Resumen
Antecedentes
microRNAs (miRNAs) son pequeños ARN no codificantes que regulan ARNm afines en la etapa de post-transcripcional. Varios estudios han demostrado que los miRNAs modulan la expresión génica en células de mamífero mediante apareamiento de bases complementarias a los sitios de la región 3 'no traducida (3'-UTR) de los ARNm diana.
Metodología /Principales conclusiones
en el presente estudio, miR-24 se encontró para apuntar fas asociados factor de 1 (FAF1) por la unión a su secuencia de aminoácidos región (CDS) de codificación, con lo que la regulación de la apoptosis en células DU-145. Este resultado apoya un modelo aumentada mediante el cual los animales miRNAs pueden ejercer sus efectos mediante la unión a la región CDS del ARNm diana. La transfección de miR-24 oligonucleótido antisentido (miR-24-ASO) la apoptosis inducida también en HGC-27, las células MGC-803 y HeLa.
Conclusiones /Importancia
Hemos encontrado que el miR-24 regula la apoptosis por la orientación FAF1 en células de cáncer. Estos hallazgos sugieren que miR-24 podría ser una diana terapéutica eficaz para el tratamiento de cáncer de próstata insensible a hormonas u otros tipos de cánceres. El trabajo futuro puede desarrollar aún más el miR-24 para aplicaciones terapéuticas en la biología del cáncer
Visto:. Qin W, Y Shi, Zhao B, C Yao, Jin L, Ma J, et al. (2010) miR-24 regula la apoptosis mediante la orientación de la fase de lectura abierta (ORF) Región de FAF1 en las células cancerosas. PLoS ONE 5 (2): e9429. doi: 10.1371 /journal.pone.0009429
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 19 Enero, 2010; Aceptado: February 4, 2010; Publicado: 25 Febrero 2010
Derechos de Autor © 2010 Qin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional clave básica de Investigación y Desarrollo (2005CB724602) y Programas de la Academia china de Ciencias (KSCX-2-SW-228 y KSCX1-YW-R-64). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microRNAs (miRNAs) son endógenas, conservado evolutivamente pequeña (aproximadamente 22 nt) ARNs no codificantes que se han demostrado para regular la expresión génica post-transcripcional [1], [2]. miRNAs normalmente regulan la expresión de sus genes diana mediante la degradación de transcritos de ARNm diana o la inhibición de la traducción del mRNA [3], [4]. miRNAs se han implicado en diversos procesos biológicos, incluyendo el calendario de desarrollo, los patrones y la embriogénesis, la diferenciación y la organogénesis, la respuesta inmune, el control del crecimiento y la apoptosis. Sin embargo, los genes diana y funciones de la mayoría de miRNAs aún no están claros [5] - [9].
Estudios anteriores han demostrado que miRNAs modular la expresión génica en células de mamífero por apareamiento de bases a los sitios complementarios en el 3'- región no traducida (3'-UTR) de sus mRNAs diana [4], [10], [11]. Más recientemente, se ha demostrado que miRNAs pueden regular ARNm diana mediante la unión a los aminoácidos de codificación de secuencia (CDS) [12] - [14]
La apoptosis es una forma de muerte celular programada (PCD) que. se produce en los organismos multicelulares. Ciertos tipos de daños desencadenar una serie de eventos bioquímicos, que conduce a una morfología celular característica y la muerte [15], [16]. Se trata de un mecanismo celular bien orquestada que equilibra los efectos de la proliferación celular y la muerte celular [17]. Parece claro que la estricta regulación de la función apoptótica través de miRNAs es crítica en otros procesos celulares y de desarrollo. Varios miRNAs que regulan la apoptosis han sido identificados, aunque ninguno de ellos regulan la apoptosis mediante la unión de la región CDS de sus objetivos [17] - [22]. Recientemente, se ha demostrado que miRNAs pueden actuar como oncogenes y supresores de tumor por la orientación reguladores clave de crecimiento celular [23] - [25].
una nueva clase de oligonucleótidos modificados químicamente, denominado 'antagomirs', puede efectivamente silenciar miRNAs endógenos y se han utilizado para suprimir la expresión aberrante de onco-miRNAs [26], [27]. Esto demuestra una potencial aplicación terapéutica para el silenciamiento efectiva de onco-miRNAs en el tratamiento de algunos tipos de cáncer [9].
Factor de
Fas asociado-1 (FAF1) es un componente de la muerte de inducción de complejo de señalización ( DISC) e interactúa con la caspasa-8 y FADD aunque carece de los "motivos de muerte" típicas de las proteínas de la apoptosis [28]. Varios estudios recientes mostraron que la sobre expresión de FAF1 estimuló la apoptosis en células Jurkat, células L y células BOSC23 pesar de la ausencia de cualquier señal extrínseca muerte [28] - [30]. FAF1 se ha demostrado que desempeñan un papel importante en el desarrollo normal y la supervivencia de las células neuronales, mientras que FAF1 regulación a la baja puede contribuir a varios aspectos de la tumorigénesis [31]. El uso de pequeños ARN de interferencia (siRNA) para apuntar FAF1, se observó que la baja regulación de FAF1 aumentó la susceptibilidad a la apoptosis desencadenada por CP [32].
Hasta el momento, no se sabe si está regulado por FAF1 miRNAs. Hasta donde sabemos, ningún estudio ha investigado cómo los miRNAs que se dirigen a la región CDS del gen diana contribuyen a la apoptosis tumoral. En este estudio, mostramos que el miR-24 puede regular la expresión humana FAF1 (hFAF1) a través de la unión a la región CDS de hFAF1 ARNm. Por otra parte, se demuestra que el miR-24 regula la apoptosis y la proliferación de DU-145, HGC-27, MGC-803 y las células HeLa por la orientación del gen FAF1. Estos hallazgos sugieren que el miR-24 podría ser una potencial diana terapéutica génica para el tratamiento de cáncer de próstata insensible a hormonas y otros tipos de cánceres.
Resultados
miR-24 mediada por ASO de Down -Reglamento de miR-24 induce la apoptosis y afecta a la proliferación de las células DU-145
Para explorar el efecto funcional de miR-24 en la supervivencia celular, se midió la apoptosis en células DU-145 transfectadas con el miR-24-ASO . Down-regulación de miR-24 por miR-24-ASO aumento de la apoptosis en las células DU-145, tal como se mide por análisis FACS de las células de yoduro de propidio y tinción con anexina V (Fig. 1A). La estaurosporina se utilizó para inducir la apoptosis a las 48 horas después de miR-24-ASO transfección. La apoptosis era mucho mayor en las células DU-145 transfectadas con miR-24-ASO que en las células transfectadas con control negativo NC-ASO (Fig. 1B). A continuación, el efecto de miR-24 en la proliferación de las células DU-145 se exploró con un kit de recuento CCK8. Como se predijo, la proliferación de las células DU-145 se redujo en gran medida después de miR-24 se redujo reguladas por el miR-24-ASO, posiblemente debido a la apoptosis inducida por el miR-24-ASO (Fig. 1C). La expresión de la caspasa-8 también se elevó en células transfectadas con miR-24-ASO, mientras que la caspasa-8 fue ligeramente protegida de la activación en las células que sobreexpresan miR-24 (Fig. 1D). Estos datos sugieren que el miR-24 baja regulación en células DU-145 puede inducir la apoptosis, posiblemente a través de la vía caspasa-8.
DU-145 células (A) fueron tratados con 20 nM de miR-24-ASO o NC-ASO para 48 h. La apoptosis se midió por FACS con Anexina V y la tinción de yoduro de propidio (n = 3 ± SE; *
p
& lt; 0,01). El descenso de regulación de la apoptosis inducida por el miR-24 en células DU-145. (B) La apoptosis fue inducida por 2 h con estaurosporina 1 M, 48 h después de la transfección 20 nM miR-24-ASO o NC-ASO (n = 3 ± SE; *
p
& lt; 0,01). sensibilidad a la apoptosis se incrementó significativamente después de la transfección con el miR-24-ASO. (C) La proliferación celular se midió por CCK-8 kit en los puntos de tiempo indicados después de la transfección con 20 nM miR-24-ASO o NC-ASO (n = 3 ± SE). El descenso de regulación de miR-24 afectado a la proliferación de las células DU-145. activación (D) de la caspasa-8 se detectó por análisis de transferencia de Western de procaspasa 8 y la forma madura de la caspasa-8 después de 24 h de tratamiento (como arriba). Caspasa-8 se activa después de la transfección con el miR-24-ASO.
miR-24 Regula el FAF1 génica mediante la unión a la Región de ORF FAF1
El uso de los métodos descritos por Karginov y et al [33] con algunas modificaciones, se encontró que FAF1 es un objetivo putativo de miR-24. Análisis con software RNA22 (IBM) indicó que no hay sitio de unión miARN en la región 3'UTR del gen FAF1, pero dos miR-24 sitios de unión putativos se encontraron dentro de la región de marco de lectura abierto (ORF) de FAF1 (Fig. 2A). Por otra parte, se encontró que las secuencias diana de miR-24, especialmente la 'región de la semilla', en la región ORF de FAF1 ser altamente conservadas entre las ocho especies (Fig. 2B). Se utilizó
(A) de software RNA22 para predecir que la región CDS de FAF1 ARNm alberga dos sitios de unión putativos de miR-24. se muestra la secuencia de miR-24, sus sitios de unión, y las energías. (B) Los sitios de unión predichos de FAF1 se conserva en ocho especies diferentes. También se muestran las bases alteradas en las construcciones FAF1 mutantes. Rojas: pareadas bases; verde: G: U par; bases de mutantes: azul. células 293T (C) se transfectaron con un vector indicador que consiste en un gen de luciferasa que contiene el tipo salvaje o mutadas sitios de unión de miR-24) en su región 3 'UTR (FAF1 /pGL3 o FAF1-M12 /pGL3, 20 ng /pocillo en cada placa de 24 pocillos). Las células también fueron transfectadas con un vector de luciferasa CMV-Renilla (20 ng /pocillo en cada placa de 24 pocillos) como un estándar interno. La expresión de la luciferasa que contiene predijo miR-24 secuencias de unión se redujo mediante el tratamiento con 20 nM de miR-24-mímica en comparación con el tratamiento con NC-mímica, mientras que la luciferasa que contiene secuencias mutadas no podía ser regulada hacia abajo (n = 3 ± SE; *
p Hotel & lt; 0,01). (D) de miR-24 regula el gen FAF1. células 293T se trataron como se indica y se transfectaron con 100 ng pcDNA3.1-FAF1. La expresión de FAF1 se había reducido regulado después de la transfección con 20 nM de miR-24-mímica y rescatado después de 100 nM de miR-24-ASO ser transfectadas. supresión (E) dependiente de la dosis de FAF1 por miR-24 en células 293T. células 293T se cotransfectaron con 100 ng pcDNA3.1-FAF1 y 1, 5, o 20 nM miR-24-mímica después de 24 h y a inmunotransferencia como anteriormente. (F) Mutant FAF1 no podría ser baja regulado tras la transfección con 1 nM o 5 nM de miR-24-mímica durante 24 h. FAF1 se redujo reguladas poco después de la transfección con 20 nM de miR-24-mímica; esta fuerza debido a la mutación FAF1 era un poco pequeña.
Para probar si el miR-24 podría regular FAF1 mediante la unión a estos dos sitios predichos, fragmentos que contienen estas dos secuencias o secuencias mutadas se clonaron en el 3 'región UTR del gen de la luciferasa del reportero pGL3 vector, llamado FAF1 /pGL3 o FAF1-M12 /pGL3 (Fig. 2C). Estos vectores informadores de luciferasa que contienen elementos de respuesta a miR-24 o secuencias mutadas se co-transfectaron en células 293T con un control NC-mímica o miR-24-mímica. Posteriormente, se midió la luciferasa y la actividad de Renilla en cada pocillo. Se encontró que miR-24 fue capaz de disminuir la actividad de la luciferasa del vector informador que contiene miR-24 elementos de respuesta, mientras que el indicador que contiene secuencias mutadas no estaba regulada hacia abajo (Fig. 2C). Estos datos muestran que el miR-24 se puede regular a la baja sus objetivos mediante la unión a estos dos predijo sitios de unión.
Para probar si el miR-24 disminuye la expresión de FAF1, 293T células fueron co-transfectadas con el miR-24 imita y pcDNA3.1-FAF1. Como control, algunas células fueron co-transfectadas con NC-imita y pcDNA3.1-FAF1. Se encontró que miR-24 imita disminuyeron FAF1 los niveles de proteína de una manera dependiente de la concentración (Fig. 2D y E). Además, el miR-24-ASO, miR-24 imita y pcDNA3.1-FAF1 fueron co-transfectadas en células 293T. La baja regulación de FAF1 fue revertida por el miR-24-ASO, pero no por NC-ASO (Fig. 2D).
Para confirmar que el miR-24 regula el gen FAF1 mediante la unión a los dos unión predicha sitios de ORF, los mutantes sinónimo de estos dos sitios se construyeron (Fig. 2B). Las células 293T se cotransfectaron con el miR-24-mímica y pcDNA3.1-FAF1. El FAF1 mutante no se puede reducido regulado por transfección de miR-24 imita tanto como FAF1 /pCDNA3.1 hizo (Fig. 2F). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que el miR-24 se puede unir y regular estos dos elementos de respuesta en la región CDS del gen FAF1.
miR-24 Regula la apoptosis en células DU-145 por la orientación del gen FAF1
para probar la hipótesis de que miR-24 regula la apoptosis en células DU-145 por la orientación del gen FAF1, se utilizó el análisis FACS para investigar la apoptosis de las células transfectadas con una serie de reactivos. La sobreexpresión de la apoptosis inducida FAF1, al igual que la baja regulación de miR-24. Cuando FAF1 y miR-24-ASO se co-transfectaron en células DU-145, la tasa de apoptosis fue mucho mayor cuando FAF1 se transfectadas y miR-24 se redujo reguladas de forma simultánea, en comparación con los resultados de la transfección de cualquiera FAF1 o miR-24 -aso solo. De hecho, la apoptosis inducida por FAF1 podría ser rescatado por la sobre-expresión de miR-24 (Fig. 3). Estos datos indican que la apoptosis inducida por la baja regulación de miR-24 puede actuar a través de la regulación de FAF1.
DU-145 células fueron tratadas con los reactivos indicados y la apoptosis se midió por FACS 48 h después de la transfección (n = 3 ± SE, *
p Hotel & lt; 0,01). No sólo la baja regulación de miR-24 induce la apoptosis, pero la sobreexpresión de FAF1 también indujo apoptosis en células DU-145. El porcentaje de células apoptóticas se hizo mucho más alta cuando pcDNA3.1-FAF1 y miR-24-ASO fueron co-transfectadas. La apoptosis inducida por la expresión excesiva de FAF1 podría ser rescatado por el miR-24-mímica. Estos datos muestran que la sobre expresión de miR-24 puede proteger DU-145 células de la apoptosis inducida por FAF1, y que la baja regulación de miR-24 puede aumentar la apoptosis inducida por FAF1 en células DU-145. Los vectores se transfectaron en la concentración de 100 ng por pocillo; imita y ASO se transfectaron a una concentración de 20 nM por pocillo en una placa de 12 pocillos.
La mutación de miR-24 sitios de unión en el gen FAF1 sensibiliza a las células a la apoptosis
los sitios de unión de miR-24 dentro de la FAF1 ORF fueron mutados con el fin de confirmar aún más que el miR-24 regula la apoptosis en células DU-145 por la orientación de la región ORF del gen FAF1. Los resultados de este experimento muestran que las células DU-145 con FAF1 mutante eran más susceptibles a la apoptosis de las células que contienen el gen FAF1 de tipo salvaje. Para determinar si el FAF1 mutante podría ser regulada por miR-24, un gen FAF1 mutante y un miR-24-mímica fueron co-transfectadas en células DU-145. La expresión sobre-de miR-24 no podía rescatar las células de la apoptosis inducida por el gen mutante FAF1 (Fig. 4). Estos datos apoyan la hipótesis de que miR-24 regula la apoptosis mediante la unión de la región ORF del gen FAF1.
células DU-145 se trataron como se indica y la apoptosis se midió por FACS 36 h después de la transfección (n = 3 ± SE, *
p Hotel & lt; 0,01, **
p Hotel & lt; 0,05). sinónimo mutaciones en los sitios de unión de miR-24 previstos dentro FAF1 indujo mayores niveles de apoptosis. La sobreexpresión de miR-24 no protegió a las células DU-145 de la apoptosis inducida por FAF1 mutante. Los vectores se transfectaron a una concentración de 100 ng por pocillo; imita y ASO se transfectaron a una concentración de 20 nM por pocillo en una placa de 12 pocillos.
miR-24-ASO-mediada por la baja regulación de miR-24 también induce la apoptosis y afecta a la proliferación de HGC-27, MGC-803 y HeLa las células
Luego se empleó la línea celular de cáncer cervical HeLa y dos tipos de líneas celulares de carcinoma gástrico humano (HGC-27 y MGC-803) para investigar si el miR-24 podría regular la apoptosis en otras células cancerosas. La apoptosis fue inducida por 20 nM de miR-24-ASO sin ningún otro de inducción después de 48 horas de HGC-27 y células MGC-803 (Fig. 5A). En las células HeLa, se indujo apoptosis estaurosporina with1 nM. La tasa de apoptosis en fue mucho mayor en las células transfectadas con 20 nM miR-24-ASO que en las células transfectadas con NC-ASO (Fig. 5B). Los datos anteriores sugieren que la regulación de la apoptosis por el miR-24 podría ser un mecanismo común en diferentes tipos de células cancerosas.
HGC-27 y MGC-803 células (A) fueron tratados con 20 nM de miR-24 ASO o NC-ASO y la apoptosis se midió por FACS con Anexina V y tinción de propidio yodo después de 48 h (n = 3 ± sE; *
p
& lt; 0,01). El descenso de regulación de miR-24 indujo apoptosis en HGC-27 y células MGC-803. (B) La apoptosis se indujo con estaurosporina 1 M durante 2 h después de 48 h de la transfección usando 20 nM miR-24-ASO o NC-ASO (n = 3 ± SE; *
p
& lt; 0,01). La respuesta apoptótica a estaurosporina se incrementó después de la transfección con el miR-24-ASO.
Discusión
son conocidos miRNAs para inhibir la expresión génica mediante la unión a los 3 'UTRs de sus transcripciones de destino [34]. Recientemente, se ha demostrado que la que miRNAs también puede modular la expresión génica mediante el apareamiento de bases a la región CDS de ARNm diana. Por ejemplo, el let-7 miARN se dirige directamente a la enzima Dicer miARN-procesamiento de su secuencia de codificación, estableciendo así un mecanismo para un bucle de retroalimentación negativa autorregulador miARN /Dicer [12] - [14].
Los estudios previos han encontrado que la baja regulación de FAF1 través de la interferencia de ARN podría aumentar la susceptibilidad a la apoptosis [32]. En el presente estudio, encontramos que el miR-24 actúa como un siRNA endógeno para FAF1, y la apoptosis inducida por FAF1 pueden ser rescatados por la expresión excesiva de miR-24.
El principal hallazgo de este estudio es que el miR-24 FAF1 objetivos mediante la unión a su región CDS, con lo que la regulación de la apoptosis en células DU-145. Nuestro estudio apoya un modelo aumentado en los que los animales miRNAs pueden regular los ARNm mediante la unión a los objetivos tanto fuera como dentro de la región no traducida 3 ', y se extiende nuestra comprensión de cómo el miR-24 y FAF1 regulan la apoptosis en las células cancerosas.
La función de miRNAs es particularmente complicado, y miR-24 puede tener objetivos distintos de FAF1 que también están involucrados en la supervivencia celular. Estudios anteriores han sugerido que el miR-24 reprime las fases de iniciación y elongación de la traducción de ARNm que codifica el supresor tumoral p16 (INK4a) [35]. También se ha encontrado que miR-24 se requiere para reprimir la apoptosis en la retina neural en desarrollo [36]. Por lo tanto, FAF1 puede ser uno de varios objetivos distintos de miR-24 que contribuyen a su efecto de apoptosis.
DU-145 es la línea "clásica" humana de células de cáncer de próstata, derivado de una metástasis cerebral. DU-145 células tienen un potencial metastásico moderada, no son sensible a las hormonas y no expresan PSA (antígeno prostático específico) [37] - [39]. los cánceres de próstata sensibles a las hormonas tratados con terapia hormonal suelen mostrar buen pronóstico. Sin embargo, existen pocas terapias efectivas para el tratamiento de los cánceres de próstata insensibles a hormonas representados por DU-145 [40]. En este estudio, se encontró que la sobreexpresión de FAF1 después de miR-24 baja regulación de la apoptosis inducida en alrededor del 70% de las células DU-145 después de 48 h (Fig. 3). Esto indica que el miR-24 podría ser una diana prometedora terapia en el tratamiento del cáncer de próstata hormono-sensible.
Además, el miR-24 es uno de los miRNAs más abundantes en las células de cáncer de cuello uterino [41], y Según los informes, se incrementaron en un reguladas en los cánceres de estómago sólidos [42]. Otros estudios también han demostrado que la expresión FAF1 se reduce en los carcinomas gástricos en comparación con el tejido no neoplásico, y no había una correlación significativa entre la reducción de FAF1 y el contenido de células en anillo de sello en los carcinomas gástricos [43]. Estos informes sugieren que la expresión de FAF1 se correlaciona inversamente con la cantidad de miR-24 en carcinomas gástricos. Nuestro estudio muestra que FAF1 es un objetivo directo de miR-24, y que el miR-24 se puede regular la apoptosis en las células HGC-27, MGC-803 y HeLa. Estos datos indican que la regulación de la apoptosis a través de miR-24 supresión de FAF1 puede ser un mecanismo común en varios tipos diferentes de cáncer.
En conclusión, el presente estudio sugiere que el factor FAF1 pro-apoptótica está regulada negativamente por miR-24 a través de dos motivos específicos dentro de la región FAF1 ORF. Por otra parte, la baja regulación de miR-24 induce la apoptosis en células DU-145. Nuestros datos apoyan un modelo aumentado en los que los miRNAs pueden dirigirse directamente a las transcripciones dentro de su región de codificación, y sugiere que una búsqueda completa para los objetivos de regulación de miRNAs debería ampliarse a las regiones codificantes de los genes. Nuestros resultados ponen de manifiesto aún más el miR-24 a ser un objetivo potencial para la terapia génica y drogas para tratar el cáncer de próstata hormono-sensible. A medida que se obtuvieron resultados similares en HGC-27, las células MGC-803 y HeLa, también existe una sólida justificación para futuras investigaciones de miR-24 como un tratamiento terapéutico para el cáncer de cuello uterino y gástrico.
Materiales y Métodos
Cultivo de células y transfección
las líneas celulares (293T, HeLa, HGC-27, MGC-803 y DU-145) se obtuvieron del Banco de células en la Academia de Ciencias de china. Las células se cultivaron en DMEM, RPMI-1640 o DMEM /F12, todo suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), a 37 ° C en un 5% CO
2 atmósfera.
Las células en alrededor 70% de confluencia fueron transfectadas utilizando INTERFERin (Polyplus, para la transfección con oligonucleótidos solamente) o Lipofectamine 2000 (Invitrogen, para la transfección con plásmidos) con diferentes concentraciones de imita miARN sintéticos, controles negativos (NC-imita) (Ambion), sintético LNA marcado oligo-ribonucleótidos, miR-24-ASO y marcado con LNA NC-ASO (Takara), así como los plásmidos de acuerdo con protocolos estándar. Las células se recogieron a diferentes puntos de tiempo después de la transfección para ensayos bioquímicos o biológicos. Las secuencias de oligonucleótidos utilizados fueron:
LNA NC-ASO, 5 'caCTTATCagtcAGACCAtcGT 3';
LNA ASO 24, 5 'ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA 3' (minúsculas indican las bases de LNA marcado).
Construcción del plásmido
Un vector de expresión de la proteína FAF1 fue creado por PCR clonación de cDNA FAF1 (NM_007051) entre los sitios EcoRI y XhoI de pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). FAF1 cDNA se amplificó a partir de una biblioteca de ADNc humano usando los siguientes cebadores:
5'-GAACTCGAGATTGGCGTCCAACATGGAC-3 'y 5'-GCGCGAATTCTTACTCTTTTGCTTCAAGG-3'. Los plásmidos que contienen mutaciones dentro de los sitios de unión de miR-24 se construyeron con un método basado en PCR usando los siguientes cebadores mutantes:
FAF1-Mu-B1-FW: 5'-TTAGCTACCTCACGCAAAATTTTATAACCTGGGCTT-3 '
FAF1-Mu-B1-RV: 5'-TGCGTGAGGTAGCTAACAATGGATTCAGCACAAAG -3 '
FAF1-Mu-B2-FW: 5'-CTCCCTCCGGAACCTAAGGAAGAAAATGCTGAGCCTG-3'
FAF1-Mu-B2 RV: 5'-TTAGGTTCCGGAGGGAGGGCTTGCTCTAAGGACAG-3 '
ensayo de luciferasa
los miR-24 sitios de unión se sintetizaron y se clonaron en la región 3'UTR del gen de la luciferasa en el vector de luciferasa pGL3 (Promega ). El constructo obtenido se co-transfectaron con imita NC PRL-SV40 y miR-24 imita o (Ambion) en células 293T tal como se describe anteriormente. Después de 48 h, se determinó la actividad de luciferasa como el promedio de tres ensayos independientes con el sistema Dual-Luciferase Reporter (Promega).
Análisis Apoptosis
Cada línea celular se transfectó con oligonucleótidos o vectores sintetizados . Después de una incubación adicional de 36 o 48 horas, se recogieron las células, se tiñeron con yoduro de propidio y anticuerpo anti-anexina-V marcada con FITC, y se analizaron por FACS.
Ensayo de proliferación celular
ensayos de proliferación celular se realizaron con un Cell Counting Kit-8 (Dojindo). Las células se sembraron en placas de 24 pocillos, por triplicado, a aproximadamente 5 × 10
4 células por pocillo y se cultivaron en el medio de crecimiento. En los puntos de tiempo indicados, el número de células por pocillo se midieron mediante la absorbancia (450 nm) de la reducción de WST-8 (2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- ( 2, 4- disulfofenil) -2H-tetrazolio, sal monosódica).
extracción de proteínas y Western Blot
Las células se recogieron con tampón de SDS de carga (Sigma). Las proteínas se separaron en geles de SDS-poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de PVDF. La membrana fue bloqueada con PBST que contiene 5% de leche en polvo durante 1 h a temperatura ambiente, seguido de la hibridación durante la noche a 4 ° C en TTBS que contenía 1% de leche en polvo y los anticuerpos primarios. Los anticuerpos primarios se detectaron mediante un anticuerpo acoplado a peroxidasa secundario (Sigma) y de quimioluminiscencia (Pierce). Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios:. conejo anti-FAF (Tecnologías de Señalización Celular) y GAPDH (Abcam)