Extracto
Antecedentes
Ha habido informes contradictorios con respecto a la función de miR-20a en una variedad de tipos de cáncer y que previamente encontrado que están alteradas en esporádicas contra el cáncer papilar de tiroides familiar . En este estudio, se estudió la expresión de miR-20a en muestras normales, benignas y malignas de la tiroides, y su efecto sobre las células del cáncer de tiroides
in vitro
y
in vivo
.
Metodología /Principales conclusiones
La expresión de miR-20a en el tejido normal, benignos y malignos de la tiroides se determinó por RT-PCR cuantitativa. las células del cáncer de tiroides se transfectaron con miR-20a y el efecto sobre la proliferación celular, la formación de esferoides de tumores, y se evaluó la invasión. Los genes diana de miR-20 se determinaron mediante análisis de la expresión de ARNm de todo el genoma con la sobreexpresión de miR-20a en células de cáncer de tiroides y la base de datos de predicción de destino. Los genes diana fueron validados por PCR e inmunotransferencia cuantitativa, y ensayos de luciferasa. expresión miR-20a fue significativamente mayor en el cáncer de tiroides anaplásico que en el cáncer diferenciado de tiroides, y de los tejidos tiroideos benignos y normales. la proliferación de células de cáncer de tiroides inhibió significativamente el miR-20a
in vitro gratis (p & lt; 0,01) y
in vivo gratis (p & lt; 0,01), la formación de esferoides de tumor (p & lt; 0,05) y la invasión (p & lt; 0,05) en varias líneas celulares de cáncer de tiroides. Hemos encontrado que
LIMK1
era un objetivo de miR-20a en líneas celulares de cáncer de tiroides y caída directa de LIMK1 recapitula el efecto de miR-20a en células de cáncer de tiroides.
Conclusiones /Importancia
para nuestro conocimiento, este es el primer estudio que demuestra que el miR-20a juega un papel como un supresor de tumores en las células de cáncer de tiroides y objetivos
LIMK1
. Nuestros hallazgos sugieren la expresión regulada por incremento de miR-20a en el cáncer de tiroides anaplásico contrarresta la progresión del cáncer de tiroides y pueden tener un potencial terapéutico
Visto:. Xiong Y, Zhang L, Kebebew E (2014) miR-20a está regulada positivamente en anaplásico cáncer y Objetivos de la tiroides
LIMK1
. PLoS ONE 9 (5): e96103. doi: 10.1371 /journal.pone.0096103
Editor: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, China
Recibido: 31 Enero, 2014; Aceptado: 3 Abril de 2014; Publicado: 23-may 2014
Derechos de Autor © 2014. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue financiado por los Institutos nacionales de Salud, Instituto Nacional del cáncer. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de tiroides es el cáncer endocrino más común y una de las de más rápido crecimiento diagnósticos de cáncer en los Estados Unidos [1], [2]. Los cánceres de tiroides se originan a partir de células foliculares y células parafoliculares [3], [4]. Los cánceres de tiroides se originan a partir de células foliculares representan más del 95% de todos los casos de cáncer de tiroides y se clasifican en cuatro grandes grupos histológicos (cáncer papilar de tiroides (PTC), cáncer de tiroides folicular (FTC), carcinoma de células Hürthle (HCC), y el carcinoma anaplásico de tiroides (ATC)). MicroARNs (miRNAs) han demostrado ser dysregulated en cánceres de tiroides se origina a partir de células foliculares [5] - [7]. MiRNAs son pequeñas, los ARN no codificantes, que son aproximadamente 21 nucleótidos de longitud y regulan la expresión de genes [8], [9]. En general, los miRNAs se unen a la región 3 'sin traducir (3'-UTR) del gen diana, lo que lleva a la traducción reprimida o la degradación de ARNm [9], [10].
miR-20a es un miembro de la agrupación miR-17-92 localizado en el cromosoma 13. estudios anteriores han demostrado que el miR-20 puede funcionar para promover o inhibir las características distintivas del fenotipo de células malignas de un modo determinado tipo de células [11] - [13]. Por ejemplo, la sobreexpresión de miR-20a inhibe la proliferación celular, la invasión y la metástasis del tumor en líneas celulares de cáncer de mama [11], [12]. Por otra parte, suprime la miR-20a
E2F1
expresión en la línea celular B humana P-493-6, un factor de transcripción que promueve la progresión de la fase G1-S en células de mamífero [14]. Este hallazgo sugiere que la función de miR-20a puede ser diferente dependiendo del tipo de célula. Hemos determinado anteriormente miR-20a que se upregulated en PTC familiar en comparación con los casos esporádicos, que se cree que ser más agresivo [3], [15]. Takakura et al. [16] también encontró que los miRNAs de la agrupación de miR-17-92 (miR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, -20, -19b, y -92-1) se sobreexpresa en células ATC líneas.
en este estudio, se caracteriza la expresión de miR-20a en muestras normales, benignas y malignas de la tiroides, y estudiamos su efecto sobre las células del cáncer de tiroides
in vitro
y
In
vivo. También se realizó un análisis de miR-20a genes diana utilizando la base de datos de predicción de destino y la expresión de todo el genoma con la sobreexpresión de miR-20a, y validado con los genes diana de ensayo de luciferasa. Por último, se muestra que LIMK1 recapitula los efectos de miR-20a en células de cáncer de tiroides.
Materiales y Métodos
muestras de tejido tiroideo humano y experimentos con animales
muestras de tejido de la tiroides eran broche de congelados en el momento de la tiroidectomía en virtud de un protocolo aprobado por la Oficina de Investigación de Sujetos Humanos de los Institutos nacionales de Salud Centro clínico, tras el consentimiento informado por escrito. Todas las muestras de tejido se sometieron a histología secundaria revisión adicional por un patólogo endocrino para confirmar el diagnóstico e identificar las muestras con células tumorales mayor que 80%. Las muestras de tejido fueron clasificados como benignos (bocio multinodular, adenoma folicular, adenoma de células Hürthle) normal, el cáncer diferenciado de tiroides [DTC] (PTC clásico, variante folicular de PTC, FTC), y el ATC. tejido tiroideo normal se obtuvo de pacientes sometidos a tiroidectomía para la enfermedad benigna o maligna de la lóbulo tiroideo contralateral. En total, se analizaron 8 ATC, 22 DTC, 24 benigno, y 11 muestras de tejidos normales de la tiroides.
El Comité Nacional Cancer Institute Uso y Cuidado de Animales aprobó los protocolos para el cuidado de los animales y gastos en el presente estudio. Cualquier ratón que experimenta signos neurológicos significativamente anormales, sangrado de cualquier orificio, problemas de movilidad, pérdida de peso rápida, debilitante diarrea, pelo áspero, postura encorvada, dificultad para respirar, letargo, decúbito persistente, ictericia, anemia, trauma autoinducido, se convierte moribundos o de lo contrario se vuelve incapaz de obtener alimentos o agua, o con un tumor de 2 cm o más de diámetro ha sido inmediatamente sacrificados por CO
2 cámara.
líneas celulares y condiciones de cultivo
tiroides humana líneas celulares de cáncer XTC-1 (HCC) (amablemente proporcionados por el Dr. Orlo H. Clark (San Francisco, CA)) [17], FTC-133 (FTC) (amablemente proporcionado por el Dr. Peter Goretzki (Alemania)), y TPC-1 (PTC) (amablemente proporcionado por el Dr. Nabuo Satoh (Japón) [18]) se mantuvieron en DMEM con 4.500 mg /l de D-glucosa y L-glutamina, y 110 mg /l de piruvato de sodio, suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), hormona estimulante de la tiroides (TSH) (10 mU /ml), penicilina (10.000 U /ml), estreptomicina (10.000 U /ml), Fungizone (250 mg /ml), y la insulina ( 10 mg /ml) en un incubador humidificado estándar a 37 ° C en un 5% de CO
2 y el 95% de O
2 atmósfera. medios libres de suero (medios DMEM-F12), suplementado con cuatro hormonas (insulina [10 mg /ml], la somatostatina [10 ng /ml], transferrina [5 mg /ml], y la hidrocortisona [0,36 ng /ml]), se utilizó para los estudios de genómica funcional. La línea celular humana ATC C643 fue proporcionado amablemente por el Dr. Rebecca Schweppe, con permiso del Dr. N.-E. Heldin (Suecia) [18], y se mantuvo en RPMI (Invitrogen, Carlsbad, CA) que contiene 10% de FBS. Todas las líneas celulares se acreditarán mediante la repetición en tándem corta el 9 de octubre de 2013 y la línea celular XTC-1 también se confirmó para expresar la tiroglobulina y sodio yodo cotransportador como se informó anteriormente [17].
Mirna transfección
precursor de miARN maduro (pre-miR-20a; Applied Biosystems, Foster City, CA) se transfectó en las células a una concentración de 25 nM usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Un oligonucleótido que no representan ningún miARN conocido (pre-miARN miR-Moléculas precursoras negativo de control n ° 1; Applied Biosystems, Foster City, CA). Se utilizó como control negativo
transfección siRNA
LIMK1 siRNA #A (s8188 ID), siRNA #B (s8189 ID) y siRNA #C (ID s 8190) (Applied Biosystems, Foster City, CA) se transfectaron en células a una concentración de 60 nM usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad , CA), siguiendo el protocolo del fabricante. Silenciador Seleccione Control Negativo#1 siRNA (Applied Biosystems) se utilizó como control negativo.
aislamiento de ARN y cuantitativa en tiempo real RT-PCR
ARN total fue aislado de las líneas celulares utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). El miARN ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) se utilizó para medir el nivel de expresión de los genes miARN. El ARN total se transcribió de forma inversa con un cebador-miARN específico, seguido por PCR en tiempo real con sondas TaqMan. U6 se utilizó como control endógeno. La cantidad relativa de ARNm en
LIM cinasa 1 gratis (
LIMK1
) se determinó mediante el ensayo TaqMan (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) en un sistema ABI 7900 HT, y humano
GAPDH
se utilizó como control endógeno. El método ΔΔ Ct se utilizó para calcular los niveles de expresión.
lisado blot
Plenario de células Occidental fue preparado con tampón RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL). nivel de proteína LIMK1 se determinó por transferencia de Western usando un anticuerpo policlonal de conejo anti-LIMK1 (dilución 1:1500; Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA). proteína GAPDH se detectó mediante el uso de un (# 0411) de anticuerpo-GAPDH contra (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). monoclonal de ratón
Ensayo de proliferación de
La proliferación celular se determinó usando el Cell CyQUANT Ensayo de proliferación (Invitrogen, Carlsbad, CA), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La intensidad de fluorescencia se midió utilizando un lector de microplacas de fluorescencia (Molecular Devices, Sunnyvale, CA), con excitación a 485 nm y emisión detección a 538 nm.
se midió ensayo de invasión
invasión celular utilizando la BioCoat Matrigel Cámara BD Invasion (BD Biosciences, Bedford, MA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Medio de cultivo celular con 10% de FBS se utilizó como un quimioatrayente en el pocillo inferior de la cámara de Boyden. Después de la rehidratación de la membrana basal, las células de cáncer de tiroides se sembraron en el compartimiento superior de la cámara en medio libre de suero (4 × 10
4 células por pocillo). Después de incubación a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 22 horas, las células no invasoras se eliminaron de la superficie superior, y las células que habían invadido la membrana a la superficie inferior se tiñeron con Diff-Quik Set (Siemens Healthcare Diagnostics, Inc., Newark, DE). Las imágenes fueron tomadas de la membrana de cada inserto con un microscopio (50 aumentos) usando una cámara digital. Las imágenes fueron vistas en la pantalla del ordenador y las células en campos individuales de cada inserto se contaron manualmente. El porcentaje de células invasoras se determinó contando el número de células invasoras través de la matriz y la membrana de Matrigel con relación al número de células que migran a través de la membrana de los insertos de control sin la matriz de Matrigel. Un índice de invasión se calculó basándose en la relación del porcentaje de invasión de células divididas por el porcentaje de células invasoras de las células de control.
cultivo esferoide
Dos días después de la transfección de los genes miARN, FTC-133 células se tripsinizaron, se contaron, se resuspendieron en medio de cultivo, y se sembraron en una placa de clústeres ultra bajo (Costar, Corning, NY) a 3,5 × 10
4 por pocillo. Las placas se cultivaron a 37 ° C en 5% de CO
2, y el medio se cambió cada 2 a 3 días. Después de 2 semanas de cultivo, las células se tiñeron con violeta cristal y se fotografiaron con un microscopio. La superficie total ocupada por esferoides dentro de una imagen se midió circunscribiendo el perímetro de cada esferoide, que marca toda la zona, y el cálculo del número de píxeles utilizando el software ImageJ (Maryland, EE.UU.).
Estudios de xenoinjertos de tumores
FTC-133 células transfectadas con miR-20a o miR-NC se inocularon por vía subcutánea (10
5 células viables) en la izquierda y en los flancos derecho de ratones desnudos atímicos. Los tumores se midieron dos veces a la semana con calibres y los volúmenes se calcularon como longitud x anchura x altura. muestras de tumores de la autopsia fueron fotografiados para documentar la morfología bruto, y luego se pesaron las muestras.
Migración de ensayo
El cáncer de tiroides migración celular se evaluó mediante un ensayo de los arañazos de la herida. 150.000 células fueron transfectadas con miRNAs (25 NM) o siRNAs (60 nm) y se sembraron en placas de seis pocillos y se deja que se unan y crecer durante 44 horas (miRNAs) o 72 horas (siRNAs). A partir de entonces, tres heridas verticales se hicieron con una punta de pipeta 10-l estéril y una línea horizontal se hizo a través de las tres líneas de modo que las células pudieron observarse en el mismo punto. Las células fueron inspeccionados cada 12 horas y las mediciones realizadas hasta 24 horas.
array expresión del ARNm de todo el genoma
p>
Las predicciones de los objetivos de micro-ARN
TargetScan 5,1 (http://targetscan.org/) se utilizó para identificar blancos potenciales para la regulación de miR-20a en el tejido de la tiroides.
reportero de luciferasa ensayo
El par de base 1223 3 ' -UTR del ser humano
LIMK1
se clonó en un vector informador de luciferasa vacío pEZX-MT01 (GeneCopoeia, Rockville, MD), generando un tipo salvaje
LIMK1
UTR constructo informador de luciferasa (pEZX-LIMK1 -UTR). Para el ensayo de luciferasa dual, células FTC-133 se sembraron por triplicado en placas de 12 pocillos y se co-transfectaron con 0,25 g del constructo reportero y 15 pmol de miR-20a o miR-NC utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). A las 24 horas, las células se lisaron y se ensayaron para tanto luciérnaga y luciferasa de Renilla utilizando Luc-Pair MIR Luciferase Assay Kit (GeneCopoeia, Rockville, MD) en un lector de microplacas SpectraMax M5e (Molecular Device, Sunnyvale, CA), de acuerdo con los fabricantes 'instrucciones.
análisis de los datos
los datos se presentan como media ± error estándar de la media. Para determinar la significación estadística, se utilizaron análisis de la varianza y la prueba de t, como sea apropiado. Un valor de p menor de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
miR-20a se sobreexpresa en el cáncer de tiroides anaplásico (ATC)
Nos pareció que el nivel de expresión del MIR -20Â fue significativamente mayor en ATC que en DTC, tejidos tiroideos benignos y normales (Fig. 1). No hubo diferencia significativa en el nivel de expresión de miR-20a por
BRAF
estado de mutación (p = 0,62) o la extensión de la enfermedad (p = 0,70 para el tamaño del tumor; p = 0,12 para la metástasis de los ganglios linfáticos) en DTC o PTC .
eje Y representa relativo nivel de expresión de miR-20a normalizado a U6 (2
-ΔΔCt valor). Quantitative PCR en tiempo real se realizó con ARN total de 65 tejidos humanos (8, 22 ATCs DTCs, 24 benignos, y 11 normal). Las barras de error representan el error estándar de la media (* indica p & lt; 0,05).
miR-20a regula la proliferación de células de cáncer de tiroides, la formación de esferoides, y la invasión
sobreexpresa miR-20a en cuatro líneas celulares de cáncer de tiroides (TPC-1, XTC-1, FTC-133, y C643) utilizando miR-NC como un control negativo para determinar su efecto sobre la proliferación celular. MiR-20a sobreexpresión proliferación celular significativamente inhibida por 24% en las células TPC-1 a 144 horas (p & lt; 0,001), 34% en las células XTC-1 a 144 horas (p & lt; 0,001), 22% en las células de FTC-133 en 144 hora (p & lt; 0,001), y 22% en las células C643 de 216 horas (Fig 2A-D.). Se evaluó el efecto de miR-20a sobre el crecimiento tumoral
in vivo
. Hemos encontrado que las xenoinjertos de tumores derivados de células de FTC-133 transfectadas con miR-20a fueron significativamente más pequeños que los xenoinjertos tumorales del grupo de miR-NC (p & lt; 0,01) (Fig. 2E), y los pesos de los tumores derivados de células de FTC-133 transfectadas con miR-20a también fueron significativamente menores que los pesos de los tumores en el grupo de miR-NC (p & lt; 0,05). (Fig. 2F)
(A-D). la proliferación de la línea celular del cáncer de tiroides con la sobreexpresión de miR-20a. El eje Y representa el número de células. (E-F) El cáncer de tiroides
in vivo
crecimiento,
ex vivo
cosechas tumorales y peso. Las barras de error representan el error estándar de la media (* indica p & lt; 0,05; ** indica p & lt; 0,01) guía empresas
También se estudió el efecto de miR-20a en la formación de esferoides de tumor de células del cáncer de tiroides.. La línea celular FTC-133 forma esferoides cuando se cultivan en ultra bajo frasco de cultivo adherente y con la transfección de miR-20a, el número y tamaño de esferoides se redujo significativamente (Fig. 3).
(A) Imagen Representante de esferoides en cultivo con sobreexpresión de miR-20a. (B) Cuantificación de la diferencia esferoide con sobreexpresión de miR-20a. El área total ocupada por los esferoides dentro de una imagen se midió por que circunscribe el perímetro de cada esferoide, marcando toda la zona, y el cálculo de los números de píxeles con el software ImageJ (Maryland, EE.UU.). El eje Y representa el tamaño y número de los esferoides. Las barras de error representan el SEM (* indica P & lt; 0,05) guía empresas
miR-20a sobreexpresión, inhibió la invasión de células en un 85% en las células del TPC-1 (p & lt; 0,01)., el 67% en las células XTC-1 (p & lt; 0,001), 61% en FTC-133 células (p & lt; 0,001), y 87% en las células C643 (P & lt; 0,01) (Fig. 4). No se observó ninguna diferencia significativa entre las células transfectadas con el miR-20a y miR-NC en el ensayo de cicatrización de heridas utilizando células TPC-1 y células FTC-133.
TPC-1 línea celular de cáncer de tiroides (A), (B) línea celular XTC-1 cáncer de tiroides, (C) línea celular FTC-133 cáncer de tiroides, y la línea celular de cáncer (D) C643 tiroides. El eje Y representa el índice de invasión de las células del cáncer de tiroides. Las barras de error representan el error estándar de la media (* indica p & lt; 0,05; ** indica p & lt; 0,01; *** indica p & lt; 0,001) guía empresas
miR-20a regula la expresión de LIMK1 en células de cáncer de tiroides
Dado que el miR-20a tuvo un efecto sobre la proliferación celular y la invasión
in vitro
y
in vivo
, que estaban interesados en la determinación del gen objetivo (s) de miR 20a. Se han utilizado dos enfoques para determinar los objetivos de miR-20a: (1) una base de datos de predicción objetivo y (2) el análisis de expresión de todo el genoma con la sobreexpresión de miR-20a. Encontramos 3635 predijo genes diana de miR-20a usando el software TargetScan 5.0. Hemos encontrado 58 genes con expresión alterada a la sobreexpresión de miR-20a utilizando el análisis de la expresión de todo el genoma. Entre los 45 genes cuyo nivel de expresión se había reducido regulado, 37 genes se predijo genes diana de miR-20a (Tabla 1).
LIMK1
era el gen más downregulated de este análisis y se ha informado anteriormente para tener un papel en la invasión de células tumorales y la metástasis [19] - [22]. Por lo tanto, estábamos interesados en determinar si
LIMK1
era un objetivo directo de miR-20a. Se encontró que la expresión de proteínas de LIMK1 en líneas celulares de cáncer de tiroides (C643, XTC-1, FTC-133, y TPC-1) se redujo con miR-20a sobreexpresión (Fig. 5A). Se observó la disminución de la expresión de la proteína LIMK1 por hasta 14 días después de la transfección (Fig. 5B).
inmunotransferencias (A) para la expresión de proteínas LIMK1 en C643, XTC-1, FTC-133, y TPC-1 líneas celulares, que fueron transfectadas con cualquiera de miR-20a o miR-NC durante 72 horas. (B) Las inmunotransferencias de LIMK1 endógena y GAPDH en células FTC-133 transfectadas con cualquiera de miR-20a o miR-NC para 7 días, 14 días y 21 días.
Para determinar si si
LIMK1
era un objetivo directo de miR-20a, se utilizó un vector informador de luciferasa pEZX-MT01 con la 3'-UTR de humano
LIMK1
clonado en él, lo que genera un
LIMK1
3'-UTR constructo informador de luciferasa (pEZX-LIMK1-UTR). Hemos realizado ensayos de luciferasa con la pEZX-LIMK1-UTR (vector con 3'-UTR de LIMK1) co-transfectaron en la línea celular de FTC-133 con miR-20a o miR-NC. Hemos encontrado un descenso significativamente la actividad de la luciferasa con la sobreexpresión de miR-20a en comparación con el control negativo (Fig. 6A), lo que sugiere que el miR-20a regula a la baja directamente
LIMK1
expresión. Dado que la sobreexpresión de miR-20a downregulated
LIMK1 Hoteles en líneas celulares de cáncer de tiroides y el efecto más destacado de miR-20a en las células del cáncer de tiroides fue la inhibición de la invasión celular, hemos explorado si
LIMK1
tiene un efecto sobre la invasión celular y la migración. Se encontró que desmontables de
LIMK1
resultó en una disminución invasión celular pero no la migración (Fig. 6B y C).
(A) actividad de luciferasa de pEZX-LIMK1-UTR en células de FTC-133 cuando se co-transfectadas con miR-20a o miR-NC. Todas las mediciones de luciferasa se realizaron por triplicado y las lecturas se realizaron a las 24 horas post-transfección. Las barras de error representan el error estándar de la media (* indica p & lt; 0,05). (B)
LIMK1
siRNA desmontables en FTC-133 línea celular de cáncer de tiroides. la expresión de ARNm de LIMK1 por RT-PCR cuantitativa (panel superior). expresión de la proteína LIMK1 por Western blot (panel inferior). Los datos que aparecen durante 72 horas después de la transfección de siRNA. (C) la invasión celular con caída LIMK1. La transfección de
LIMK1
siRNAs inhibida FTC-133 cáncer de tiroides células invasión. El eje Y representa el índice de invasión de las células del cáncer de tiroides. Los datos que aparecen durante 72 horas después de la transfección de siRNA. Las barras de error representan el error estándar de la media (* indica p & lt; 0,05; ** indica p & lt; 0,01). (D) La transfección de
LIMK1
siRNAs no tiene ningún efecto sobre la migración de FTC-133 células de cáncer de tiroides. El eje Y representa la distancia de la herida. Los datos que aparecen durante 72 horas después de la transfección de siRNA. Las barras de error representan el error estándar de la media.
Discusión
En este estudio, se encontró miR-20a se sobreexpresa en ATC en comparación con DTC, tejido tiroideo benigno y normal. sobreexpresión ectópica de miR-20a inhibió significativamente la proliferación de células de cáncer de tiroides
in vitro Opiniones y en
in vivo
, y, inhibió la formación de esferoides tumorales y la invasión en múltiples líneas celulares de cáncer de tiroides. Esto sugiere que miR-20a tiene una función supresora de tumor cuando se upregulated en el cáncer de tiroides. También se encontró que el miR-20a regula
LIMK1
expresión, lo que sugiere que
LIMK1
es un gen diana que pueden mediar los efectos supresores de miR-20a en el crecimiento y la invasión de las células del cáncer de tiroides. Sin embargo, una limitación de nuestro estudio es el pequeño número de muestras tumorales analizadas ATC pero es una neoplasia poco frecuente.
miR-20a y miR-17 (también llamado miR-17-5p) se encuentran juntos en el clúster de miR-17-92, y tienen la misma secuencia de semillas, AAAGUG. Esta secuencia de semillas es compartida por otros tres miRNAs humanos maduros (miR-106a, -106b y -20b), que se encuentra en el cromosoma 7 y el cromosoma X. objetivos de miR-20a muchos genes, incluyendo
VEGFA
,
TGFBR2
,
CCND1
,
IL-8
,
MAPK14
,
PCAF
,
RUNX1
,
STAT3
, y
E2F1
[11] - [14], [23] - [26]. Muchos de estos genes juegan un papel importante en la proliferación celular regular, el ciclo celular, la apoptosis y la migración celular y la invasión. MiR-20a puede funcionar como un supresor de tumor o un onco-MIR, dependiendo del tipo específico de células y factores extracelulares [11] - [13]. En efecto, la sobreexpresión de miR-20a se ha observado para inhibir la proliferación celular, la invasión y la metástasis del tumor en líneas celulares de cáncer de mama [11], [12], lo que sugiere un papel supresor de tumores para miR-20a consistente con nuestros datos en líneas celulares de cáncer de tiroides y siendo upregulated en ATC (15, 16). En contraste, los estudios anteriores han demostrado que el miR-20a puede promover la proliferación en las células humanas del cáncer ovárico [27], y la migración y la invasión en las células de cáncer cervical humano, células de cáncer de ovario, y células de osteosarcoma [27] - [29], lo que sugiere que funciones de miR-20a como un onco-MIR
Takakura y colaboradores informaron que el cúmulo de miR-17-92 (miR-17-3p, -17-5p, -18a, -19a, -20,. - 19b, y -92-1) se sobreexpresa en líneas celulares de ATC [16]. El uso de RT-PCR cuantitativa, mostraron que el miR-17-3p y miR-17-5p se sobreexpresa en tres de las seis muestras de tejido ATC en comparación con muestras de tejido normal. Informaron que la transfección de los inhibidores de miR-17-5p suprimió el nivel de expresión del miR-17 familiares (miR-17-5p, miR-20a y miR-106a yb) en las células ARO, lo que resulta en la reducción del crecimiento de las células. Sin embargo, nuestro estudio de la función de miR-20a en el cáncer de tiroides era diferente que el estudio realizado por Takakura y colegas. En primer lugar, overexpressed específicamente miR-20a para entender su efecto sobre la biología de las células tumorales en ambas líneas celulares de cáncer de tiroides indiferenciado y diferenciado, y que no usamos inhibidores de varios miembros de la agrupación de miR-17-92 con posibles efectos puntuales objetivo, las cuales no sólo puede ser selectiva para miR-20a. En segundo lugar, nos dimos cuenta de que Takakura et al. Las células usadas tratados sólo con el reactivo de transfección como control negativo en lugar de utilizar oligonucleótidos revueltos, y hemos utilizado revueltos oligonucleótidos como el control negativo. Además, las líneas celulares que hemos utilizado (C643, TPC-1, FTC-133 y XTC-1) eran diferentes de las líneas celulares utilizadas (ARO adelante y atrás) por Takakura y colegas. Por último líneas, las líneas de células ARO utilizados en el estudio de Takakura y asociados pueden no han sido autenticados de células de cáncer de tiroides [18].
Se encontró que regula el miR-20a
LIMK1
expresión en la tiroides líneas celulares de cáncer.
LIMK1
está regulada por la vía de señalización Rho, y modula la dinámica de actina mediante la regulación de la actividad de las proteínas de la familia cofilina [30], [31]. Estudios anteriores han demostrado que
LIMK1
juega un papel central e importante en la invasión de células tumorales y la metástasis [19] - [22].
LIMK1
sobreexpresión aumenta la invasividad de las células de la mama y cáncer de próstata
in vitro
y
in vivo
, y derribando de
LIMK1
suprime mama y de próstata invasión de células cancerosas
in vitro
y
in vivo
[19] - [22], [32]. Con base en los resultados de nuestro expresión de genes en todo el genoma y el objetivo de predicción de análisis, nos preguntamos si la sobreexpresión de miR-20a afecta a
LIMK1
expresión en líneas celulares de cáncer de tiroides. De hecho, encontramos que
LIMK1
en todas las líneas celulares de cáncer de tiroides (C643, XTC-1, FTC-133, y TPC-1) se inhibió con la sobreexpresión de miR-20a, lo que sugiere que el efecto supresor del MIR -20Â sobre la proliferación celular y la invasión puede estar mediado por su efecto sobre la
LIMK1
. De hecho, la precipitación directa de
LIMK1
tuvo los mismos efectos sobre la invasión celular y la migración como se observa con la sobreexpresión de miR-20a.
Teniendo en cuenta el efecto supresor del tumor de miR-20a en células de cáncer de tiroides observamos
in vitro
y
in vivo
, es posible que la entrega exitosa de miR-20a podría resultar en la supresión tumoral /regresión, independientemente del tipo de células basales y el o los niveles de miR-20a [ ,,,0],33]. Los efectos supresores tumorales de miR-20a también podrían estar mediados por otros genes que
LIMK1
. Hemos validado
LIMK1
como un objetivo, ya que tenía la expresión más baja con la sobreexpresión de miR-20a, pero que se enumeran en la Tabla 1 muchos genes candidatos objetivo se alteraron con la sobreexpresión de miR-20a y por lo tanto también podría mediar sus efectos supresores tumorales.
para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para caracterizar el efecto de miR-20a en fenotipos celulares de cáncer de tiroides y para mostrar que el miR-20a regula
LIMK1
expresión. Nuestros hallazgos sugieren la expresión upregulated de miR-20a en el cáncer de tiroides anaplásico contrarresta la progresión del cáncer de tiroides y pueden tener un potencial terapéutico [34].
Apoyo a la Información sobre Table S1.
que complementa el cuadro
doi:. 10.1371 /journal.pone.0096103.s001 gratis (DOC)