Extracto
PKCa (proteína quinasa C alfa, PRKCA) es una proteína importante implicado en varios pasos de vías de señalización en los pulmones cáncer, y microRNAs (miRNAs) también se han demostrado para participar en la carcinogénesis pulmonar. Sin embargo, no está claro cómo PKCa y miRNAs se correlacionan en la enfermedad. En este informe, que tuvo como objetivo identificar nuevos miRNAs que se dirigen a PKCa y estudiar su función biológica. Utilizando el análisis de la bioinformática, que predijo un nuevo candidato, el miR-203, y encontramos patrones de expresión diferencial de miR-203 y PKCa en tejidos de cáncer de pulmón humano. Por otra parte, validada experimentalmente miR-203 como un regulador directo de PKCa. Por último, hemos demostrado que la focalización de PKCa por miR-203 juega un papel crítico en la regulación de la proliferación celular, la apoptosis y la migración de las células de cáncer de pulmón. En resumen, este estudio identifica una novela miARN que se dirige a PKCa e ilustra que la regulación a la baja de PKCa por miR-203 modula los procesos biológicos en células de cáncer de pulmón
Visto:. Wang C, Wang X, Liang H, T Wang , Yan X, Cao M, et al. (2013) miR-203 inhibe la proliferación celular y la migración de las células del cáncer de pulmón por la orientación PKCa. PLoS ONE 8 (9): e73985. doi: 10.1371 /journal.pone.0073985
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: Abril 8, 2013; Aceptado: July 24, 2013; Publicado: 10 Septiembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81101330, 31271378, 81250044 y J1103512) y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu (núms. BK2011013 y BK2012014). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en todo el mundo, y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) representa aproximadamente el 80% de todos los casos [1]. La mayoría de los cánceres de pulmón (56%) son diagnosticados en una etapa temprana de la enfermedad distante, porque suele ser asintomática; sólo el 15% de los casos se diagnostican en una fase local [2]. De hecho, los pacientes con cáncer de pulmón a menudo presentan invasión de células tumorales y la metástasis antes del diagnóstico que hace que los tratamientos actuales, incluyendo la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia ineficaz. La tasa de supervivencia global a 5 años para el cáncer de pulmón de células no pequeñas es muy baja (17,1%). Por lo tanto, el estudio de las bases moleculares de cáncer de pulmón es crucial para el diseño de nuevos agentes terapéuticos que mejoren la tasa de supervivencia.
La proteína quinasa C (PKC) es una serina /treonina quinasa que desempeña un papel clave en la transducción de la señal varios vías, incluyendo los implicados en la proliferación celular, la diferenciación y la apoptosis [3-5]. La familia PKC contiene 10 isoformas relacionadas con diferentes requisitos de cofactor, el tejido y la distribución subcelular, y especificidad por el sustrato [6]. La familia se divide en convencionales (cPKCs: α, βI, βII, y γ), novela (nPKCs: δ, ε, η, y θ), y atípico (aPKCs: zeta y ι /lambda) subclases. PKC, incluyendo PKCa (PRKCA), juega un papel en el cáncer de pulmón. El nivel de proteína PKCa es significativamente mayor en las líneas celulares de NSCLC (H1355, A549, H1703, H157 y H1155) en comparación con las células epiteliales de pulmón humano primarias (NHBE); Por lo tanto, el aumento de expresión PKCa puede ser una característica general de las células de NSCLC [7]. Ha habido varios informes sobre el papel de PKCa en la proliferación celular, la apoptosis y la migración de células de cáncer de pulmón. PKCa se ha demostrado que se unen y fosforilar los discos de proteínas andamio gran homólogo 1 (DLG1) y promover la migración celular en células de NSCLC [8]. Además, la supresión de la PKCa mejora la citotoxicidad y la mutagenicidad de las células cancerosas de pulmón humano de acetato de plomo (Pb) tratados con CL3 [9]. Estaurosporina, un inhibidor de la PKC potente, controla la adhesión celular, la movilidad, y la invasión de las células A549 [10]; IL1-beta induce la expresión del activador del plasminógeno uroquinasa (uPA) a través de PKCa, lo que conduce a la migración de células de NSCLC A549 [11]
.
microRNAs (miRNAs) son reguladores críticos de la expresión de genes [12,13] . miRNAs maduro ARNm diana se unen a sitios complementarios en las regiones 3 'no traducidas (3'-UTRs) o en las secuencias de codificación, lo cual se suprime la expresión del gen diana [14,15]. miRNAs están desregulados en el cáncer de pulmón humano y juegan un papel importante en la carcinogénesis [16]. Por ejemplo, una baja expresión de let-7a y alta expresión de la agrupación de miR-17-92 se asocia con un pobre resultado clínico en cáncer de pulmón [17,18]. La familia miR-34 también se reprime en el cáncer y está implicado en la supresión de tumores p53 asociada en muchos tipos de cáncer [19-23], incluyendo el cáncer de pulmón [24]. Estos resultados ponen de relieve la necesidad de una búsqueda en profundidad para miRNAs expresados de forma aberrante durante la carcinogénesis pulmonar que pueden desempeñar un papel fundamental en la regulación del crecimiento del cáncer de pulmón o la tumorigénesis.
A pesar de que la desregulación de los miRNAs y PKCa juegan un papel importante en la carcinogénesis pulmonar , se ha reportado ninguna correlación entre PKCa y miRNAs. En este estudio, buscamos miRNAs que podrían dirigirse PKCa y función celular influencia.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El cáncer de pulmón y muestras de tejidos normales adyacentes fueron emparejados derivados de los pacientes sometidos a una intervención quirúrgica en el hospital Torre del tambor de Nanjing (Nanjing, china). Todos los pacientes o sus tutores dado su consentimiento por escrito y el Comité de Ética de la Universidad de Nanjing y Nanjing, Hospital Torre del Tambor aprobaron todos los aspectos de este estudio. Los fragmentos de tejidos se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido en el momento de la cirugía y se almacenaron a -80 ° C. Los tejidos congelados se homogeneizaron y el ARN total se extrajo usando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. Las características clínicas de los pacientes se enumeran en la Tabla 1.
Edad Sexo
patológico del tumor Etapa
Hystotype
148MIIIA (T2b, N2, CMO) de células escamosas Carcinoma270FIA (T1b, No, OCM) Adenocarcinoma362FIIB (T3, no, OCM) Adenocarcinoma455FIIIA (T3, N2, Mo) Adenocarcinoma567MIB (T1, no, Mo) Adenocarcinoma649MIV (T4, N2, M1a) 1. Las características clínicas AdenocarcinomaTable de pacientes con cáncer de pulmón.
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las células, reactivos y anticuerpos
células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano se obtuvieron de la célula de china Culture Center (Shanghai, china). Las células se mantuvieron en Dulbecco Modificado Medio Eagle (DMEM; Gibco, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS; Gibco) y se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% de CO
2. Las moléculas de ARN sintéticos, incluyendo la pre-miR-203, y el revueltos ARN no codificante (ncRNA) fueron adquiridos de Ambion (Austin, TX, EE.UU.). Anti-PKCa (H-7) y anti-GAPDH (6C5) anticuerpos se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (CA, EE.UU.). Cell Counting Kit-8 se adquirió de Dojindo (Japón). El Kit de FITC-anexina V Detección de Apoptosis I se obtuvo de BD Biosciences (CA, EE.UU.).
miRNA y siRNA transfección
miR-203 sobreexpresión se logró mediante la transfección de células con pre-miR 203, un oligonucleótido de ARN sintético que imita el precursor de miR-203, y un ncRNA sirvió como control negativo. Tres secuencias de siRNA dirigidos a diferentes sitios de PKCa ADNc humano (si-PKCa) fueron diseñados y sintetizados por Invitrogen. Un siRNA revueltos que no objetivo PKCa ADNc humano se incluyó como un control negativo. secuencias de siRNA fueron los siguientes: si-PKCa#1: 5'-GGAUGUGGUGAUUCAGGAU-3 '(sentido); si-PKCa#2: 5'-GCAAAGGACUGAUGACCAA-3 '(sentido); si-PKCa#3: 5'-AAGCUCCAUGUCACAGUACGA-3 '(sentido)
células A549 se sembraron en placas de 6 pocillos y se transfectaron el día siguiente usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. . Para cada dosis, así, la igualdad (100 pmol) de NcRNA revueltos, pre-miR-203, se añadieron revueltos siRNA, o si-PKCa. Las células se recogieron 24 h después de la transfección. El nivel de expresión de miR-203 se analizó por RT-PCR cuantitativa, mientras que el nivel de proteína PKCa se evaluó mediante Western blot utilizando un anticuerpo contra PKCa. Estas muestras se normalizaron por transferencia con un anticuerpo contra GAPDH. El software ImageJ se utilizó para cuantificar los niveles de proteína. La secuencia de siRNA con el mejor efecto de interferencia (si-PKCa#3) fue seleccionado y utilizado en otros estudios.
La sobreexpresión de PKCa
Un plásmido de expresión de mamífero que codifica el marco de lectura abierta PKCa humanos sin 3'-UTR se adquirió de Invitrogen. Un plásmido vacío sirvió como control negativo. El plásmido sobreexpresión PKCa se transfectó en las células A549 utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
aislamiento de ARN y RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de las células cultivadas utilizando TRIzol Reactivo (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Para cuantitativa RT-PCR análisis de transcripciones PKCa y ß-actina, 1 g de ARN total se transcribió de forma inversa en ADNc usando un oligdT y Thermoscript la transcriptasa reversa (Takara, Dalian, China). PCR en tiempo real para la PKCa y transcripciones beta-actina se realizó en un sistema de Applied Biosystems 7300 Sequence sistema de detección (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.) utilizando colorante verde SYBR (Invitrogen). Las reacciones de PCR se llevaron a cabo en una reacción de 20 l incluyendo 1μL cDNA, 1 × QuantiTect verde Mix Master PCR SYBR, y 0,5 M cebadores sentido y antisentido. Las reacciones se incubaron en una placa de 96 pocillos a 95 ° C durante 5 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, y 72 ° C durante 30 s. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. Después se llevaron a cabo las reacciones, los ciclos de umbral (C
T) se determinaron mediante la configuración de umbral fijo. Las secuencias de los cebadores sentido y antisentido utilizados para la amplificación de PKCa y β-actina fueron como sigue: PKCa (sentido): 5 'GTGGCAAAGGAGCAGAGAAC-3'; PKCa (antisentido): 5'-TGTAAGATGGGGTGCACAAA-3 '; β-actina (sentido): 5'-AGTACTTCCTC TGCCCTGCTGCAG-3 '; β-actina (antisentido):. 5'-AGGGCAGGCAGCGTATATACAGGA-3 '
Los ensayos para cuantificar madura miR-203 se llevaron a cabo usando sondas Taqman microARN (Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, 1 g ARN total fue inverso-transcrito en cDNA utilizando transcriptasa inversa AMV (Takara) y un cebador tallo-bucle RT (Applied Biosystems). PCR en tiempo real se realizó con un kit TaqMan PCR en un Sistema de Applied Biosystems 7300 de detección de secuencias (Applied Biosystems). Todas las reacciones, incluyendo la no hay controles de plantilla, se realizaron por triplicado. Después de las reacciones, el C
valores T se determinaron utilizando los ajustes de umbral fijos. En los experimentos presentados aquí, la expresión de los genes miARN en las células se normalizó a la expresión de la U6 snRNA. La cantidad relativa de miR-203 para el control interno de U6 se calculó utilizando la ecuación 2
-ΔCT, donde? C
T = C
T miR-203 -C
T U6.
miARN objetivo de predicción
Los miRNAs que pueden atacar PKCa se determinaron utilizando algoritmos de TargetScan (http://genes.mit.edu/targetscan/) [25], PicTar (http: //PicTar .bio.nyu.edu /) [26], y Miranda (http://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl) [27]
ensayo
construcción de plásmidos y luciferasa.
una secuencia parcial de la humana PKCa 3'-UTR, que incluye los sitios de unión predicho miR-203, fue sintetizado por Invitrogen, con una modificación adicional 3'-fosforilación. La secuencia fue la siguiente: PKCa 3'-UTR (sentido): 5 'CTAGTTCTAAGGACGTTGCTGAACAAGCGTGTGAAATCATTTCAGATCAAGGATAAGCCAGTGTGTACATATGTA-3'; PKCa 3'-UTR (antisentido): 5'-AGCTTACATATGTACACACTGGCTTATCCTTGATCTGAAATGATTTCACACGCTTGTTCAGCAACGTCCTTAGAA-3 '. Una molécula de doble cadena fue formado por el recocido de estas dos cadenas individuales a 60 ° C, y este dúplex se insertó en el plásmido p-MIR-informe (Ambion). de inserción eficaz fue confirmada por secuenciación. Para los ensayos de reportero de luciferasa, las células se cultivaron en placas de 6 pocillos, y cada pocillo se transfectaron con 2 g de plásmido de luciferasa de luciérnaga reportero, 2 g vector de expresión de β-galactosidasa (Ambion), y cantidades iguales de ncRNA revueltos o pre-miR 203 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). El vector de β-galactosidasa se utilizó como un control de transfección. Las células se analizaron utilizando los kits de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.) 24 h después de la transfección. Los datos presentados representan tres experimentos independientes.
viabilidad de las células de ensayo
La viabilidad de las células A549 se determinó usando el Cell Counting Kit-8 (Dojindo), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células A549 se sembraron a 5,0 x 10
3 células por pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron durante la noche en medio DMEM suplementado con 10% FBS. Después de la transfección, se añadió 10 l CCK-8 líquido al pocillo de ensayo y se incubó durante 3 h. Absorbancia (
Un
) a continuación, se mide a una longitud de onda de 450 nm.
La migración de células de ensayo
La capacidad de migración de las células A549 se puso a prueba utilizando una cámara de Boyden Transwell (6,5 mm, Costar, Cambridge, MA). Las células se trataron con ncRNA, pre-miR-203, o siRNAs para 6 h y se suspendieron en medio DMEM libre de suero a una concentración de 4 x 10
5 células /ml; a continuación, 4 × 10
4 células /pocillo se añadió a la cámara superior. Simultáneamente, 0,5 ml de DMEM suplementado con 10% FBS se añadió al compartimento inferior, y las placas que contiene transwell-se incubaron durante 18 h en un CO 5%
2 atmósfera saturada con H
2O. Al final de la incubación, las células que habían entrado en la superficie inferior de la membrana de filtro (células migrantes) se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente; a continuación, las células se lavaron tres veces con agua destilada y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las células que quedan en la superficie superior de la membrana de filtro (no migrante) se raspó suavemente con un bastoncillo de algodón. Imágenes de células migrantes fueron capturados utilizando un fotomicroscopio (BX51, Olympus, Japón). La migración celular se cuantificó por recuento de ciego de las células migradas en la superficie inferior de la membrana; cinco campos fueron contados por cámara.
apoptosis de la célula de ensayo
Veinticuatro horas después de la transfección con ncRNA, pre-miR-203, o siRNA, las células A549 se trataron con peróxido de hidrógeno 200 mM ( H
2O
2) durante 30 minutos para inducir la apoptosis. De acuerdo con las instrucciones del fabricante del kit de detección de V Apoptosis FITC-anexina I (BD Biosciences), las células se lavaron dos veces con PBS frío y se resuspendieron en tampón de unión 1 × a una concentración de 1 x 10
6 células /ml . Las células (1 × 10
5 células) se transfirieron a un tubo de cultivo de 5 ml, y se añadieron FITC-anexina V y yoduro de propidio (PI). Las células se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad y se analizaron mediante citometría de flujo (BD Biosciences) en un plazo de 1 h de tinción.
El análisis estadístico
Todas las fotos de las transferencias Western, las células ensayos de apoptosis, y los ensayos de migración eran representativos de al menos tres experimentos independientes. Los datos mostrados se presentan como la media ± desviación estándar (S. D.).
se utilizó t
prueba de comparaciones, y un
p
valor de & lt de Student de 2 colas;. 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Predicción de miRNAs que pueden dirigirse PKCa
Con la ayuda de tres programas de predicción de genes miARN objetivo (TargetScan, PicTar y Miranda), que predijo que el miR-203 objetivos de la transcripción de ARNm PKCa.
las interacciones predichas entre miR-203 y sus sitios de destino en la PKCa 3'-UTR se ilustran en la Figura 1A. Como se muestra en esta figura, hay un sitio diana de miR-203 potencial en el 3'-UTR de la secuencia de PKCa mRNA. Los valores de energía libre mínima de estas interacciones son -27,6 kcal /mol, como se determina por análisis de ARN híbrido [28]. Por otra parte, perfecto apareamiento de bases entre la región de la semilla (la secuencia central que abarca los primeros 2-8 bases de los genes miARN maduro) y los objetivos afines se observó (Figura 1A), y el miR-203 secuencias en la unión 3 'PKCa UTR son altamente conservadas entre especies (Figura 1B).
A, descripción esquemática de los dúplex hipótesis formadas por las interacciones entre los PKCa 3'-UTR y los sitios de unión de miR-203. La estructura predicha del híbrido bases apareadas es diagramado. pares de bases se indican mediante un
línea de negro
, y G: U pares se indican con
tres puntos. La energía libre predicho del híbrido se indica. B, la alineación de secuencias de los sitios de unión putativo miR-203 a través de especies. Los sitios complementarios de semillas están marcados en
rojo
, y todos los nucleótidos en las regiones se conservan en varias especies, incluyendo humanos, de ratón y de rata.
patrones de expresión diferencial de miR-203 y PKCa en tejidos de cáncer de pulmón humano
miRNAs son generalmente considerados para regular negativamente la expresión de sus objetivos a través de la represión de traducción o degradación de ARNm [29,30]. Por lo tanto, si un miARN media la degradación de sus mRNAs específicos, este miARN y sus objetivos deben tener patrones de expresión opuestas. En base a esto, se examinaron los patrones de expresión de miR-203 y PKCa en los mismos 6 pares de cáncer de pulmón y de tejidos cancerosos correspondientes muestras. Utilizando el análisis de PCR cuantitativa en tiempo real, hemos demostrado que la expresión de miR-203 fue significativamente menor en los tejidos de cáncer de pulmón humano que en los tejidos normales adyacentes (Figura 2A); Por el contrario, la expresión de ARNm PKCa fue notablemente mayor en las células cancerosas (Figura 2B).
A, cuantitativa en tiempo real PCR análisis de la relación de expresión de miR-203 en 6 pares de tejido de cáncer de pulmón (LCT) y no canceroso (NCT) muestras de tejido. B, análisis en tiempo real de PCR cuantitativa del nivel de mRNA PKCa relativa en los mismos 6 pares de LCT y las muestras de NCT. Los resultados en A, y B se presentan como la media ± S. D. de tres experimentos independientes (*,
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01) guía empresas
Validación de la regulación PKCa por miR-203
para una validación adicional, las células A549 de adenocarcinoma de pulmón humano se transfectaron con ncRNA o pre-miR-203, y se analizaron las células para la expresión de miR-203 por RT-PCR cuantitativa 24 h después de la transfección. Todas las células que se transfectaron con pre-miR-203 mostraron un aumento significativo de la expresión madura miR-203 (Figura 3A). Para determinar si la sobreexpresión de miR-203 tuvo ningún efecto sobre los niveles de PKCa, repetimos los experimentos anteriores y examinó la expresión de la proteína y el ARNm PKCa 24 h después de la transfección. Como se muestra en la Figura 3B, la expresión de la proteína PKCa se redujo significativamente por la introducción de la pre-miR-203, mientras que las células transfectadas con el ncRNA revueltos mantienen una cantidad considerable de proteína PKCa. niveles similar, las células transfectadas con pre-miR-203 habían disminuidos de PKCa mRNA, con respecto a las células transfectadas con el ncRNA (Figura 3C). En los animales, se cree que los miRNAs para actuar principalmente a través de la represión de traducción en lugar de ARNm división [30], pero los nuevos estudios muestran que los miRNAs metazoos pueden reducir los niveles de muchos de sus transcripciones de destino, no sólo la cantidad de proteína que se derivan de estas transcripciones [31 ]. Nuestros datos sugieren que el miR-203 regula la expresión de PKCa, tanto a nivel de transcripción y proteínas, y teniendo en cuenta una mayor disminución de la proteína PKCa, que podría actuar más en la represión de traducción de la degradación del ARNm.
A, la sobreexpresión de MIR -203. Las células A549 se sembraron en una placa de 6 pocillos y se transfectaron el día siguiente. Para cada pocillo, 100 pmol revueltos se añadió NcRNA o pre-miR-203. Los niveles de miR-203 fueron evaluados por RT-PCR cuantitativa 24 h después de la transfección. A modo de comparación, los niveles de expresión de miR-203 en células transfectadas con NcRNA se ajustaron a 1. El
y
eje x muestra unidades arbitrarias que representan los relativos miR-203 niveles de expresión. Los resultados se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes (***
p
& lt; 0,001). B, inmunotransferencia para la proteína PKCa endógeno en células A549 que eran o transfectadas o transfectadas con NcRNA o pre-miR-203 durante 24 h simulacro. GAPDH se utilizó como control de carga. Las fotos de la prueba de Western blot se analizaron utilizando el software ImageJ, y se muestra un análisis estadístico en el panel de la derecha (media ± S.D. .; **
p Hotel & lt; 0,01). C, análisis de RT-PCR cuantitativa de los niveles de ARNm de PKCa en las células A549 tratadas con ncRNA revueltos o pre-miR-203. El
y
eje x muestra los niveles relativos de ARNm PKCa normalizado a los niveles de β-actina (media ± S.D. .; *,
p Hotel & lt; 0,05). D, el reconocimiento directo de la PKCa 3'-UTR de miR-203. O bien de tipo salvaje (WT) o mutante (mut) sitios de unión de miR-203 (la secuencia que interactúa con las bases 2-8 de miR-203 se mutaron) en la PKCa 3'-UTR se representan. Firefly luciferase reporteros que contiene o bien la de tipo salvaje (WT) o mutante (mut) humano PKCa 3'-UTR se co-transfectó en células A549, junto con revueltos ncRNA, o pre-miR-203. A las 24 h post-transfección, las células se analizaron utilizando un kit de ensayo de luciferasa. Firefly luciferase valores se normalizaron a ß-galactosidasa y se representan en la actividad luciferasa relativa. Para la comparación, la actividad de luciferasa en las células transfectadas con ncRNA se establece como 1. Los resultados se presentan como la media ± S.D. de tres experimentos independientes (**
p Hotel & lt; 0,01).
PKCa es un objetivo directo de miR-203
Para determinar si los efectos reguladores negativos miR-203 ejerce sobre la expresión de PKCa estaban mediados a través de la unión de miR-203 a los presuntos sitios en el 3'-UTR del ARNm PKCa, que la parte fundida de la PKCa 3'-UTR, que incluye la unión predicha miR-203 sitios, aguas abajo del plásmido indicador de luciferasa de luciérnaga. El plásmido resultante se introdujo en células A549, junto con un control de transfección de expresión plásmido β-galactosidasa y pre-miR-203 o de la ncRNA revueltos. Como era de esperar, la sobreexpresión de miR-203 dio lugar a una disminución significativa en la actividad de informador de luciferasa, que se normalizó a la actividad de ß-galactosidasa, en comparación con las células tratadas con el ncRNA revueltos (Figura 3D). Por otra parte, hemos introducido mutaciones puntuales en los sitios complementarios de semillas correspondiente en la PKCa 3'-UTR de eliminar el sitio de unión de miR-203 se predijo. Como se muestra en la figura 3D, las mutaciones en los sitios de semillas complementarias rescatados casi completamente la represión de la actividad de reportero causada por la expresión de pre-miR-203. Esto sugiere que el sitio de unión contribuye fuertemente a los genes miARN: mRNA interacción que media la inhibición post-transcripcional de la expresión PKCa. En conclusión, nuestros resultados demuestran que miR-203 reconoce directamente la 3'-UTR de la transcripción PKCa mRNA y se une a él para regular a la baja su expresión.
El papel de la mediada por miR-203 downregulation PKCa en la proliferación celular, apoptosis y la migración celular
para investigar los fenotipos celulares desencadenadas por la regulación a la baja mediada por el miR-203 de PKCa, las células A549 fueron transfectadas con cualquiera de pre-miR-203 o si-PKCa y se analizaron los cambios en la proliferación celular, apoptosis y la migración.
Como se muestra en la figura 4A, la interferencia más eficiente de la expresión de PKCa podría lograrse si-PKCa#3 (llamado si-PKCa después) de la transfección, en comparación con el control de siRNA. Determinamos las tasas de proliferación de células A549 con disminución de la expresión de PKCa o sobreexpresión de miR-203 usando el Cell Counting Kit-8. En contraste con las células transfectadas de control siRNA, las células transfectadas con si-PKCa proliferaron a una tasa significativamente más baja (Figura 4B). Además, se observó una diferencia significativa en las tasas de proliferación entre las células transfectadas con ncRNA y pre-miR-203 (Figura 4C).
A, la validación de la siRNA contra PKCa. Tres siRNAs dirigidos a diferentes sitios de ADNc humano PKCa y unos revueltos siRNA de control se transfectaron en células A549 utilizando Lipofectamine 2000. Western blot representa los niveles de proteína PKCa a las 24 h después de la transfección. cuantificación normalizada de la inmunotransferencias se llevó a cabo a partir de experimentos independientes. Los datos se presentan como la media ± S.D. (**
p Hotel & lt; 0,01). B, ensayo de viabilidad celular a las 12, 24, 36, y 48 h después de la transfección de las células A549 con dosis iguales de control de siRNA o si-PKCa, o C, dosis iguales de NcRNA revueltos o pre-miR-203 (media ± desviación estándar; **
p Hotel & lt; 0,01). D, el análisis de transferencia Western de los niveles de proteína de PKCa en las células A549 transfectadas con NcRNA, pre-miR-203, o-miR-203 Pre Plus PKCa plásmido sobreexpresión, y un análisis estadístico se muestra en el panel derecho (media ± DE; **
p Hotel & lt; 0,01). E, inmunotransferencia para PKCa proteínas en las células A549 que eran o transfectadas o transfectadas con el plásmido sobreexpresión PKCa simulacro. F, ensayo de viabilidad celular a las 12, 24, 36, y 48 h después de la transfección de las células A549 con NcRNA, pre-miR-203, pre-miR-203 plus PKCa plásmido sobreexpresión o PKCa sobreexpresión plásmido solo (media ± DE; * *
p Hotel & lt; 0,01; ***
p
. & lt; 0,001) guía empresas
a continuación, se investigó si la sobreexpresión de PKCa es suficiente para revertir el inhibidor efectos de miR-203 en PKCa y procesos biológicos en las células de cáncer de pulmón. Un plásmido diseñado para expresar especialmente el marco de longitud completa de lectura abierto (ORF) de PKCa sin el miR-203-sensible 3'-UTR se construyó y transfectó en pre-miR-203 células A549 transfectadas. En comparación con las células transfectadas con pre-miR-203, las células transfectadas con pre-miR-203 y el plásmido sobreexpresión PKCa exhibido niveles significativamente más altos de PKCa (Figura 4D), lo que sugiere que miR-203 resistente PKCa rescató la supresión PKCa causada por miR-203. Las células transfectadas con el plásmido sobreexpresión PKCa solo también mostraron más nivel de expresión de PKCa comparación con las células transfectadas con un plásmido de control vacío (Figura 4E). En consecuencia, la sobreexpresión de PKCa rescató miR-203 mediada por regulación a la baja de las tasas de proliferación de células A549 (Figura 4F). Estos resultados sugieren que el miR-203 podría inhibir la proliferación de células silenciando PKCa.
Después de las células A549 se transfectaron con pre-miR-203, NcRNA, o si-PKCa durante 24 h, se trataron con 200 mM de hidrógeno peróxido durante 30 min para inducir la apoptosis. Luego investigó la apoptosis en células con un aumento de la expresión de miR-203 o silenciados PKCa por citometría de flujo. Cuando se compara con las células transfectadas con ncRNA, el porcentaje de células apoptóticas en el grupo de transfección pre-miR-203 fue significativamente mayor, de 7,64% a 14,01%, respectivamente (Figura 5). Cuando se compara con las células transfectadas con ARNsi de control, la transfección con si-PKCa ligeramente, pero no significativamente, el aumento del porcentaje de células apoptóticas, de 7,98% a 10,16%, respectivamente. Estos resultados sugieren que miR-203 podría promover la apoptosis de las células, pero este efecto se basa sólo parcialmente en su regulación a la baja de PKCa.
células A549 se transfectaron con dosis iguales de ncRNA revueltos o pre-miR-203, o dosis iguales de control de siRNA o si-PKCa. perfiles de apoptosis de las células se analizaron por citometría de flujo. El histograma muestra biparamétrica células en la primera (cuadrante inferior derecho) y los estados apoptóticas tardías (cuadrante superior derecho). Las células viables son de doble negativa (inferior cuadrante izquierdo). El experimento se repitió tres veces, y un análisis estadístico se muestra en el panel derecho (media ± DE; **
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Se evaluó el papel de. miR-203 en la migración celular utilizando el ensayo transwell. Como se muestra en la Figura 6A, la tasa de migración de las células A549 transfectadas con pre-miR-203 se redujo significativamente en comparación con las células transfectadas con el control ncRNA. Además, la transfección con si-PKCa reduce notablemente el número de células A549 que pasa a través de la cámara transwell. Además, cuando las células A549 se transfectaron simultáneamente con pre-miR-203 y el plásmido sobreexpresión PKCa, PKCa recuperó dramáticamente la migración atenuada por miR-203 (Figura 6B). Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que el miR-203 probablemente modulan la migración celular mediante la regulación negativa PKCa.
A, el análisis de las células Transwell A549 tratados con dosis iguales de NcRNA revueltos o pre-miR-203, o con dosis iguales de control de siRNA o si-PKCa. Imágenes representativas de tres experimentos independientes se muestran en el panel izquierdo, y un análisis estadístico se muestran en el panel derecho (media ± S.D. .; **
p Hotel & lt; 0,01). B, imágenes representativas de análisis Transwell de las células A549 que fueron transfectadas con NcRNA, pre-miR-203, pre-miR-203 plus PKCa plásmido sobreexpresión o plásmido sobreexpresión PKCa solo, se muestran en el panel superior, y un análisis estadístico es se muestra en el panel inferior (media ± dE; **
p Hotel & lt; 0,01).
Discusión
Además del cáncer de pulmón, PKCa es también una factor crítico en muchos otros tipos de cáncer. Se ha encontrado que PKCa, δ, y ι fueron significativamente más abundantes en el carcinoma hepatocelular (CHC) tejidos en comparación con los tejidos del hígado no tumorales [32]. Inmunohistoquímica análisis confirmó que los niveles superiores a lo normal PKCa se pueden encontrar en HCC humano [33,34]. Cuando PKCa se introdujo en la línea celular de cáncer de mama MCF-7, la migración celular y la invasión aumentaron [35]. Se informó de que el tratamiento de SK-Hep-1 HCC con antisentido PKCa suprimió significativamente el crecimiento celular, la migración celular y la invasión [36]. Los mismos resultados se reproducen usando los Gö6976 inhibidor PKCa /β, que fue capaz de inhibir significativamente la proliferación, la migración y la invasión en las células de HCC pobremente diferenciado. Estos experimentos sugieren que PKCa es una línea de investigación práctica para entender el desarrollo del cáncer.
Se ha reportado el miR-203 para actuar como un supresor de tumores microRNA, y su expresión se downregulated en células de carcinoma de laringe [37]. Estudios de otro grupo mostraron que la expresión de miR-203 se downregulated en el LNCaP, Du145, PC3, VCAP, y las líneas celulares de cáncer MDA-PCa-2b de próstata [38]. Hemos encontrado que la expresión de miR-203 en tejidos de cáncer de pulmón fue significativamente menor que la de los tejidos normales adyacentes. También se ha demostrado que las funciones de miR-203 en varios tipos de cáncer. La expresión ectópica de miR-203 en líneas celulares de cáncer de próstata podría influir en la proliferación, la apoptosis y la migración [38,39], mientras que la sobreexpresión de miR-203 en células de carcinoma de laringe reducción de la viabilidad celular y llevado a una detención del ciclo celular en la fase G1 [37].