Extracto
Tipo 1 deiodinase yodotironina (ESD1) cataliza la conversión de tiroxina prohormona a la activa de la hormona tiroidea 3,3 ', 5-triyodotironina (T3), importante regulador de la proliferación celular y la diferenciación. ESD1 expresión se reduce en el tipo más común de neoplasia de riñón, de células claras carcinoma de células renales (ccRCC). Los microARN son pequeños ARN no codificantes, que regulan la expresión génica a nivel postranscripcional. El objetivo de este estudio fue analizar la posible regulación de la expresión de microRNAs en ESD1 por ccRCC. El análisis bioinformático reveló que 3'UTR del ser humano
ESD1 Versión taquigráfica gen contiene el miR-224 y miR-383 sitios objetivo, que se conservan a través de las especies de mamíferos. En tiempo real Semi-PCR cuantitativa se utilizó para analizar la expresión de miR-224 y miR-383 en 32 muestras de tumores ccRCC (T) y en 32 coincide con el control de muestras (C). Hemos observado estadísticamente significativa (p = 0,0002) más de cuatro veces de incremento en la expresión de miR-224 y cerca de dos veces mayor en miR-383 expresión en T muestras en comparación con cambios específicos muestras C. tumorales en la expresión de miR-224 correlacionados negativamente con cambios en la expresión y la concentración ESD1 T3 intracelular. La transfección de células HeLa con línea de miR-224 y miR-383 suprime la actividad de un informador de luciferasa que contiene la UTR 3 'de
ESD1
. Este fue abolida cuando se utilizaron los constructos mutados en el miR-224 y miR-383 sitios objetivo en su lugar, lo que indica que el miR-224 y miR-383 se unen directamente a
ESD1
3'UTR. Por último, la expresión inducida de miR-224 en Caki-2 células resultó en significativa (p & lt; 0,01) la reducción de
ESD1
mRNA. Este estudio proporciona un nuevo mecanismo de regulación miARN mediada por
ESD1
expresión en ccRCC
Visto:. Boguslawska J, Wojcicka A, Piekiełko-Witkowska A, Master A, Nauman A (2011) MIR -224 Objetivos del 3'UTR del Tipo 1 5'-yodotironina deiodinasa posiblemente contribuyendo al tejido hipotiroidismo en el cáncer renal. PLoS ONE 6 (9): e24541. doi: 10.1371 /journal.pone.0024541
Editor: Marian Ludgate, la Universidad de Cardiff, Reino Unido
Recibido: 12 de mayo de 2011; Aceptado: August 12, 2011; Publicado: 2 Septiembre 2011
Derechos de Autor © 2011 Boguslawska et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El trabajo fue apoyado por el Comité polaco de Estado de Ayudas a la investigación científica (NN 401 071 939, NN 401 0386 37), y el Centro Médico de Postgrado subsidio de educación (501-2-1-24-06 /08) (AN). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Las hormonas tiroideas: 3,5,3-L-triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), juegan un papel importante en el crecimiento, el desarrollo, la diferenciación y la regulación de las vías metabólicas en las células. Humana tipo 1 deiodinasa yodotironina (ESD1), producto de la
ESD1
gen cataliza dos tipos de reacción deyodinación, un anillo exterior (5'-deyodinación - 5'd) y una junta interna (5-deyodinación - 5D). Estos procesos dan como resultado, respectivamente, en la activación e inactivación de las hormonas tiroideas (1). ESD1 es un selenoenzima expresado principalmente en el hígado, riñón, tiroides y pituitaria. Los informes anteriores han demostrado que la expresión de esta enzima se descompone en diferentes tipos de cáncer. Por ejemplo,
ESD1
ARNm y la actividad se redujo en carcinoma papilar de tiroides (2-5) y el aumento en el adenoma folicular y carcinoma folicular de tiroides (2). En trabajos previos hemos demostrado disminución de la expresión de
ESD1
ARNm y la actividad (6), y perturbado splicing alternativo de
ESD1
pre-mRNA en células claras carcinoma de células renales (ccRCC) (7).
ESD1
expresión también se ha propuesto como un marcador de diferenciación de las células cancerosas (8, 9).
ccRCC representa la histología del cáncer renal más común, representando el 75% de los tumores malignos primarios del riñón ( 10, 11). El tratamiento utilizado comúnmente es la resección quirúrgica mientras quimio y radioterapia siguen siendo ineficaces. Ninguno de los varios marcadores moleculares propuesto ha sido aprobado para uso clínico (10).
Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes, que controlan la expresión de genes por completo o parcialmente complementaria de unión al extremo 3 'no traducida región de ARNm diana (12, 13) que provoca la degradación del ARNm o, más comúnmente, la traducción de bloqueo (14-16). Estudios anteriores han demostrado que miRNAs juegan papeles importantes en procesos esenciales, tales como la diferenciación, proliferación y apoptosis (17, 18). Actualmente resultados emergentes revelaron que los miRNAs están involucrados en la patogénesis del cáncer. alteraciones frecuentes de los genes miARN expresión se han encontrado en una variedad de tumores malignos humanos, tales como la tiroides (19), pulmón (20), páncreas (21), colon (22), de mama (23), el hígado (24), próstata (25) u otros tumores sólidos (26, 27). Varios estudios han identificado los paneles de microARN que son expresados diferencialmente entre el tejido renal normal y tumoral o entre los subtipos histológicos de tumor renal (28-33). De perfiles de expresión de microARN ha mostrado diversas aplicaciones clínicas para el diagnóstico, pronóstico y fines de predicción (34, 35). función Varios miRNAs como oncogenes o supresores tumorales, y múltiples genes que codifican para miRNAs están situados en regiones genómicas implicadas en los cánceres (36) guía.
Nuestros resultados anteriores (6) han demostrado que la actividad ESD1 mal se correlaciona con el nivel de mRNA en los tejidos renales sanos. Esta observación sugiere la regulación postranscripcional significativa de
ESD1
expresión que podría estar mediada por miRNAs. Por tanto, el objetivo de este trabajo fue investigar el potencial de
ESD1
regulación por miRNAs y para determinar si la desregulación de ESD1 en ccRCC podría resultar de acciones alterados de miRNAs.
Resultados
predicción computacional de miRNAs unión a
ESD1
3'UTR
para identificar los genes miARN putativo de orientación de la 3'UTR de
ESD1
ARNm, que utiliza programas computacionales, TargetScan, PicTar, miRBase y Miranda. Los 1087 nucleótidos de 3'UTR de
ESD1
se realizo el complementariedad para sembrar secuencias de miRNAs conocidos. Sólo el miRNAs identificado por al menos dos de los cuatro enfoques bioinformáticos independientes se consideraron para su posterior análisis. Se identificaron 7 miRNAs potenciales dirigidos a la 3'UTR del ser humano
ESD1 gratis (Tabla 1): miR-224, miR-383, miR-610, miR-659, miR-637, miR-1202 y miR 1266.
miR-224 y miR-383 se sobreexpresan en ccRCC
en estudios preliminares, el uso de semi-cuantitativa en tiempo real PCR (SQ-PCR), se determinó la expresión relativa de 7 candidato miRNAs en ccRCC y muestras de control de los partidos pareadas de 32 pacientes utilizando cebador universal UniAmpHindIII (37) con homología de secuencia con voladizos de cebadores utilizados en la transcripción inversa y miRNA-específicas primers (secuencias se muestran en los datos suplementarios, en la Tabla S2). Hemos observado que difieren expresión de miR-224 y miR-383, mientras que la expresión de los otros cinco miRNAs candidatos: miR-610, miR-637, miR-659, miR-1202 y el miR-1266 no difirieron significativamente entre ccRCC y tejido de control (Figura S1, datos suplementarios).
inducida por la expresión de miR-224 y miR-383 en ccRCC se confirmó en un ensayo TaqMan microRNA específico. Estos estudios revelaron estadísticamente significativa (p = 0,0002) más de cuatro veces de incremento en la expresión de miR-224 y cerca de dos veces mayor (p = 0,0236) en la expresión de miR-383, en las muestras de T en comparación con muestras de control C (figura 1 ). La media veces el cambio de miR-224 y miR-383 se analizó en diferentes granulometrías tumorales, pero no dependía del grado de diferenciación del tumor muestra. Sin embargo, la media veces el cambio de miR-224 tendía a disminuir cuando los grados de diferenciación aumentaron de G1 a G3 (Figura 1).
A. El aumento de expresión de miR-224 en muestras de tumores ccRCC (T) en comparación con muestras de control (C). La expresión se muestra como porcentaje de control de C. B. media veces el T: C cambio de la expresión de miR-224 224 en las muestras divididas de acuerdo a los grados de diferenciación tumoral (G1, G2, G3). C. El aumento de expresión de miR-383 en muestras de tumores ccRCC (t) en comparación con muestras de control (C). La expresión se muestra como porcentaje de control de C. D. media veces el T: C cambio de la expresión de miR-383 224 en las muestras divididas de acuerdo a los grados de diferenciación tumoral (G1, G2, G3). Los datos se dan como media ± SEM n = 32 para T, n = 32 para C (en A y C), n = 11 para G1, n = 11 para G2, n = 10 para G3 (en B y D). El análisis estadístico se realizó mediante el emparejado
t-test
para comparar muestras de C y T (en A y C) o ANOVA para comparar G1, G2, G3 y las muestras (en B y D) * p & lt; 0,05, * ** p & lt;.. 0.001
por lo tanto, la expresión alterada de miR-224 y miR-383 en ccRCC fue confirmada por dos enfoques analíticos diferentes
miR-224 se correlaciona negativamente con ESD1 y los niveles de T3 en ccRCC
análisis SQ-PCR revelaron 2,7 veces regulación a la baja de
ESD1
mRNA en 32 emparejado muestras de tejido tumoral y de control (p = 0,0009), lo cual es consistente con nuestros informes anteriores ( 6) (Figura 2). Como se muestra en la Figura 2, se observó una correlación negativa estadísticamente significativa entre miR-224 y
cambios específicos de tumores ESD1
de mRNA de expresión (Spearman r
s = -0,556 a p = 0,001). Por el contrario, no se observó correlación de miR-383 y
ESD1
. Por otra parte, el análisis de Western-blot realizado en once muestras pareadas de ccRCC y el tejido renal normal la pérdida de proteínas ESD1 (Figura 2B) reveló.
A. La expresión de
ESD1
ARNm en muestras de tejido. n = 32 para T y n = 32 para C. Se muestra la expresión como porcentaje de control de C. El gráfico muestra los valores de la mediana con IC del 95% ya que los datos no se distribuyen normalmente. El análisis estadístico se realizó utilizando Wilcoxon emparejado prueba para comparar las muestras C y T. *** P & lt; 0,001. B. Western-blot de ESD1 realizó en muestras de control-ccRCC pareados. expresión de ß-actina se utilizó como control interno. se muestran muestras de cuatro de control representativo (C) y el tumor (T). parcelas C y D. dispersión de la T: C ratios de
DIØ1
ARNm
frente
T: C miR-224 (C) y T: C miR-383 (D) las relaciones de expresión. El análisis de correlación de rangos no paramétrica de Spearman se llevó a cabo en los datos de 32 pares de muestras de control y de tejido tumoral. p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativo. E y F. dispersión gráficas de concentración de T3 T: Relación C frente a T: C miR-224 (E) y los coeficientes de expresión de miR-383 (F). análisis de correlación de Pearson se realizó en datos de 11 pares de muestras de control y de tejido tumoral. p & lt; 0,05 se consideró estadísticamente significativa
ESD1 es un regulador de la biodisponibilidad de la hormona tiroidea.. En nuestro estudio reciente se encontró que la concentración de T3 se redujo en comparación con los tumores ccRCC pares emparejados controles. Para comprobar si la regulación negativa mediada por el miR-224 de ESD1 afecta ESD1 producto de la actividad, T3, se analizó la correlación entre los cambios específicos de tumores de los niveles de miR-224 y T3. los niveles de T3 se analizaron en 11 muestras ccRCC y control de par de concordancia que se utilizaron para el análisis ESD1 Western-blot. concentración T3 se evaluó como se ha descrito previamente (37). Encontramos una diferencia estadísticamente significativa (Pearson r = -0,624, p = 0,04) correlación negativa entre T: C ratios de miR-224 y T3 intratumoral (Fig. 2). miR-383 hicieron cambios ni se correlacionan con T3.
La disminución de las concentraciones de T3 intratumorales pueden resultar no sólo de disminución de la expresión de ESD1 sino también de una mayor actividad de tipo 3 deiodinasa (ESD3), que es una hormona tiroidea inactivación de la enzima. El uso de Q-PCR, analizamos la expresión de mRNA ESD3 en 11 muestras ccRCC y control de par de concordancia. ESD3 mRNA fue indetectable en todas las muestras analizadas (resultados no mostrados). Por lo tanto, se confirmó que la disminución de las concentraciones de T3 intratumorales son el resultado de la expresión ESD1 rebajado.
La transfección con el miR-224 disminuye la expresión endógena de
ESD1
Para determinar el efecto funcional del MIR -224 y miR-383 en la endógena de
ESD1
ARNm, Caki-2 células fueron transfectadas con pre-miR-224, pre-miR-383 (microRNA precursores), anti-miR-224, miR-contra 383 (inhibidores de microARN), o revueltos de control. La transfección exitosa se confirmó en el análisis de PCR SQ por un gran inducción de miR-224 y miR-383 después de transfección con microRNA precursores y disminución significativa de la expresión de miRNAs cuando los inhibidores se utilizaron (Figura 3).
A. La expresión de
ESD1
ARNm en la línea celular Caki-2. Las células fueron transfectadas con 37,5 pmoles de pre-miRs, anti-miRs o revueltos pre-MIR (control negativo); después de 48 h se extrajo el ARN total para su posterior análisis SQ-PCR de
ESD1
nivel. La expresión se muestra como porcentaje de control (células transfectadas con microRNA codificados). Los datos se presentan como media ± SEM. Los datos se analizaron por ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. ** P & lt; 0,01. B y C. El nivel de miR-224 (B) y miR-383 (C) en las células transfectadas con pre-MIR o anti-MIR. Los datos se presentan como porcentaje de control (células transfectadas con microRNA codificados). Los datos se presentan como media ± SEM Valores de miRNAs se normalizaron al gen U6. Los datos se analizaron por ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. *** P & lt;. 0.001
niveles de mRNA de
ESD1
se mide por SQ-PCR y una reducción significativa (56%, p & lt; 0,01) del
ESD1 se observó
nivel de transcripción después de la introducción de la pre-miR-224. pre-miR-383 no tiene este efecto (Figura 3). La transfección de Caki-2 células con anti-miR-224 dio lugar a aumento de
ESD1
expresión, por 45%, p & lt; 0,01, en comparación con un control revuelto. No se observó esta sobreexpresión cuando las células fueron transfectadas con anti-miR-383 (Figura 3).
Estos datos muestran que endógena de
ESD1
la expresión del ARNm en células Caki-2 es modulada por el MIR -224.
El 3'UTR de
ESD1
es un objetivo directo de miR-224 y miR-383
análisis computacional de
ESD1 página 3 'UTR con TargetScan5.1 reveló dos supuestos sitios de unión para el miR-224 y miR-383, que se encuentra en los nucleótidos 1788-1794 y 898-904 de
ESD1 Versión taquigráfica (NM_00792.5), respectivamente (figura S2 en datos suplementarios). Estos dos sitios se conservan a través de las especies de mamíferos. Para estudiar la interacción directa entre el miR-224, miR-383 y
ESD1 Versión taquigráfica hemos clonado el 3'UTR de
ESD1
abajo del gen indicador de luciferasa en el vector pGL3-Control - (DIO1-3'UTR). plásmido de control, en el que ESD1 3 'UTR se insertó en una orientación inversa (ESD1-rev3'UTR) también se construyó. Al mismo tiempo, hemos creado dos reportero construye adicional en el que las regiones conservadas de orientación fueron mutados específicamente, para abolir la unión de miRNAs (Figura 4). línea celular HeLa, exhibiendo una baja expresión endógena de
ESD1
fue utilizado para experimentos de transfección. Las células fueron co-transfectadas con las construcciones y los precursores de microRNAs obtenidos: pre-miR-224, pre-miR-383 o el control (codificado miARN). En células HeLa transfectadas transitoriamente con el
ESD1
-3'UTR constructo y precursores miARN, se observó una inhibición significativa de la actividad luciferasa. Tanto miR-224 y miR-383 causaron disminución en la actividad de luciferasa en aproximadamente un 45% y 25%, respectivamente, en comparación con el control revueltos miRNA. Ambos pre-miRNAs dejaron de ejercer un efecto significativo en
ESD1
-rev3'UTR y el vector vacío pGL3-Control (Figura 4).
A.
ESD1
3'UTR clonado aguas abajo de la luciferasa en el vector pGL3-Control. El tipo salvaje y mutado 3'UTR de
ESD1
con la región de la semilla (negrita) y las sustituciones de bases (tipo de letra grande y subrayado) la abolición de la unión de un particular, miARN (verificado
in silico
) se presentan a continuación. Se construyeron dos tipos de mutantes 3'UTR:
ESD1
-3'UTR224mut y
ESD1
-3'UTR383mut. B. Dual ensayo de luciferasa. La actividad de luciferasa relativa de construcciones con el 3'UTR de
ESD1
:
ESD1
-3'UTR,
ESD1
-rev3'UTR,
ESD1
-3'UTR224mut,
ESD1
-3'UTR383mut y pGL3-control en presencia de pre-miARN o revueltos pre-miARN (control negativo). Los datos se expresan como valores medios ± SEM y se muestran como porcentaje de control (células transfectadas con microRNA codificados). Cada barra representa los valores de tres experimentos independientes, medidos por triplicado. La actividad relativa de la expresión de luciferasa de la luciérnaga se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. Los datos se analizaron por ANOVA seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. . ** P & lt; 0,01
La actividad de la luciferasa del reportero construye:
ESD1
-3'UTR224mut y
ESD1
-3'UTR383mut, en la que se dirigen a sitios reconocidos por los microARN fueron mutados, no se vio afectada por transfección con pre-miR-224 o pre-miR-383, respectivamente (Figura 4). Esta observación confirma la especificidad de acción de ambos microRNAs como la mutación en el sitio de reconocimiento debe impedir que miARN unión a 3'UTR. Lo que es más importante, la mutación en el sitio de reconocimiento de un microARN no influyó en la unión de la otra miARN analizados. La actividad de la luciferasa en células transfectadas con
ESD1
-3'UTR383mut se inhibió en un 40% después de la pre-miR-224 Además, mientras que la transfección con
ESD1
-3'UTR224mut y pre-miR 383 resultó en disminución ~ 23% en la actividad de la luciferasa (Figura 4).
en conjunto, estos datos muestran que el 3'UTR de
ESD1
contiene sitios de unión específicos para los microARN miR-224 y miR-383.
Discusión
En este estudio hemos demostrado por primera vez que el tipo 1 yodotironina deiodinasa transcripción es un objetivo funcional directa de microARN miR-224. La unión de miR-224 a
ESD1
resultados 3'UTR de regulación a la baja de la endógena de
ESD1
expresión en las células de cáncer renal. Por otra parte,
ESD1
3'UTR contiene sitios de unión conservadas específicas para el miR-224 y miR-383, como se muestra en los ensayos de reportero de luciferasa. Ambos microRNAs se sobreexpresa notablemente en el cáncer renal de células claras y posiblemente representan la pérdida de
ESD1
expresión en el tumor. Esto ha sido apoyado por la correlación negativa entre los cambios específicos de tumores en el miR-224 y
ESD1
los niveles de ARNm y la pérdida de proteínas en muestras ESD1 ccRCC. Por otra parte, los cambios específicos de tumores en la concentración del producto de la actividad ESD1, T3, se correlacionan negativamente con los cambios de expresión de miR-224. Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de un nuevo mecanismo de
ESD1
regulación.
Los mecanismos que regulan
ESD1
expresión, son poco conocidos. En nuestros estudios anteriores se observó falta de correlación entre la proteína ESD1 y el nivel de ARNm en ccRCC (6), que sugirió la posible implicación de mecanismos posttranscriptional, como la regulación microRNA-dependiente. En el presente estudio se observó reducción de casi 3 veces mayor de
ESD1
la expresión del ARNm mientras que la proteína ESD1 se perdió en las muestras tumorales. Una observación interesante realizado en el presente estudio es que la expresión de miR-224 tiende a cambiar con los grados de diferenciación del tumor y es mayor en G1 y G3 más bajo en (Fig. 2). Aunque estos cambios entre los respectivos grados de diferenciación del tumor no son estadísticamente significativas que pueden posiblemente sugieren que como tumor progresa el impacto de miR-224 en
ESD1
expresión disminuye y tal vez están implicados otros mecanismos posttranscriptional. Como hemos demostrado previamente, otro mecanismo que contribuye a la alteración de la expresión ESD1 en ccRCC es su corte y empalme alternativo perturbada resultante posiblemente de cambios en la expresión de factores de empalme (7, 38). En los experimentos realizados en Caki-2 células, miR-383 no afectó la expresión de ESD1 endógeno. Esto puede sugerir que el miR-383 actúa sobre un nivel postranscripcional, causando la obstrucción de traducción en lugar de la degradación de los
ESD1
ARNm. La segunda posibilidad es que los otros factores (incluyendo el miR-224) pueden ejercer un efecto más fuerte sobre la expresión ESD1 en ccRCC. Esta idea está apoyada por los resultados de los experimentos luciferease en que indujo miR-383 expresión dio lugar a sólo el 25% de reducción de la actividad de luciferasa en comparación con el efecto de miR-224 que causó 45% regulación a la baja de la expresión. luciferasa experimentos confirman la hipótesis de que la unión de miR-383 a
ESD1
resultados 3'UTR en el bloqueo de la traducción, como la actividad luciferasa es una consecuencia directa de los niveles reales de proteína luciferasa.
Dado que la expresión alterada de miR-224 y miR-383 se observó en los tumores de tejidos que expresan tipo 1 yodotironina deiodinasa que sugiere que estos tumores también pueden presentar la expresión alterada de
ESD1
. De hecho, en los cánceres de tiroides papilar, la expresión de miR-224 fue significativamente elevado (39), mientras que nuestros estudios revelaron que en este tipo de cáncer, la expresión de
ESD1
se reduce (3). Por el contrario, en el cáncer de mama, el miR-383 se pierde (40), mientras que
ESD1
expresión aumenta de forma significativa (41). Si la expresión alterada de
ESD1
verdaderamente resulta de alterados miR-224 y miR-383 niveles en estos tipos de cáncer debe ser evaluado por estudios independientes.
La importancia de nuestros hallazgos proviene del papel de ESD1 en la fisiología celular. ESD1 es una biodisponibilidad enzima regulación de las hormonas tiroideas. Recientemente, se sugirió que ESD1 no contribuye a los niveles circulantes de T3, sino que actúa como una enzima implicada en scavenger reciclaje yoduro (42). Sin embargo, la posibilidad de que ESD1 contribuye a T3 sintetizada localmente en tejidos que expresan DIØ1 no puede descartarse, ya que estaba previamente sugirió (43, 37). Por lo tanto, los microRNAs que regulan la expresión ESD1 en ccRCC pueden tener la influencia potencial sobre los niveles de hormona tiroidea intratumoral. De hecho, como se demuestra en el presente estudio, los cambios específicos de tumores en la concentración intracelular T3 se correlacionan con cambios en la expresión de miR-224. Curiosamente, en nuestro estudio reciente, se encontró que la transcripción de la hormona tiroidea gen de la beta receptor (
THRB
) es también un objetivo para la regulación microRNA-dependiente (37). miR-204 se sobreexpresa en ccRCC y da como resultado la regulación por disminución concomitante de
THRB
expresión. Estos resultados, junto con los resultados del presente estudio sugieren que los microARNs pueden posiblemente contribuir al hipotiroidismo tejido en ccRCC que resulta en regulación a la baja de los principales genes de la hormona tiroidea vía,
THRB
y
ESD1
y, en consecuencia, , que conduce a la la disminución de los niveles de T3 intratumorales. Esta es una observación importante, ya que varios estudios demostraron que THRB puede actuar como un supresor de tumores y que el hipotiroidismo puede influir en el crecimiento del tumor (44-48). Así, la regulación micro ARN dependiente del estado tiroideo intracelular, posiblemente, puede tener el potencial de afectar a los procesos neoplásicos. Curiosamente, este puede ser un fenómeno más general en los tumores con expresión alterada de
ESD1
y
THRB
. En nuestros estudios recientes varios microARN que se upregulated en tumores papilares de tiroides (PTC), se mostró a dirigirse directamente a la transcripción THRB dando como resultado la regulación por disminución significativa de su expresión (49). Sería de interés para comprobar si la expresión de microRNAs de orientación
ESD1
también se altera en los tumores de PTC. Nuestros estudios previos demostraron que la pérdida de expresión ESD1 en PTC está acompañada por la falta de correlación entre el mRNA y expresión de la proteína (3). Esto sugiere una posible regulación postranscripcional incluyendo la participación de microARN. Sin embargo, si deteriorada
ESD1
expresión en los resultados de PTC de la desregulación microRNA mediada necesita ser verificada por otros estudios.
Disturbed expresión de microARN en ccRCC ya ha sido reportado en otros estudios. Curiosamente, entre los microARN diferente expresadas en muestras tumorales de control y miR-224 se ha encontrado en varias ocasiones por los estudios independientes (30, 33, 50). Esto sugiere el posible uso de miR-224 como marcador para diferenciar tumores ccRCC de los tejidos sanos. En cuanto a miR-383, se informó como downregulated en el carcinoma hepatocelular (51), de mama y de ovario, melanoma (40), la leucemia mieloide aguda (52) y los tumores del sistema nervioso central (53). Por lo tanto, nuestro trabajo es el primero que muestra la regulación positiva de miR-383 en el cáncer. Si esto es una característica específica de la neoplasia renal aún no se ha verificado por experimentos futuros. Ambos microARN, miR-224 y miR-383 se cree que están implicadas en el control de la proliferación o apoptosis. miR-224 ha demostrado aumentar la muerte celular por apoptosis y la proliferación en el carcinoma hepatocelular (54) mientras que la sobreexpresión de miR-383 inhibe la proliferación de células de carcinoma embrionario de testículo (55). La cuestión de si el miR-224 y miR-383 están involucrados en la proliferación ccRCC aguarda futuros estudios
En resumen, hemos demostrado que
ESD1
3'UTR está dirigido por dos microARN:. MiR-224 y miR-383. miR-224 media la pérdida de ESD1 en el cáncer renal, lo que se traduce en disminución de la concentración de T3 intratumoral. Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de un nuevo mecanismo de regulación de la expresión de tipo 1 yodotironina deiodinasa. En informes anteriores revelaron que la expresión alterada de THRB, otro gen de la vía de la hormona tiroidea, observado en ccRCC, también puede deberse a la desregulación microRNA-dependiente. En conjunto, estos resultados sugieren que la nueva clase de pequeños ARNs no codificantes, puede contribuir a que el hipotiroidismo intracelular en ccRCC.
Materiales y Métodos
Muestras de tejidos y líneas celulares
las muestras de tejido se obtuvieron con la autorización del Comité de Bioética del Centro Médico de la Educación de Postgrado en Varsovia del pacientes con carcinoma de células renales de células claras (32 pacientes). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes que participan en este estudio. Las muestras se dividieron en dos grupos: las muestras de tumor (n = 32, T) y muestras de control (tejido normal emparejado desde el polo opuesto de la malignos de riñón sin evidencia histológica de tumor; n = 32, C). Claro celular de carcinoma de células renales fue diagnosticado histológicamente según criterios de la OMS (56). Los tumores se dividen en tres grupos en función del grado de diferenciación:. G1 (bien diferenciadas), G2 (grado intermedio de diferenciación), G3 (pobremente diferenciadas cánceres)
células renales Cáncer de cuello uterino (HeLa) y de células claras líneas celulares de cáncer (Caki-2) utilizados en este estudio fueron adquiridos de la American Type Culture Collection, (EE.UU.) y se cultivaron de acuerdo con el protocolo de ATCC. Las células se sembraron en placas de cultivo de 12 pocillos a la densidad de 5 × 10
4 (Caki-2) o 1 × 10
5 células (HeLa) /pocillo 24 h antes de la transfección.
informador de luciferasa construcciones
1023 pb fragmento de
ESD1
fue amplificado utilizando ADNc de la línea celular HeLa (cebadores
ESD1
-3'UTR F y R, el cuadro S1, los datos suplementarios), XbaI se clonó en el sitio inmediatamente aguas abajo del codón de parada en el vector reportero pGL3-control de la luciferasa de luciérnaga (Promega, EE.UU.), secuenciado y llamado
ESD1
-3'UTR, o
ESD1 CD - rev3'UTR, dependiendo de la orientación del inserto clonado. La inversa insertada
ESD1
-rev3'UTR se utilizó como vector de control negativo. La mutagénesis dirigida de los sitios diana de miR-224 y miR-383: GTGACTT de miR-224 en nt 1788-1794 y TCTGATCT de miR-383 en nt 898 a 904 en el ESD1
3'UTR fue realizado utilizando el kit de mutagénesis Quick-cambio (Stratagene, Alemania). Primers Mut224 F /R y Mut383 F /R (Tabla S1, datos suplementarios) y
ESD1
se utilizaron plásmido -3'UTR como plantilla. Dos construcciones:.
ESD1
-3'UTR224mut y
se obtuvieron ESD1
-3'UTR383mut
reacción de secuenciación se realizó utilizando BigDye Terminator v3.1 Ciclo de Secuenciación Kit (Applied Biosystems, EE.UU.).
Las células transfección y luciferasa ensayo
Caki-2 células se sembraron a 0,5 x 10
5 células por placa de 12 pocillos y se transfectaron 24 horas más tarde usando Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, EE.UU.) como se describe por el fabricante, con 37,5 pmoles de miARN precursores: pre-miR-224 y pre-miR-383 (pre-mir
™ miARN molécula precursora, Ambion, EE.UU.), inhibidores de miRNAs anti -miR-224 y anti-miR-383 (anti-mir ™ miARN inhibidor de molécula, Ambion, EE.UU.) o el control revueltos microARN (control negativo microARN, Ambion, EE.UU.). Las células se recogieron después de 48 h para la extracción de RNA.
miARN precursores son dúplex de ARN sintéticos que imitan miRNAs endógenos, mientras que los inhibidores tienen una secuencia complementaria a madurar miRNAs y la función de secuestrante /degradar miRNAs endógenos.
Para los ensayos de gen reportero, las células HeLa fueron sembradas a 1 × 10
5 en placas de 12 pocillos y 24 horas más tarde, cotransfectaron con el reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EE.UU.). Cada reacción de co-transfección contenía 100 ng del vector PRL-TK (Promega, EE.UU.) que expresa luciferasa de Renilla, 1 ug PGL-3 'UTR vectores y 37,5 pmoles de pre-MIR o revueltos microARN. Después de 48 horas, las células se lisaron y la actividad de la luciferasa se analizó en el ensayo de luciferasa dual (Promega, EE.UU.), utilizando un luminómetro Synergy2 (BioTek, EE.UU.). Firefly luciferase actividad se normalizó a la actividad de luciferasa de Renilla. En todos los experimentos, ensayos de transfección y luciferasa se realizaron por triplicado.
aislamiento de ARN y el ARN celular total se aisló como se describió previamente transcripción inversa
(37). La transcripción inversa se realizó usando RevertAidTM H Minus la primera cadena de cDNA de síntesis Kit (Fermentas, Lituania). Para la transcripción reversa, 200 ng de ARN total fue utilizado con cebadores al azar hexamer o cebadores específicos de tallo-bucle con 5'-domina (Tabla S2, datos suplementarios) para microRNAs.
ADNc de miR-224 y miR 383 también se sintetizó con cebadores específicos de genes miARN de la TaqMan ensayos microARN (Applied Biosystems, EE.UU.) y los reactivos del kit TaqMan MicroARN transcripción reversa (Applied Biosystems, EE.UU.).
SQ-PCR
ESD1
análisis de la expresión en células Caki-2 se realizó utilizando ADN SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Alemania) por triplicado de acuerdo con los protocolos del fabricante. reacción SQ-PCR se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones: 95 ° C durante 10 min, 45 ciclos:. 95 ° C, 15 s; 57 ° C, 15 s; 72 ° C, 15 s, 68 ° C, 15 s; seguido por análisis de la curva de fusión: 95 ° C, 5 min .; 65 ° C, 1 min .; lectura continua de la fluorescencia de 65 ° C a 97 ° C con 0,11 ° C /s velocidad de rampa y 5 adquisiciones por cada ° C. Los resultados se normalizaron a la expresión del gen 18sRNA huésped-
RN18S1
.
ESD1
y
se realizó ESD3
análisis de expresión en muestras de tejido como se ha descrito previamente (37). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla S1, (datos suplementarios). UN). SEGUNDO).