a en una línea celular CRC adicional, LIM1215 (P = 0,0009) (Figura 2B). La transfección de células HCT116 con un inhibidor de LNA miARN miR-18a tuvo el efecto opuesto, con aumento de la proliferación durante un período de tiempo de 48 h en comparación con el inhibidor NC células transfectadas (P = 0,03) (Figura 2C). Las células HCT116 transfectadas con imita el miR-18a muestran una disminución de la capacidad de migrar durante un periodo de 24 h, en comparación con las células transfectadas imitan NC (P = 0,004) (Figura 2D).
mediciones del índice de la célula utilizando el xCELLigence RTCA DP instrumento. (A) La proliferación de Carolina del Norte y la mímica de miR-18a transfectaron células HCT116 durante 48 h. (B) La proliferación de Carolina del Norte y la mímica de miR-18a transfectaron células LIM1215 durante 48 h. (C) Proliferación de Carolina del Norte y el inhibidor de miR-18a transfectaron células HCT116 durante 48 h. (D) La migración de Carolina del Norte y miR-18a imitan transfectaron células HCT116 más de 24 h. La media ± SEM de 6 replica cultivo celular se muestra para cada uno. * P & lt;.
0,05 transfección con imita el miR-18a también parecieron alterar la morfología celular. imágenes en tiempo real tomadas durante 48 h reveló que las células HCT116 transfectadas con imita miR-18a eran más redondeada y menos adherente, con un nivel reducido de confluencia (P & lt; 0,001) (Figura 3A y 3B). Además de miR-19a y b imita revertido en gran medida este efecto. Las células transfectadas con miR-19a y b, además de miR-18a estaban más cerca en apariencia a las células transfectadas imitan NC, con una morfología más extendida, además de los niveles de confluencia similares de más de 48 h (p = 0,20); niveles de confluencia aumentaron significativamente en estas células en comparación con las células transfectadas con miR-18a imitan solo (P & lt; 0,001) (Figura 3A y 3B). El análisis de inmunofluorescencia del componente actina del citoesqueleto utilizando Alexa Fluor 488 faloidina también hizo hincapié en la morfología celular alterada en las células HCT116 miR-18a imitan transfectadas, incluyendo un aspecto más redondeado con una reducción de adhesión intercelular (Figura 3C).
imágenes de células en tiempo real utilizando el instrumento Incucyte. (A) Imágenes representativas de Carolina del Norte, imitador de miR-18a y miR-18a, 19a y las células transfectadas imitan B a las 48 h post-transfección. (B) Confluencia cuantificado a partir de imágenes en tiempo real de Carolina del Norte, imitador de miR-18a y miR-18a, 19a y las células transfectadas imitan B a 48 h. La media ± SEM de 6 replica cultivo celular se muestra. * P & lt; 0,05. (C) Imágenes representativas (20 ×) de Alexa Fluor 488 faloidina tinción fluorescente del citoesqueleto de actina de las células transfectadas imitan NC y miR-18a a las 48 h después de la transfección.
Para medir la apoptosis, una caspasa ensayo de 3/7 de punto final se realizó 24 h después de la transfección de las células HCT116. La transfección con imita el miR-18a aumento de la apoptosis en comparación con las células transfectadas imitan NC (P = 0,04), mientras que la co-transfección con miR-19a y b imita reduce la apoptosis en comparación con imita el miR-18a solos, a un nivel similar al CN imitan transfectadas células (P = 0,16) (Figura 4A). La transfección con miR-19a y b imita solo no tuvo ningún efecto sobre la apoptosis. Además de imita el miR-18a también se ha mejorado la acción de un agente pro-apoptótica conocida. inhibidores de HDAC, tales como butirato, han sido previamente demostrado que induce la apoptosis en las células de CRC [28] - [30]. Las células transfectadas con imita miR-18a junto con el tratamiento butirato 2,5 mM tenían mayores niveles de apoptosis a las 24 h en comparación con las células transfectadas imitan NC también tratados con butirato de (P = 0,001) (Figura 4A). Una vez más, la transfección de miR-19a y b imita con los imitadores de miR-18a reduce este efecto, en comparación con los imitadores de miR-18a sola (p = 0,03), aunque la apoptosis era todavía mayor que con los imita NC (P = 0,03) ( Figura 4A). El efecto de miR-18a sobre la apoptosis se estudió más en tiempo real, utilizando el sistema Incucyte y un ensayo de fluorescencia de caspasa 3/7 para obtener imágenes de células que experimentan apoptosis. Cuando se cuantificaron las imágenes de células HCT116 tomadas 24 h después del tratamiento con butirato, había células significativamente más fluorescentes con la transfección imitador miR-18a en comparación con NC transfección mímica, en células sin tratamiento de drogas (P & lt; 0,001), y en células tratadas con 2.5 butirato mM (P & lt; 0,001) (Figuras 4B y 4D). Se observó un efecto similar en las células LIM 1215, con las diferencias en el recuento de células fluorescente entre el sinóptico miR-18a y NC transfección sinóptico que alcanzan significación 48 h después del tratamiento butirato (P = 0,03 en las células sin tratamiento de drogas; P = 0,02 en las células tratadas con 2,5 mM butirato) (Figura 4C).
(a) caspasa 3/7 ensayo luminiscente en Carolina del Norte, el miR-18a mímica, miR-19a y b mímica, y miR-18a, 19a y b imitan transfectaron Las células HCT116 a las 24 h post-adición de butirato. La media ± SEM de cultivo de células de 3 repeticiones se muestra. * P & lt; 0,05. (B y D) Cuantificación y en tiempo real imágenes de células fluorescentes representativas utilizando el instrumento Incucyte mostrando la apoptosis en las células HCT116 transfectadas imitan NC y miR-18a a las 24 h post-adición de butirato. La media ± SEM de cultivo de células de 3 repeticiones se muestra en B. (C) Cuantificación de imágenes en tiempo real de células fluorescentes utilizando el instrumento Incucyte mostrando la apoptosis en Carolina del Norte y las células transfectadas LIM1215 miR-18a imitan a las 48 h post-adición de butirato. La media ± SEM de cultivo de células de 3 repeticiones se muestra. (E) La citometría de flujo análisis de Carolina del Norte, imitador de miR-18a y miR-18a, 19a y células HCT116 transfectadas imitan B a las 48 h post-transfección; cada gráfico representativo de cultivo de células de 3 repeticiones.
La citometría de flujo se realizó 48 h después de la transfección de las células HCT116, y también mostró una acumulación de células que experimentan muerte celular o apoptosis en las células de miR-18a imitador transfectadas (Figura 4E). Los miméticos de miR-18a, se mostró a inducir G1 S detención del ciclo celular /fase. Además de miR-19a yb imita produjo una disminución de la muerte celular y la detención del ciclo celular que con mímica miR-18a sola (Figura 4E).
La expresión del gen CDC42 control del ciclo celular se reduce en el miR-18a y incrementado en el miR-19a y b
en vista de las conclusiones que el miR-18a reduce la proliferación y la migración, altera la morfología celular, aumenta la apoptosis, e induce la detención del ciclo celular, predijeron se identificaron objetivos de miR-18a que están involucrados en estos procesos celulares. Entre los objetivos previstos miR-18a estaba ciclo de división celular 42 (
CDC42
), que fue predicho por varios programas de predicción de destino. CDC42 es un miembro de la familia Rho de GTPasas, una subfamilia de la superfamilia Ras de pequeñas GTPasas [31]. Tras la activación, CDC42 es capaz de unirse una variedad de proteínas efectoras e iniciar numerosas vías de señalización corriente abajo, incluyendo los implicados en la remodelación del citoesqueleto, la progresión del ciclo celular, la proliferación celular, la supervivencia y la migración [32] - [37]. Hay varias variantes de la transcripción de
CDC42
, que codifican una isoforma canónica presente en la mayoría de los tejidos (isoforma 1) y una isoforma específica del cerebro (isoforma 2). El 3'UTR de las transcripciones de la isoforma canónica contiene dos predijo sitios de unión, mientras que el 3'UTR alternativa de la transcripción para la isoforma cerebro contiene dos sitios de unión predijo miR-18a diferentes miR-18a. Para el propósito de este estudio en células colorrectales,
se investigó CDC42
isoforma 1.
La transfección de células HCT116 con CRC imita miR-18a reducción de los niveles de transcripción de
CDC42
comparó con las células transfectadas NC imitan a las 48 h, cuando se detectó por tiempo real de RT-PCR (P & lt; 0,0001) (Figura 5). Sorprendentemente, co-transfección de miR-19a y b imita junto con los imitadores de miR-18a produce el efecto contrario, con un aumento de
Cdc42
niveles de mRNA que fueron significativamente más altos que tanto las células imitan NC (P = 0,0006) y las células miR-18a imitan transfectadas (P & lt; 0,0001) (Figura 5A). La transfección con un inhibidor de miR-18a aumentó los niveles de transcripción de
CDC42
en comparación con las células NC imitan transfectadas a las 48 h, cuando se detectó por tiempo real de RT-PCR (P & lt; 0,005). (Figura 5B)
(A)
Cdc42
niveles de mRNA en Carolina del Norte, el miR-18a mímica, y miR-18a, 19a y las células transfectadas imitan B a las 48 h post-transfección (B)
CDC42
niveles de mRNA en células transfectadas inhibidores de Carolina del Norte y miR-18a a las 48 h después de la transfección. La media ± SEM de 6 replica cultivo celular se muestra para cada uno y expresión se normalizó a ACTB. * P & lt; 0,05. (C y D) de transferencia Western de los niveles de proteína Cdc42 en Carolina del Norte, imitador de miR-18a y miR-18a, 19a y las células transfectadas imitan B a las 48 h post-transfección. densitometría gráfico muestra la media ± SEM de 3 cultivo celular se replica para cada uno y de expresión está normalizado a GAPDH * P & lt;.
0,05
Western blot mostró niveles de proteína Cdc42 también se redujeron significativamente en el miR-18a imitar las células transfectadas en comparación con las células transfectadas imitan Carolina del Norte, a las 48 h (p = 0,02) (Figura 5C y 5D). La co-transfección de miR-19a y b imita con los imita miR-18a aumentó los niveles de proteína en comparación con miméticos de miR-18a sola (p = 0,008), con niveles más cercanos a la de las células transfectadas imitan NC (P & gt; 0,05) (Figura 5C y 5D).
miR-18a se dirige directamente a la 3'UTR de CDC42
se utilizó un sistema de ensayo de luciferasa para determinar que el miR-18a se dirige directamente a la
CDC42 página 3 'UTR. plásmidos informadores de luciferasa Dual-se construyeron con una intacta
CDC42
3'UTR, o con
Cdc42
3'UTRs mutado en el primero, segundo, o ambos predijo sitios de unión de miR-18a (figura 6A). células HCT116 se transfectaron con cada plásmido, en conjunción con la actividad de luciferasa de la luciérnaga y Renilla miR-18a o imita NC, y se midieron a 24 h. Una disminución de la actividad luciferasa de Renilla normalizado se utiliza como un indicador de la unión de miR-18a y la represión.