Extracto
La expresión aberrante de miR-196a se ha informado con frecuencia en diferentes tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de páncreas. Sin embargo, su función en el cáncer de páncreas no ha sido completamente aclarada. Aquí, se investigó el patrón de expresión y el papel biológico de miR-196a en líneas celulares de cáncer de páncreas, así como su interacción con un gen relacionado con la metástasis, el factor-kappa-B-inhibidor nuclear alfa (NFKBIA). Hemos demostrado que el miR-196a fue hasta reguladas en líneas celulares de cáncer de páncreas humano en comparación con las células epiteliales ductales pancreáticas inmortalizado por medio de microARN microarrays y QRT-PCR. Por otra parte, la baja regulación de miR-196a en PANC-1 suprime la proliferación y migración con un aumento de G
0 /G
1 de transición y disminución de la expresión de la ciclina D1 y CDK4 /6. Mientras tanto, un incremento en la expresión de E-cadherina y disminución de la expresión de N-cadherina y vimentina, también se observaron. Hemos identificado una nueva diana de miR-196a, NFKBIA, y la baja regulación de miR-196a mejorado la expresión de la proteína NFKBIA. Ensayo de la luciferasa confirmó que NFKBIA era un objetivo directo y específico de miR-196a. Silenciamiento NFKBIA en las células PANC-1 mejoró su proliferación y migración. Tomados en conjunto, nuestros resultados indican que el miR-196a es altamente expresado en líneas celulares de cáncer de páncreas, y pueden desempeñar un papel crucial en la proliferación y migración de cáncer de páncreas, posiblemente a través de su objetivo abajo, NFKBIA. Por lo tanto, el miR-196a puede servir como una posible diana terapéutica para el cáncer de páncreas
Visto:. Huang F, J Tang, Zhuang X, Y Zhuang, Cheng W, W Chen, et al. (2014) miR-196a promueve la progresión del cáncer de páncreas por la orientación del factor nuclear kappa-B-inhibidor de la alfa. PLoS ONE 9 (2): e87897. doi: 10.1371 /journal.pone.0087897
Editor: P. Jin Cheng, H. Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Agosto, 2013; Aceptó 3 de enero de 2014; Publicado: 4 Febrero 2014
Derechos de Autor © 2014 Huang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (30973505), la Fundación de Ciencia y Tecnología de la provincia de Guangdong (2009B030801005), la Fundación de Guangzhou Oficina de Ciencia y Tecnología (2009Y-C011-1) y la Fundación del Ministerio de educación de China (20120171110075) de H. Yao. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de páncreas es una neoplasia agresiva con uno de los peores resultados entre todos los cánceres. Para todas las etapas combinadas, la tasa de supervivencia relativa a 5 años es sólo del 5% [1]. La alta mortalidad de cáncer de páncreas podría ser debido en parte a la capacidad de las células de cáncer de páncreas para adquirir características invasoras durante las primeras etapas de la carcinogénesis. Por lo tanto, es probable que incluso en la etapa de una enfermedad aparentemente localizada, micrometástasis pueden estar ya presentes en los sitios de órganos distantes [2]. La quimioterapia convencional no suele ser curativa para el cáncer de páncreas metastásico. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento que se dirigen específicamente y prevenir metástasis podrían tener el potencial de mejorar significativamente el pronóstico de esta enfermedad pésimo.
Estudios recientes han demostrado que los microRNA (miRNA) juegan un papel crítico en la regulación de diversos biológica y patológica procesos, incluyendo metástasis [3]. Estas moléculas no codificantes, pequeñas ejercen sus efectos reguladores mediante la unión a la región no traducida 3 'del ARNm diana, causando ya sea la degradación de mRNA o la inhibición de su traducción a proteínas funcionales. La expresión de miRNAs ha sido reconocido como componentes integrales de muchos procesos biológicos normales que implican una proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la resistencia al estrés [4]. Más importante aún, se ha sugerido recientemente que la regulación al alza o regulación a la baja de aberrante miRNAs específicos y sus objetivos en varios tipos de cáncer se asocia con el desarrollo y progresión del cáncer [5]. La expresión aberrante de algunos miRNAs se ha demostrado estar involucrados en la carcinogénesis del cáncer pancreático [6], [7]. Por otra parte, miR-196a se ha encontrado que se sobreexpresa en el cáncer de páncreas, y se correlacionó significativamente con la mala tasa de supervivencia [8]. Sin embargo, el mecanismo de su función en el cáncer de páncreas sigue siendo poco clara.
El factor nuclear kappa B (NF-kB) juega un papel importante en la regulación de la respuesta inmune [9] y la inflamación [10]. Se compone de una familia de factores de transcripción implicados en la regulación de una amplia variedad de procesos biológicos, y evidencias crecientes demostró su implicación en la tumorigénesis [11] - [14]. Se ha implicado en muchas características de desarrollo y progresión del cáncer, incluyendo el factor independiente de la proliferación de crecimiento [15], la inhibición de la apoptosis [16], y la invasión tisular y la metástasis [17]. Además, evidencias emergentes implican que la activación de NF-kB juega un papel importante en la progresión de cáncer de páncreas [11], [18] - [20]. La inhibición de NF-kappa B sensibiliza a las células de cáncer de páncreas humanos a la apoptosis [21]. NFKBIA, también conocido como I? B, es uno de los miembros de la familia de las proteínas celulares que inhiben el factor de transcripción NF-kB. NFKBIA inhibe NF-kappa B mediante el enmascaramiento de las señales de localización nuclear (NLS) de la proteína NF-kappa B y manteniéndolo secuestrado en un estado inactivo en el citoplasma [22]. Además, NFKBIA bloquea la capacidad de NF-kappa B se una a ADN, que es esencial para la función de NF-kappa B [23]. Se ha demostrado que existe un enriquecimiento de polimorfismos específicos de nucleótido único y haplotipos de NFKBIA en el linfoma de Hodgkin, el cáncer colorrectal y el mieloma múltiple, sugiere que NFKBIA podría ser un supresor de tumor [24] - [26].
en este estudio, hemos demostrado que el miR-196a se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de páncreas y de haber investigado el efecto de la baja regulación de miR-196a en una línea celular de cáncer de páncreas, PANC-1. Hemos dilucidado que NFKBIA es un objetivo de miR196a, y miR-196a juega un papel importante en el desarrollo y progresión del cáncer de páncreas probablemente por la orientación NFKBIA.
Materiales y Métodos
Las líneas celulares
Cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas humanos PANC-1, Capan-2, BxPC-3 y SW1990 fueron adquiridos de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, República Popular de china), y una línea ductal pancreático inmortalizada de células epiteliales H6C7 fue amablemente proporcionada por Tsao (Ontario Cancer Institute, Universidad de Toronto, Canadá) Prof. Ming-sonido, y se incubó en este estudio como se informó anteriormente [27]. Cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas humano (Academia de Ciencias de China, Shanghai, República Popular de China) se cultivaron en DMEM (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, Hyclone, Logan, UT), 100 une /ml penicilina G, y 100 mg /ml de estreptomicina. H6C7, obtenido a partir de Prof.Ming-Tsao sonido del Instituto de Cáncer de Ontario (Ontario, Canadá), se cultivó a 37 ° C en el suero de queratinocitos medio libre (K-SFM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) que contiene 100 U /ml penicilina, 100 u /ml de estreptomicina, 0,2 ng /ml de factor recombinante de crecimiento endotelial (regf) y 20 ng /ml bovina pituitaria extracto (BPE). En todos los experimentos, las células se mantuvieron a 37 ° C en un humidificado 5% de CO
2 atmósfera de aire.
GeneChip microarrays de miRNAs
El perfil de expresión de genes miARN de cuatro cáncer de páncreas humano líneas celulares y H6C7 se determinó mediante análisis de microarrays GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.). Síntesis de cDNA, hibridación a los chips, y los lavados se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante. GeneChips fueron escaneadas a una densidad de 3 mm con un escáner GeneArray (Affymetrix). Las imágenes fueron inspeccionados para asegurar que todos los chips tenían bajo fondo, pero las señales de hibridación brillantes. La media de intensidad de fluorescencia de la señal para cada sonda fue cuartil normalizado. El promedio de tres señales medias para cada sonda miARN se normalizó a la de un oligonucleótido de control añadido y era log
2 transformado. Cada sonda miARN se evaluó para la expresión sobre la base de una prueba de suma de rangos de Wilcoxon de las señales de la sonda conjunto de miARN en comparación con la distribución de señales desde el fondo. de Student
t-test
se utilizó para determinar las diferencias significativas en la expresión de los genes miARN entre la línea celular de cáncer de páncreas humano y la línea ductal pancreático inmortalizada de células epiteliales H6C7, donde
P Hotel & lt; 0,05 se interpretó como significativo.
cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR)
Para analizar la expresión de miR-196a, QRT-PCR se realizó en cuatro líneas celulares de cáncer de páncreas humano (PANC- 1, Capan-2, BxPC-3 y SW1990) y una línea ductal pancreático inmortalizada de células epiteliales H6C7. Brevemente, el ARN total se extrajo de las células usando TRIZOL (Invitrogen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. U6 fue validado como el normalizador. El ARN total fue transcrito inversamente con el correspondiente RT Primer y el kit TaqMan MicroARN transcripción reversa (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.). El cebador de PCR para pieles maduras miR-196a fue diseñado de la siguiente manera: el sentido de miR-196a, 5'-CTG TCG TCG CCG TGT CTT CAC TCC C-3 ', inversa, 5'-TGC CCC AGC ACA GCC CCC GTC CCT C-3 '. La expresión de miR-196a y su U6 de control se detectaron utilizando el sistema de ensayo TaqMan miARN (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
La transfección de células PANC-1