Extracto
proteína de dedo de cinc 217 (ZNF217) es esencial para la proliferación celular y se ha implicado en la tumorigénesis. Sin embargo, su expresión y exactas papeles en el cáncer colorrectal (CCR) siguen sin estar claros. En este estudio, hemos demostrado que ZNF217 expresión se reguló de manera aberrante en los tejidos de CRC y asocia a peor supervivencia global de los pacientes con CCR. Además, se encontró que ZNF217 fue un objetivo putativa de microARN (MIR) -203 utilizando el análisis de la bioinformática y confirmó que el uso de ensayo indicador de luciferasa. Por otra parte, en caída vitro de ZNF217 o expresión forzada de miR-203 proliferación celular atenuada CRC, la invasión y la migración. Además, el tratamiento combinado de ZNF217 siRNA y miR-203 exhibe efectos inhibidores sinérgicos. Tomados en conjunto, nuestros resultados proporcionan nuevas evidencias de que ZNF217 tiene un papel oncogénico en el CCR y está regulado por el miR-203, y abren la posibilidad de ZNF217- y la terapia de miR-203-blanco de CRC
Cita.: Li Z, Du L, Dong Z, Yang Y, Zhang X, Wang L, et al. (2015) miR-203 suprime la ZNF217 Regulación al alza en el cáncer colorrectal y su oncogenicidad. PLoS ONE 10 (1): e0116170. doi: 10.1371 /journal.pone.0116170
Editor Académico: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 25 de Septiembre, 2014; Aceptado: 3 de diciembre de 2014; Publicado: 26 Enero 2015
Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel
Financiación:. el proyecto fue apoyado por las Ciencias Naturales de la Fundación Nacional de Proyectos de China (Grant No. 81072406, 81271916, 31270971 y 81301506), Fondo de Investigación del Programa de Doctorado de Educación Superior de China ( subvención No. 20120131110055), y la Fundación de la provincia de Shandong de Ciencias Naturales (Grant No. ZR2010HZ004). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer colorrectal (CCR) es el segundo y tercer tumor maligno más frecuente en mujeres y hombres, respectivamente, en todo el mundo, con más de 1,2 millones de nuevos casos y se estima que 608,700 muertes sólo en 2008. [1]. A pesar de los recientes avances en el diagnóstico y tratamiento de la CRC, el pronóstico general para los pacientes con CCR sigue siendo pobre [2]. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos para CRC. Para lograr esto, una comprensión más profunda de las redes moleculares y genéticos que controlan la iniciación y progresión del CRC es imprescindible.
ZNF217 gen es un oncogén recién clonado en el 20
ª. Se localiza en el cromosoma 20q13.2 y códigos de un factor de transcripción Kruppel-como de zinc familia de proteínas de dedo [3]. proteína ZNF217 contiene 8 predijo Kruppel-como motivos dedo de zinc C2H2 y una región rica en prolina [4]. Un creciente número de estudios han demostrado que los miembros de la familia de proteínas de zinc dedo juegan un papel importante en el desarrollo de una variedad de tipos de cáncer [5]. Muchas investigaciones han demostrado que copian aumento de número de 20q13.2 cromosoma se asocia con metástasis de CCR [6] y ZNF217 está regulada positivamente en el cáncer de colon, según lo determinado por el artículo MicroDIS captura láser y multiplex PCR cuantitativa en tiempo real [7].
microARNs (miRNAs) son no codificante, 18 a 24 nucleótidos de ARN de longitud, de cadena sencilla que tienen la capacidad de regular negativamente la expresión de genes implicados en varios procesos celulares, incluyendo la proliferación celular, apoptosis, migración, invasión, y respuesta al estrés [8, 9, 10, 11, 12]. Se ha demostrado que los patrones anormales de expresión de los genes miARN están presentes en muchos carcinomas humanos [13] y se asocia con la patogénesis, progresión, y la historia natural de varios tipos de cáncer [11, 14]. Datos recientes sugieren que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes o genes supresores de tumores y jugar un papel crítico en el desarrollo del cáncer [15]. Un estudio presenta evidencias de que ZNFs se regulan a nivel post-transcripcional en el cáncer de mama en el miR-181, que se dirige directamente a las regiones codificantes de ZNFs [4].
En este estudio, el uso de algoritmos bioinformáticos y ensayo indicador de luciferasa , encontramos que ZNF217 es un objetivo de miR-203, un supresor de tumores de miARN. Para explorar las posibles funciones de ZNF217 como un nuevo biomarcador pronóstico para el CDN y su regulación por el miR-203 miRNA en los tejidos de CRC y emparejado colorrectal tejidos normales, hemos realizado experimentos in vitro y confirmamos que 1) ZNF217 puede promover la proliferación, invasión y migración de CRC líneas celulares y 2) ZNF217, así como sus efectos en las líneas celulares de CRC están regulados negativamente por el miR-203, con la esperanza de aclarar aún más el mecanismo de la Convención de desarrollo y proporcionar nuevos hallazgos para el tratamiento selectivo de CRC.
Materiales y métodos
las muestras de tejido
Un total de 82 pacientes con CRC que se sometieron a resección quirúrgica de los tumores de CCR entre julio de 2004 y marzo de 2009 en el Departamento de Cirugía general, hospital de la Universidad de Shandong Qilu, Jinan, China, fueron reclutados para este estudio. Todos los datos de los pacientes se obtuvieron de los registros clínicos y patológicos, incluyendo la edad, el sexo, el tamaño del tumor, la diferenciación, la localización, profundidad invasión y metástasis, así como el estadio del tumor-nódulo-metástasis (TNM). La puesta en escena patológica postoperatoria de cada sujeto se determina de acuerdo con la 7ª edición de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC), sistema de tumor-nódulo-metástasis (TNM) del CCR. Los tejidos tumorales resecados y pareadas tejidos no cancerosos adyacentes (por lo menos 5 cm de distancia desde el margen del tumor) se recogieron de inmediato, se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. Ningún paciente recibió quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Qilu, la Universidad de Shandong y presta su consentimiento informado por escrito se obtuvo de todos los pacientes incluidos.
tinción inmunohistoquímica y la evaluación de ZNF217
La inmunohistoquímica (IHC) se utilizó para ZNF217 detectar la expresión en tejidos de CRC incluidos en parafina. HCC tejidos incluidos en parafina se cortaron como 5 micras secciones horneados a 65 ° C durante 2 h, y desparafinaron utilizando procedimientos estándar. Después de la recuperación de antígeno y el lavado con tampón de Tris, ZNF217 anticuerpo primario (Biosíntesis Biotecnología CO, LTD, Beijing China) se aplicó a las diapositivas y la expresión de ZNF217 fue revisada por incubación con un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa (Zhongshan Goldenbridge Biotecnología, Beijing , china) siguiendo las instrucciones del fabricante
.
ZNF217 tinción se evaluó con un microscopio óptico por dos investigadores independientes que no tenían conocimiento de los resultados clínicos. La tinción se considera positiva para ZNF217 cuando una fuerte correlación fue evidente en el citoplasma. Los tejidos se anotó semi-cuantitativamente contando el citoplasma positivo de 10 campos diferentes a la ampliación de 400 X en las zonas de mayor densidad de citoplasma positivo. Se obtuvo el puntaje de corte apropiada mediante análisis de curvas ROC (ROC) trazadas tomando las puntuaciones porcentuales del tumor o tejido no tumoral adyacente como variables independientes. La puntuación más cercano al máximo de sensibilidad y especificidad, [es decir, el punto (0.0,1.0) en la curva] fue seleccionado como el punto de corte. Las muestras con una puntuación de tinción por encima o por debajo del punto de corte fue clasificado como positivo o negativo, respectivamente.
Cultivo de células y transfección
líneas celulares de CRC (HT-29, SW480, SW620 y humana) y riñón (HEK) línea celular embrionaria 293T se adquirieron de la Colección de Cultivos Tipo de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china), y la línea celular HCT116 fue adquirido de Shanghai Instituto de Bioquímica y Biología celular (República Popular china). Todas las líneas celulares se cultivaron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; hialina, UT) que contenía suero bovino fetal al 10% (Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C en una incubadora suplementado con 5% de CO
2.
la transfección se realizó con el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo el protocolo del fabricante. Una concentración final de 50 nM miARN, 100 nM (siRNA) y sus respectivos controles negativos se utilizaron para cada transfección.
Predicción candidato miRNAs y ensayo indicador de luciferasa
Los dos más generalizada y Web algoritmos bioinformáticos basados en (TargetScan y micrornaorg) se utilizaron para predecir miRNAs candidatos dirigidos la secuencia de nucleótidos de la región 3 'no traducida (UTR) de ZNF217 mRNA. Para comprobar su eficacia, un ensayo indicador de luciferasa se llevó a cabo utilizando los vectores PMIR-ReportTM (RiboBio, Guangzhou, China) que contiene el tipo salvaje (WT) -ZNF217 3'-UTR secuencia o mutante (MUT) - ZNF217 secuencia 3'-UTR . HEK293T células se cotransfectaron transitoriamente con miR-203 /imita el control negativo y miR-WT-ZNF217 3'-UTR del vector /MUT ZNF217 3'-UTR. Las actividades de luciferasa se midieron usando el kit de ensayo Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI) 48 h después de la transfección de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Real-time RT-PCR y Western blot
Total el ARN se extrajo usando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas las manipulaciones de la RNA se llevaron a cabo bajo condiciones libres de RNasa. La concentración de ARN se midió utilizando un BioPhotometer más (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) a 260 nm, y el ARN aislado se almacenó a -80 ° C hasta su uso. Para el análisis de la expresión de mRNA ZNF217. Un total de 1 ARN g se transcribió de forma inversa en ADNc utilizando el kit Superscript (Toyobo, Osaka, Japón) y los análisis se realizaron utilizando SYBR Green (Toyobo, Osaka, Japón) y un ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (QRT-PCR de Applied Biosystems , Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. ZNF217 nivel de ARNm se normalizó a ß-actina y los cambios veces en la expresión de ARNm ZNF217 se cuantificaron utilizando el
-ΔΔCT método de cuantificación relativa 2. Los primers utilizados para la RT-qPCR de ZNF217 fueron adelante, 5'-ATGTTACTCCTCCTCCGGATG-3 'y de reversa, 5'-ACACTTGGCCTGTATCTCA-3'. Todos los cebadores anteriores eran de BioSune, Shanghai, China.
Para la expresión de miR-203, se sintetizó ADNc utilizando cebadores específicos del gen (Ribobio, Guangzhou, China) y el kit M-MLV RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) en una reacción de 20 microlitros. Los reactivos de la reacción de RT contenían 1 g plantilla de ARN, 1 l de 10 mM dNTP mix, 2 l de DTT 0,1 M, 4 l 5 x tampón de primera cadena, y 1 l 40 inhibidor de RNasa U /l. El volumen se ajustó con H2O libre de ARN. La reacción de transcripción inversa se realizó por triplicado para eliminar cualquier valor atípico. MiR-203 expresión se evaluó mediante QRT-PCR y un ABI PRISM 7500 Sequence Detection System Los cambios veces en la expresión de los genes miARN se determinaron utilizando el 2
-ΔΔCT método; la expresión se normalizó al pequeño nivel de expresión de ARN nuclear U6. Los primers utilizados para la RT-qPCR de miR-203 eran de miR-203 hacia adelante 5'-GTGAAATGTTTAGGACCACTAGAA-3 ', 5'-U6 hacia adelante CGCTTCGGCAGCACATATAC-3' y el cebador inverso 5'-universales GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 '.
Las proteínas totales se extrajeron de las células cultivadas usando tampón RIPA que contiene PMSF y se cuantificaron usando BCA kit de ensayo de proteínas (Beyotime, Haimen, china). Un total de 30 g de proteínas se sometieron a SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF. Después del bloqueo, la membrana se incubó con anticuerpo de ratón anti-ZNF217 monoclonal (Abcam, Southampton, Reino Unido) o anticuerpo monoclonal anti-β-actina de ratón (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.), seguido de incubación con conjugado con HRP secundaria anticuerpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.). Las señales se determinaron mediante un kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
proliferación de las células de ensayo
La proliferación celular se midió con un ensayo de metil-thiazolyltetrazolium (MTT). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se sembraron a una densidad de 5 x 10 placas
3 /pocillo en 96 pocillos. Después se cultivaron durante 24, 48, 72, 96 y 120 h, las células se incubaron con 20 l de MTT (5 mg /ml) durante 4 horas a 37 ° C. Los cristales formados en las células se volatilizan por incubación con 150 l de sulfóxido de dimetilo por 10 min a temperatura ambiente y se cuantificaron midiendo la densidad óptica a 490 nm usando un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (Tecan, Suiza).
invasión celular y la migración de ensayo
los potenciales invasivas y migratorias de las células fueron evaluados utilizando insertos transwell con poros de 8 m (Corning). Para el ensayo de invasión, 24 h después de la transfección, 3,0 × 10
se añadieron 5 células en medio libre de suero a la inserción superior pre-recubierto con matriz de matrigel. 500 l 10% de medio FBS se añadió a la cámara inferior. Después de incubación durante 48 h, las células no invasoras se eliminaron de la superficie superior de la membrana Transwell con un hisopo de algodón, y las células invadidas en la superficie de la membrana inferior se fijaron en metanol, se tiñeron con 0,1% de cristal violeta, se fotografiaron y se contaron . ensayo de migración celular se realizó utilizando procedimientos similares, excepto que el 2 × 10
5 células fueron añadidos en los insertos no recubiertos. Se contaron las células en seis campos al azar a 200 magnificación X para cada inserto. Los ensayos se realizaron por triplicado.
Los análisis estadísticos
Se utilizó la prueba t de Student para analizar las diferencias en ZNF217 expresión entre el tumor y los tejidos normales. Las correlaciones entre la expresión ZNF217 y las características clínico-patológicas se analizaron mediante una prueba no paramétrica: prueba de Mann-Whitney U entre dos grupos y la prueba de Kruskal-Wallis para tres o más grupos. El χ2 y la prueba exacta de Fisher se realizaron pruebas para determinar la asociación entre la expresión ZNF217 y los parámetros clínico-patológicos. curva de supervivencia global fue calculado por el método de Kaplan-Meier y las diferencias en la supervivencia de los subgrupos de pacientes se compararon mediante la prueba de log-rank. Se realizó un análisis multivariado de regresión de Cox para estimar los factores pronósticos independientes para la predicción de la supervivencia. La correlación entre ZNF217 y miR-203 se determinó por análisis de correlación de Pearson. Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con el programa SPSS versión 17.0, Microsoft Excel y el software GraphPad Prism. P & lt; 0,05 fue considerado como una diferencia significativa.
Resultados
ZNF217 expresión se correlaciona con las características clínico-patológicas de CRC
IHC análisis de 82 casos de CCR y sus tejidos no cancerosos correspondientes mostró que positiva tinción para ZNF217 se observó en el citoplasma de las células de CRC y las correspondientes células de la mucosa no cancerosas (Fig. 1A). Los porcentajes medios de células teñidas positivas para ZNF217 en mucosa no canceroso canceroso y correspondientes fueron 76,3% y 38,9%, respectivamente. Comparando el porcentaje de células positivas, se determinó que ZNF217 expresión en carcinoma colorrectal fue estadísticamente mayor que la de la mucosa no canceroso adyacente (P & lt; 0,001; Fig. 1B).
(A-izquierda ) tinción citoplasma de ZNF217 en las células de CRC. (A-Derecha) La falta de expresión ZNF217 en las células epiteliales del colon normales. (B) El porcentaje de células teñidas positivamente en el cáncer y tejidos normales adyacentes (* P & lt; 0,05, ** & lt; 0,01). análisis (C) de Kaplan-Meier de la supervivencia global en pacientes con CRC acuerdo con ZNF217 nivel de expresión. El grupo positivo ZNF217 (n = 55) mostró una supervivencia significativamente más corto en comparación con el grupo negativo (n = 27; p = 0,0405: prueba de log-rank).
El análisis de correlación reveló que ZNF217 expresión era positiva correlacionado con el tamaño del tumor, profundidad de la invasión, y de los ganglios linfáticos, (P & lt; 0,05), pero no con la edad del paciente, sexo, grado histológico, y metástasis a distancia (P & gt; 0,05, Tabla 1). Por otra parte, la prueba de Kaplan-Meier mostró que los pacientes con tinción positiva ZNF217 tuvieron una supervivencia más corta que aquellos con tinción negativa ZNF217 (P = 0,028; Fig. 1C).
Reducción de ZNF217 expresión reprime la proliferación celular CRC, migración y la invasión
Para medir las propiedades biológicas de ZNF217 en células CRC, se ensayó la proliferación y la motilidad de las células CRC bajo la condición de siRNA mediada desmontables de ZNF217 gen. En primer lugar, se analizó el nivel de expresión de ZNF217 en un panel de líneas celulares de CRC, incluyendo HCT-116, HT-29, SW620 y SW480. Los resultados mostraron que ZNF217 nivel de expresión era la más alta de las células SW480 y la más baja en las células HT29 entre todas las líneas celulares analizadas (Fig. 2A). Sobre la base de este patrón de expresión, por lo tanto chosed SW480 para estudios adicionales. Transitoriamente la expresión modulada ZNF217 mediante la transfección de siRNA en las células SW480 y encontramos que siRNA mediada por silenciamiento ZNF217 disminución de la proliferación celular (Fig. 2B) y deteriorados migración celular y la invasión habilidades (Fig. 2C). Tomados en conjunto, nuestras observaciones indican que ZNF217 podría promover la proliferación, la migración y la invasión de las células CRC
(B) Reducción de ZNF217 expresión mediante transfección de siRNA-ZNF217 inhibió significativamente la proliferación (* P & lt; 0,05). Y (C ) la migración y la invasión de las células SW480 (200 × magnificación, * P & lt; 0,05) en comparación con los controles parentales y negativos
ZNF217 fueron dirigidos directamente por el miR-203
Uso. bases de datos en línea de predicción de genes miARN objetivo (microrna.org y TargetScan), se encontró que ZNF217 era un objetivo potencial de miR-203 (Fig. 3A). Para verificar este hallazgo, se construyó reporteros de luciferasa de WT y Mut 3'-UTR de ZNF217 y se realizó un ensayo de actividad de luciferasa en células HEK293T. Los resultados mostraron que la transfección de miR-203 imita inhibió significativamente la expresión de WT, pero no Mut 3'-UTR de ZNF217 en células HEK293T (Fig. 3B). De acuerdo con estos resultados, la transfección de miR-203 imita disminuyó la expresión endógena de ZNF217 tanto en los niveles de proteína en las células SW480 (Fig. 3C y 3D) mRNA y. Por otra parte, en el panel analizado de 30 pacientes con CRC, se observó una correlación inversa entre ZNF217 y miR-203 expresión en tejidos de CRC y sus tejidos normales adyacentes (Fig 4E, r = 0,792, P & lt;. 0.01; Fig. 3E). Tomados en conjunto, estos datos sugieren fuertemente que el miR-203 regula negativamente la expresión a través de ZNF217 directamente dirigidas a su secuencia 3'-UTR.
(A) El putativo de miR-203 secuencias de unión en ZNF217 3'-UTR. ensayo (B) La actividad de luciferasa se realizó para las células HEK293T cotransfectadas con vectores que contienen PMIR-ReportTM WT-ZNF217 3'-UTR o secuencias 3'-UTR MUT-ZNF217 y miR-203 imita. Los datos se presentan como cambio veces normalizada en la actividad de luciferasa. (C, D) ZNF217 ARNm y proteínas se determinaron en células SW480 transfectadas con el miR-203 imita o control de miR-negativo por QRT-PCR y Western blot, respectivamente. (E) Correlación inversa entre la expresión de ARNm y ZNF217-203 MIR se analizó los niveles en los tejidos de CRC usando análisis de correlación de Pearson.
(A) La expresión ectópica de miR-203 mediante la transfección de miR-203 imita redujo significativamente la proliferación de las células SW480, en comparación con los controles parentales y negativos (* P & lt; 0,05). (C) la expresión ectópica de miR-203 en particular la migración de células inhibida y la invasión de células SW480 (200 × magnificación, * P & lt; 0,05). A la inversa, la inhibición de la expresión de miR-203 mediante la transfección de los inhibidores de miR-203 al mismo tiempo (B) la proliferación promovido (* P & lt; 0,05) y (D) la migración y la invasión de las células SW480, en comparación con los controles parentales y negativos (200 × magnificación, * P & lt; 0,05). La figura es una representativos de 3 experimentos con resultados similares.
Efecto de miR-203 en la proliferación celular CRC, la migración y la invasión
Para validar si el miR-203 podría regular la proliferación celular CRC , se realizó un ensayo de proliferación de células SW480 transfectadas con el miR-203 imita o su control negativo, y encontró que el aumento de la expresión de miR-203 proliferación significativamente inhibido, (Fig. 4A), la motilidad (Fig. 4B), así como la invasión de células SW480. A la inversa, regulación a la baja de miR-203 en inhibidores-transfectadas las células SW480 aparentemente promueve la proliferación, motilidad y la invasión de las células SW480 (Fig. 4C).
La sobreexpresión de miR-203 refuerza parcialmente inducida por ZNF217 la proliferación, la migración y la invasión CRC de células
Para profundizar en ZNF217 efectos mediada tumorigénicas están regulados por miR-203, que co-transfectadas las células SW480 con ZNF217 siRNA en combinación con el miR-203 imita. Hemos observado efectos inhibidores sinérgicos en ZNF217 expresión (Fig. 5A), así como la proliferación, (Fig. 5B), la migración y la invasión (Fig. 5C) de las células SW480 co-transfectadas con ZNF217 siRNA y miR-203 imita en comparación con células SW480 transfectadas con cualquiera de ZNF217 siRNA o miR-203 imita a solas. Tomados en conjunto, estos resultados indican que las funciones de ZNF217 como un potente oncogén están regulados por miR-203.
(A) la supresión efectiva de ZNF217 expresión de la proteína por ZNF217 siRNA y miR-203 imita, respectivamente, y de forma combinada. Tenga en cuenta que la expresión ZNF217 se suprime de manera más eficiente por el tratamiento combinado. Represión de ZNF217 dio simultáneamente en (B) la inhibición significativa del crecimiento celular y la migración (C) y la invasión (200 aumentos) de las células SW480 en comparación con los controles negativos. Tenga en cuenta el efecto inhibidor sinérgico de la combinación de ZNF217 siRNA y miR-203 imita, en comparación con cualquiera de ellos por sí solo (* P & lt; 0,05) guía empresas
Discusión
ZNF217 es un poco. miembro identificado de la familia de proteínas de dedo de zinc. Es principalmente funciona como un factor regulador de la transcripción que implica en la regulación de aparición del tumor y el desarrollo [16]. ZNF217 posee varios dominios estructurales diversos, incluyendo ocho motivos de unión al ADN de dedos de zinc C2H2, así como un dominio rico en prolina (16-20%) situado en los residuos de 757-1,005. dominios Prolinerich se han demostrado que funcionan como activadores transcripcionales en muchos genes tales como CTF /NF-1 [3]. gen ZNF217 ha sido ampliamente estudiado en el cáncer de próstata [25, 26] cáncer de mama [4, 17], cáncer de ovario [18, 19, 20], carcinoma esofágico de células escamosas [21], cáncer gástrico [22, 23, 24] y , pero no en CRC. Además, el aumento del número de copias de 20q13.2 cromosoma se ha encontrado para ser asociado con la metástasis de CRC. Por lo tanto, es especialmente valiosa para explorar sus posibles funciones en el desarrollo de CCR.
En el presente estudio, se encontró que ZNF217 expresión, tanto a nivel de ARNm y proteínas fue significativamente mayor en los tejidos tumorales de colon que en su no emparejado tejidos tumorales y su sobreexpresión se asocia con las características clínico-malignas y la supervivencia a corto de pacientes con CRC, lo que indica que ZNF217 funciona como un oncogén en el CCR.
la mayoría de los pacientes con cáncer se murió de complicaciones derivadas de la metástasis. Por lo tanto, la orientación enfermedades metastásicas es una estrategia de lucha contra el cáncer de pivote. Muchos estudios han revelado que las proteínas con dedos de cinc que desempeñan papeles críticos en los procesos de invasión tumoral y metástasis incluyendo ZNF217 pueden ser regulados por una variedad de genes [27, 28]. En el presente estudio, encontramos que desmontables de ZNF217 de siRNA llevó a reducción de la proliferación, invasión y migración de las células in vitro CRC. Estos resultados ponen de manifiesto las características oncogénicas de ZNF217 en CRC. De hecho, se ha informado de que las células tumorales HO-8910, LNCaP, DU145 y [26], así como los tejidos de cáncer de mama [4] expresar constructivamente alto nivel de ZNF217. Krig et al informaron de que mis-regulación de la E-cadherina y como todavía no caracterizados genes diana ZNF217 [29] podría ser responsable de las alteraciones en la inmortalización celular, resistencia a la apoptosis, la resistencia a los agentes quimioterapéuticos, y la fosforilación de Akt en células con alto nivel de expresión de ZNF217 . Aunque cientos de genes que son objetivos potenciales de ZNF217 y sitios de unión de consenso se han propuesto, los genes específicos que regulan ZNF217 expresión son poco conocidos.
La acumulación de evidencias indican que la expresión aberrante de miRNAs se vincula con el desarrollo de CCR [ ,,,0],30, 31, 32]. enfoques sofisticados basados en computadoras para la identificación y predicción de los genes miARN objetivo, así como las técnicas de validación para confirmar estas predicciones han contribuido en gran medida al descubrimiento de nuevos miRNAs y su caracterización funcional. En consecuencia, molécula pequeña desregulación mediada de los genes miARN emerge como un nuevo enfoque terapéutico potencial para enfermedades humanas incluyendo cáncer [33]. Entre los miRNAs humanos relacionados con el cáncer, el miR-203 ha atraído una atención significativa porque se expresa de manera aberrante en una variedad de cánceres. En nuestro estudio, hemos identificado para que el miR-203 fue notablemente las reguladas en el CCR humana y la restauración de la expresión de miR-203 podría inhibir la proliferación, invasión y migración de las células SW480. Por el contrario, la transfección de inhibidor de miR-203 estimuló la proliferación, invasión y migración de las células SW480. Estos hallazgos sugieren que el miR-203 está involucrado en los procesos de metástasis de CCR y están de acuerdo con los estudios previos que muestran que el miR-203 se expresaron a precios inferiores a nivel normal en algunos tipos de cáncer [34, 35, 36, 37]. Sin embargo, el miR-203 se han notificado para ejercer una función de oncogenes en los cánceres de riñón y vejiga [38] y adenocarcinoma de páncreas [39]. Las discrepancias en el miR-203 funciones en diferentes tipos de cáncer pueden reflejar las diferencias de contexto celular o alternativamente genes específicos
.
El presente estudio proporciona varias líneas de evidencias que ZNF217 es una nueva diana de miR-203 y su interacción antagonista juega un papel importante en el desarrollo de CRC. En primer lugar, el ensayo indicador de luciferasa demostró que la actividad de la luciferasa bajo el control de la ZNF217 3'UTR podría ser regulada por miR-203. En segundo lugar, se observó una correlación inversa entre ZNF217 y los niveles de miR-203 en los tejidos de CRC. En tercer lugar, la sobreexpresión de miR-203 suprime los niveles de ZNF217 y condujo a una reducción de la proliferación celular, la migración y la invasión en líneas celulares de CRC.
En resumen, en este estudio hemos demostrado que ZNF217 es con frecuencia aumentada en CCR y un potencial oncogen para el desarrollo de CCR. Mientras tanto, nuestra investigación describe ZNF217 /enlace de miR-203 y proporciona un mecanismo potencial para ZNF217 desregulación y la contribución a la invasión de células CRC. Estos resultados abren la posibilidad de aplicar el miR-203 hacia los tratamientos clínicos CRC.
Reconocimientos
Los autores agradecen a Shao-Feng Yan (Departamento de Neurocirugía, Hospital Qilu, la Universidad de Shandong, Jinan , china) para proporcionar el siRNA-ZNF217 los autores también desean agradecer Chao Wang por su orientación técnica del hospital Provincial de Shandong.