Extracto
El papel de miR-26a en las células cancerosas parecía polémica en estudios previos. Hasta ahora, el papel de miR-26a en el cáncer gástrico permanece indefinido. En este estudio, encontramos que el miR-26a estaba fuertemente regulado por disminución en el cáncer gástrico (CG) los tejidos y líneas celulares, y sus niveles de expresión se asocia con metástasis en los ganglios linfáticos y la etapa clínica, así como la supervivencia global y la supervivencia libre de replase de GC . También se encontró que la expresión ectópica de miR-26a inhibe la proliferación de células GC y GC metástasis
in vitro
y
in vivo
. Se identificaron además un novedoso mecanismo de miR-26a para suprimir el crecimiento de GC y la metástasis. FGF9 fue demostrado ser un objetivo directo de miR-26a, usando el ensayo de luciferasa y Western Blot. FGF9 sobreexpresión en las células-26a-expresión de miR podría rescatar a la invasión y crecimiento defectos de miR-26a. Además, la expresión de miR-26a inversamente correlacionada con los niveles de proteína FGF9 en GC. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que las funciones de miR-26a como un supresor tumoral en el desarrollo y la progresión de GC, y es prometedora como un biomarcador pronóstico y el potencial diana terapéutica para GC
Visto:. Deng M, Tang Hl, Lu xh, Liu Mi, Lu Xm, Gu Yx, et al. (2013) miR-26a suprime el crecimiento tumoral y la metástasis por FGF9 focalización en el cáncer gástrico. PLoS ONE 8 (8): e72662. doi: 10.1371 /journal.pone.0072662
Editor: H. Sunny Sun, Instituto de Medicina Molecular, Taiwán
Recibido: 29 Marzo, 2013; Aceptado: 12 de julio de 2013; Publicado: 28 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Deng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Científica de la Naturaleza China (81101526, 31100936) y Guangzhou doctor Fundación Start Colegio Médico (2012C11). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
miRNAs se expresan de forma endógena, los ARN no codificantes pequeñas que regulan negativamente la expresión génica por causar la degradación del ARNm diana, la inhibición de la traducción de estos ARNm o ambos [1]. miRNAs toman parte en los procesos celulares cruciales tales como la respuesta al estrés, el desarrollo, la diferenciación, la apoptosis y la proliferación [2]. miARN expresión alterada se ha informado en numerosas enfermedades malignas, incluyendo cáncer de mama [3], [4], de pulmón [5], el hígado [6], el estómago [7], colon [8], el cerebro [9], la leucemia [10], y linfoma [11]. Un creciente número de estudios han demostrado que los miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores tumorales, y que a menudo están mal regulada en tumores [12], [13]. En este sentido, miRNAs oncogénicos son frecuentemente upregulated, mientras que miRNAs supresores de tumores son downregulated en los tumores. Por ejemplo, let-7 se ha informado de que se underexpressed en el cáncer de pulmón y para apuntar el Ras oncogénico [14], [15]. Hemos informado anteriormente de que el miR-216b está fuertemente regulado por disminución en el carcinoma nasofaríngeo y atenúa el crecimiento tumoral mediante la orientación KRAS [16]. En contraste, el grupo oncogénico miR-17-92 de miRNAs son upregulated en la variedad de tumor [17], y ejecutada expresión de estos miRNAs en el modelo de ratón transgénico Eμ-myc bien estudiado de linfoma de células B acelera drásticamente inicio de la enfermedad y la progresión [18]. Sin embargo, el papel de miR-26a en células de cáncer parecía controversial, ya que es un supresor tumoral en carcinoma hepatocelular [19], cáncer de mama [20] y el carcinoma nasofaríngeo [21], [22], pero es un oncogén en glioma [23 ] y colangiocarcinoma [24]. Hasta ahora, el papel de miR-26 en el cáncer gástrico no estaba definido.
En el presente estudio, se examinó la expresión de miR-26a en 40 emparejado muestras normales y GC por RT-PCR cuantitativa análisis (QRT-PCR) . Se encontró miR-26a estar fuertemente downregulated en los tejidos de GC en comparación con la de los tejidos normales del estómago adyacentes. Este resultado fue confirmado por hibridación in situ en microarrays de tejidos que consisten en 126 casos de tejidos GC y 41 casos de los tejidos normales adyacentes. Por otra parte, la disminución de miR-26a se asocia con un mal pronóstico y podría predecir de forma independiente la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de replase (RFS) en el cáncer gástrico. Los estudios funcionales revelaron que el miR-26a suprimió el crecimiento celular y la metástasis GC apuntando FGF9.
Resultados
miR-26a está regulado por disminución en el cáncer gástrico humano
El uso de un QRT-PCR método, se detectaron niveles de miR-26a en 40 pares de tejidos de cáncer gástrico y sus tejidos adyacentes emparejados, así como líneas de células gástricas. Entre los 40 pacientes con cáncer gástrico, aproximadamente el 70% (28 de 40 pacientes) de los tumores reveló una reducción de más de dos veces en los niveles miR-26a, con una reducción de 5,76 veces en relación a los tejidos normales adyacentes, lo que sugiere que la reducción de MIR -26a fue un evento frecuente en GC humana (Figura 1 a). Además, la expresión de miR-26a se redujo en todas las líneas celulares de cáncer gástrico (MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, y BGC-823) en comparación con la línea celular gástrica no maligno GES-1 (Figura 1B). A fin de verificar los resultados relativos a la función biológica de miR-26a en la carcinogénesis gástrica humana, hemos empleado la hibridación in situ para evaluar la expresión de miR-26a en 126 GC y 41 tejidos no tumorales en microarrays de tejidos (TMA). Los resultados revelaron que las puntuaciones de expresión de miR-26a se redujo significativamente en los GC en comparación con los tejidos normales (Figura 1C). A continuación, se determinaron las posibles implicaciones clínico-patológicas de la expresión de miR-26a alterado. Las muestras clínicas fueron divididos en grupos de baja expresión y la expresión de alto basándose en los resultados de expresión de miR-26a superior o inferior a la mediana. En consonancia con los datos anteriores, de las 41 muestras totales normales del estómago, 35 (85%) tenían una alta expresión de miR-26a. En contraste, el 60% (76 de 126) de las muestras de carcinoma gástrico tenía baja a la expresión negativa de miR-26a. De los 126 individuos con GC, 38 fueron negativos para metástasis en los ganglios linfáticos, y el 45% de estos pacientes tenían baja a la expresión negativa de miR-26a (Tabla 1). Ochenta y ocho pacientes fueron positivos para metástasis en los ganglios linfáticos, y el 67% de ellos mostraron regulación a la baja o pérdida de miR-26a (Tabla 1). Por otra parte, encontramos una baja expresión de miR-26a en el 37% y el 77% de los tumores gástricos clasificados como estadio I /II y fase III /IV, respectivamente (Tabla 1). Por lo tanto, la expresión de miR-26a se correlaciona inversamente con metástasis en los ganglios linfáticos y el estadio clínico (
P = 0,019
y
P Hotel & lt; 0,001, respectivamente). Sin embargo, el miR-26a no se correlacionó con la edad, el género, la diferenciación celular, o la profundidad de la invasión (estadio T). Estos resultados sugieren que el miR-26a podría desempeñar un papel crítico en la metástasis y la progresión GC.
Se detectó (A) miR-26a en 40 pacientes con cáncer gástrico mediante qRT-PCR. Los datos se muestran como log2 de las veces el cambio en los tejidos de cáncer gástrico relativo (tumor) a los tejidos normales adyacentes (normal). (B) Expresión relativa de miR-26a en 6 líneas celulares derivadas de cáncer gástrico y una línea de células gástricas no maligno (GES-1) se determinó mediante qRT-PCR. Los datos se muestran como log2 de las veces el cambio en las líneas celulares de GC con relación a GES-1. (C) la expresión de miR-26a se analizó en los tejidos adyacentes normales (normal) y GCs muestras (tumor) en los microarrays de tejidos mediante hibridación in situ. expresión puntuaciones se muestran como diagramas de caja. se muestran imágenes representativas de la expresión de miR-26a por hibridación in situ. Aumento original: × 200. (D) El análisis de supervivencia de GC. OS y RFS curvas de 126 pacientes con GC expresión alta o baja de miR-26a se construyeron utilizando el método de Kaplan-Meier y se evaluaron mediante la prueba de log-rank.
Disminución de miR-26a correlatos con un mal pronóstico clínico
a fin de analizar la importancia de miR-26a en términos de pronóstico clínico, análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se realizó con la supervivencia global del paciente y la supervivencia libre de recaída. Los resultados demostraron que los pacientes con baja expresión de miR-26a tenían más corta y mediana de SG RFS que los pacientes con alta expresión de miR-26a (21,6 meses frente a 39,0 meses,
P Hotel & lt; 0,001 para el sistema operativo; 15,2 meses frente . 31,6 meses,
P = 0,002 para
RFS; Figura 1D). Utilizamos riesgos proporcionales de Cox de regresión para evaluar aún más la asociación entre la expresión de miR-26a y el pronóstico. En el análisis univariante, metástasis en los ganglios linfáticos, el estadio TNM, y los niveles de miR-26a se asociaron significativamente con el sistema operativo y la SSR (Tabla 2, 3). El modelo multivariado final reveló que el tiempo total de supervivencia dependía en gran medida de metástasis de ganglios linfáticos, el estadio TNM, y los niveles de miR-26a (Tabla 2), y el tiempo de supervivencia libre de recaída hizo en metástasis de ganglios linfáticos y los niveles de miR-26a (Tabla 3).
miR-26a Suprime GC Crecimiento y metástasis
Teniendo en cuenta la correlación inversa entre los niveles de miR-26a y la metástasis, se investigó el efecto de miR-26a re-expresión de las capacidades de migración y la invasión de líneas celulares de GC. Dos líneas de células GC (SGC-7901 y AGS) con relativamente baja expresión basal de miR-26a (Figura 1B) se infectaron con cualquiera de miR-26a o lentivirus de control y seleccionados con 5 mg /l puromicina durante dos semanas. A continuación, la cicatrización de heridas se llevaron a cabo el ensayo y el ensayo transwell. Como era de esperar, la sobreexpresión de miR-26a suprimió significativamente la migración celular y la capacidad de invasión (Figura 2A, B, Figura S1).
(A, B) El ensayo (A) y ensayo de invasión (B) de la cicatrización de la herida SGC-7901 y las células AGS infectadas con miR-26a o lentivirus scramble. El ensayo de invasión se midió por medio de ensayos Transwell con Matrigel. (C) El crecimiento de SGC-7901 y las células AGS infectadas con miR-26a o lentivirus scramble fue ensayada. ensayos (D) de crecimiento de colonias en agar blando se realizaron en SGC-7901 con la sobreexpresión de miR-26a o despegue en tiempo mínimo. Imágenes representativas de los ensayos se muestran (panel izquierdo). Aumento original: × 200. (E) La sobreexpresión de miR-26a induce la apoptosis de las células tumorales. células SGC-7901 se infectaron con miR-26a o lentivirus scramble. Las células apoptóticas fueron evaluadas por Anexina V-FITC y yoduro de propidio y se analizaron con tinción de FACS. Todos los datos son presented.as media ± E.E.M de al menos tres experimentos separados.
Para demostrar el efecto de miR-26a en el crecimiento de GC, se realizó un ensayo de proliferación celular GC. El ensayo de proliferación mostró que la expresión ectópica de miR-26a en SGC-7901 y AGS atenúa la proliferación celular en comparación con las células control (Figura 2C). Además, la expresión de miR-26a ectópico inhibe la capacidad de formación de colonias en agar blando (Figura 2D). a continuación, se realizó un análisis de la apoptosis celular y reveló que la sobreexpresión de miR-26a en SGC-7901 apoptosis celular inducida (Figura 2E).
A continuación, hemos probado si el miR-26a podría desempeñar un papel en la tumorigénesis mediante el uso de xenoinjerto en ratones desnudos modelos. Se encontró que la sobreexpresión de miR-26a en las células SGC-7901 suprimidos de manera significativa el crecimiento tumoral en ratones desnudos (Figura 3A; Figura S2). A continuación, se inyectaron células SGC-7901 infectadas o bien con miR-26a o de control lentivirsus en la vena de la cola de ratones desnudos para examinar la metástasis de pulmón. Como se muestra la figura 3B, un número significativamente menor de metástasis pulmonares macroscópicas se pudo observar en miR-26a células que sobreexpresan las células de control. Estos resultados indican que el miR-26a puede reprimir el crecimiento de GC y la metástasis.
(A) El crecimiento tumoral en modelos de xenoinjerto de ratón. Se inyectaron células SGC-7901 infectados con miR-26a o lentivirus scramble por vía subcutánea en ratones desnudos. El tamaño del tumor se midió cada 5 días. Después de 30 días, se sacrificaron los ratones, se realizaron las necropsias y se pesaron los tumores. (B) la metástasis tumoral en modelos de xenoinjerto de ratón. células SGC-7901 con la sobreexpresión de miR-26a o scramble se inyectaron en la vena de la cola de ratones desnudos. Después de 45 días, los ratones fueron sacrificados. Se calcularon las micrometástasis en el pulmón por sección HE-manchado en ratones individuales. Cada grupo tenía seis ratones. Aumento original, × 100; barra de escala: 50 micras. Todos los datos se muestran como media ± SEM
miR-26a directamente a las metas e inhibe FGF9
Para entender cómo miR-26a suprime el crecimiento y la metástasis GC, hemos utilizado tres algoritmos (TargetScan, PicTar y Miranda) para ayudar a identificar los objetivos de miR-26a en los cánceres gástricos humanos. De estos genes diana que se predijo por los tres algoritmos (Tabla S1), FGF9 atrajo la atención inmediatamente, ya que se ha implicado en la tumorigénesis o metástasis [26] - [28]. Hemos clonado de longitud completa FGF9 3'-UTR en un vector indicador de luciferasa. Ensayo de la luciferasa reveló que miR-26a unido directamente a FGF9 3'-UTR, y por la que se reduce notablemente las actividades de luciferasa (Figura 4A). Sin embargo, la mutación de los sitios de miR-26a putativos en la 3'-UTR de FGF9 abrogó la capacidad de respuesta de la luciferasa de miR-26a (Figura 4A). Para evaluar directamente el efecto de miR-26a en la expresión FGF9, se realizó un análisis de transferencia Western. Como se ve en la figura 4B, lentiviral inducida ectópico miR-26a suprimió drásticamente los niveles de proteína en FGF9 SCG-7901 y las células AGS. Por otra parte, desmontables de miR-26a, a través de la transfección de anti-miR-26a, en GES-1 en las células aumentaron los niveles de proteína FGF9 (Figura 4B; Figura S1). Tomados en conjunto, estos resultados indican que FGF9 será un objetivo directo de miR-26a en las células de GC. Los resultados anteriores nos llevó a examinar si el miR-26a suprime el crecimiento y la metástasis de GC a través de la represión de la expresión FGF9. Para este propósito, FGF9 se re-expresa en las células SGC-7901 transfectadas-miR-26a. En las células-26a-expresión de miR, re-expresión de FGF9 rescató a los defectos de invasión y crecimiento de miR-26a (Figura 4 C, D, E). Por último, hemos probado si la expresión de miR-26a correlaciona con los niveles de proteína FGF9 en GC. Hubo una correlación inversa entre los niveles de proteína FGF9, indicado por tinción inmunohistoquímica, y la expresión de miR-26a evaluó por hibridación in situ en tejidos 126 GC en TMA tal como se utiliza anteriormente (Figura 4F; Figure1C). Nuestros hallazgos demuestran que el miR-26a tiene propiedades consistentes con la función supresora de tumores. La capacidad de modular los niveles de FGF9 podrían explicar, al menos en parte, por qué miR-26a puede inhibir el crecimiento y la metástasis GC.
(A) El elemento de 3'-UTR de RNA mensajero FGF9 es parcialmente complementario a miR 26a. miR-26a o control de mezcla aleatoria y indicador de luciferasa que contiene o bien un tipo salvaje o un mutante de 3'-UTR se co-transfectaron en células HEK-293T. Y una luciferasa de Renilla expresar constructo ejerce como control interno. (B) Análisis de transferencia Western de la expresión FGF9 en SGC-7901 y las células AGS infectadas con miR-26a y GES-1 transfectadas con inhibidores de miR-26a (anti-miR-26a). (C, D, E) FGF9 abroga las funciones supresoras de miR-26a en la invasión de células de GC y el crecimiento. células SGC-7901 expresan de forma estable el miR-26a o scramble se transfectan con o sin plásmidos FGF9. ensayos de invasión (C), el análisis de la apoptosis (D), y el análisis de la proliferación celular (E) se realizaron con las células anteriores como se describe en Materiales y Métodos. Los datos se presentan como media ± S.E.M. de al menos tres experimentos independientes. gráfica de correlación de dispersión (F) de Spearman de los niveles de miR-26a (determinada mediante hibridación in situ) y proteína FGF9 (determinado por inmunohistoquímica) en 126 muestras de GC. Imágenes representativas de la expresión FGF9 mediante técnicas de inmunohistoquímica se muestran (panel derecho). Aumento original:. × 200
Discusión
miR-26a pertenece a la familia de miR-26, que contiene otro miembro de miR-26b, los cuales casa secuencia idéntica con la excepción de 2 nucleótidos diferentes en miRNAs maduros. miR-26a es un miARN funcional que ha merecido investigación anterior [29]. Se sabe que miR-26a juega un papel importante en el crecimiento, desarrollo y diferenciación de células de diferentes tejidos [29]. Varios estudios han demostrado que la expresión de miR-26a hay trastorno en un número de tumores humanos [19], [22], [24], [30], [31]. Sin embargo, ninguno de estos estudios se relaciona con el cáncer gástrico. En el presente estudio, hemos utilizado QRT-PCR e ISH para demostrar que los niveles de miR-26a en tejidos de cáncer gástrico fueron significativamente más bajos que los de los tejidos no tumorales. Por otra parte, los niveles de miR-26a se asociaron con la etapa clínica y la presencia de metástasis en los ganglios linfáticos. De Kaplan-Meier análisis de supervivencia reveló que los pacientes cuyos tumores primarios que se muestra una baja expresión de miR-26a, tuvieron una SG más corta y RFS en GC. Además, el análisis de Cox de riesgos proporcionales de regresión mostró que la reducción de miR-26a en los tumores fue un predictor fuerte e independiente del sistema operativo más corto y RFS. Sobre la base de datos de la matriz, se informó anteriormente de que una combinación de varios miRNAs puede ser útil como marcadores de pronóstico en el cáncer gástrico [32], [33]. Además, un solo-miARN, como miR-218, puede ser un indicador de pronóstico [34]. Sin embargo, estos miRNAs se han investigado en sólo unos pocos pacientes con cáncer gástrico. Aquí, el miR-26a puede ser útil como marcador pronóstico para predecir la supervivencia y la recaída en el cáncer gástrico.
Este estudio demostró que la expresión ectópica de miR-26a en las células GC deteriora la migración, la invasión, la proliferación y el crecimiento de colonias como así como inducida por apoptosis. Por otra parte, en los datos in vivo demostraron miR-26a inhibió el crecimiento del tumor y la metástasis. Estos in vitro y los datos in vivo indicaron además que las funciones de miR-26a como un supresor de tumores en el cáncer gástrico. Varios estudios apoyan nuestros resultados. Por ejemplo, este miARN se disminuye en los tejidos de la APN y puede atenuar el crecimiento celular y la tumorigénesis por la orientación EZH2 [22]. El carcinoma hepatocelular también exhibe reducida expresión de miR-26a [19]. La administración sistémica de este miARN en un modelo de ratón de HCC utilizando un virus adeno-asociado (AAV) da como resultado la inhibición de la proliferación de células cancerosas, la inducción de apoptosis específica de tumor, y la protección dramático de progresión de la enfermedad sin toxicidad [35]. Sin embargo, varios estudios recientes revelaron el papel oncogénico de miR-26a en tumores tales como glioma y colangiocarcinoma. Huse et al. informaron que el miR-26a se sobreexpresa en el glioma de alto grado y directamente dirigida PTEN [23]. Del mismo modo, se encontró que el miR-26a que se sobreexpresa en los tejidos humanos y colangiocarcinoma para promover el crecimiento colangiocarcinoma mediante la activación de B-catenina [24]. Estos resultados controvertidos sugirieron que el papel de miR-26a era posiblemente tumor específico y altamente dependiente de sus objetivos en diferentes células cancerosas. Diversos estudios han demostrado que el PTEN [23], EZH2 [21], [22], Smad1 [36], CDK6 y ciclina E1 [37] son posibles genes diana aguas abajo de miR-26a. En este estudio, FGF9, un nuevo objetivo directo y funcional de miR-26a, se identificó en GC. FGF9, también conocido como factor de activación glial, es uno de los 23 miembros de la familia FGF altamente conservada. Como, glicosilada proteína 26-kDa secretada, que tiene efectos mitogénicos sobre una variedad de diferentes tipos de células [26]. FGF9 ha demostrado estar implicado en diferentes tipos de cáncer, tales como adenocarcinoma de ovario endometrioide [26], carcinoma hepatocelular [27] y el carcinoma de próstata [28]. En nuestros estudios, hemos confirmado que FGF9 era un objetivo directo de miR-26a en las células de GC. Para determinar si el miR-26a suprime el crecimiento y la metástasis de GC a través de la represión de la expresión FGF9, encontramos que la sobreexpresión FGF9 podría rescatar a la invasión y crecimiento defectos de miR-26a. Estos resultados sugieren que el miR-26a inhibe el crecimiento y la metástasis de GC en parte por la orientación FGF9.
En conjunto, se observó regulación a la baja de miR-26a en células de cáncer gástrico y demostraron que el miR-26a puede actuar como un predictor independiente de OS y RFS. Estamos, además, que el miR-26a posee la potencia para suprimir el crecimiento de GC y la metástasis mediante la regulación de FGF9. Nuestros hallazgos sugieren funciones de miR-26a como un supresor tumoral en GC y es prometedora como un biomarcador pronóstico y el potencial diana terapéutica para la GC.
Materiales y Métodos
Cell Cultura y
la línea de células epiteliales gástricas GES-1 se adquirió en el Instituto para la Investigación del cáncer (Pekín, china) Pekín. Las líneas celulares GC MKN-28, SGC-7901, AGS, MGC-803, MKN-45, y BGC-823 se obtuvieron de la Academia China de Ciencias Médicas (Pekín, China). Estas células se mantuvieron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO
2 en RPMI-1640 (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901), DMEM (GES-1) o F12 ( AGS) suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina y estreptomicina (Gibco BRL, NY, EE.UU.). Todas las transfecciones se utilizan Lipofectamine 2000 ((Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.)).
Muestras Clínicas
Todas las muestras de tejidos utilizados en el presente estudio se recogieron del Hospital de Tumores provincia de Hunan (Changsha, Hunan, China). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes del estudio. Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Autoridad de Salud de la Universidad de Medicina de Guangzhou. La recopilación y el uso de tejidos siguieron los procedimientos que están en conformidad con los estándares éticos formulados en la Declaración de Helsinki
Las muestras de tejido de 40 pacientes con cáncer gástrico (23 hombres y 17 mujeres;. Mediana de edad de 59 años, rango 40-84 años) se utilizaron para PCR análisis cuantitativo en tiempo real (qRT-PCR). tejidos resecados cancerosos (tumor) y pareadas emparejado tejidos gástricos normales (normal) se cortaron de inmediato, se congelaron en nitrógeno líquido, y se mantuvieron a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
Los microarrays de tejidos (TMA), que consiste en 126 GC y 41 tejidos normales adyacentes del estómago, se utilizaron para el análisis de hibridación in situ. La edad media de los pacientes con cáncer gástrico al momento del diagnóstico fue de 57 años (rango 31-82). La mediana del tiempo de seguimiento para la supervivencia global (SG) y la supervivencia libre de recaída (RFS) fue de 22 meses y 15 meses, respectivamente. Todos los datos de 126 muestras de GC, incluyendo edad, sexo, localización del tumor, el grado histológico, la profundidad de la invasión (estadio T), estadio clínico, y la metástasis de los ganglios linfáticos se obtuvieron de los registros clínicos y patológicos y se resumen en la tabla complementaria 2.
RT-PCR cuantitativa análisis
ARN total fue extraído de las células utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). La transcripción inversa y reacciones de QRT-PCR se realizaron usando un kit PCR qSYBR-verde (Qiagen, Germantown, EE.UU.) y U6 snRNA se utilizó como control endógeno. cambio veces se determinó como 2
-ddCt. El Ct es el número de ciclo fraccional al que la fluorescencia de cada muestra pasa el umbral fijo. El DDCT se calculó restando la DCT de la muestra de referencia (tejido no tumoral emparejados para las muestras quirúrgicas y GES-1 de células de seis líneas celulares de cáncer gástrico) de la DCT de cada muestra. Las secuencias de los cebadores específicos para el miR-26a y U6 snRNA fueron 5'-CTTCAAGTAATCCAGGATAGGC-3 'y 5'-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3', respectivamente.
In situ e inmunohistoquímica Hibridación
la detección de miR-26a mediante hibridación in situ utilizando el DIG marcado con ácido nucleico cerrado (LNA) a base de sonda específica para el miR-26a (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante y U6 snRNA se utilizó como control positivo. Brevemente, las diapositivas de microarrays de tejidos se desparafinaron, se trató con proteinasa K (5 min en 2 mg /ml de proteasa K), se lavaron en PBS y posteriormente se bloqueó la actividad de peroxidasa endógena con 3% de H
2O
2. La hibridación se realizó a 52 ° C durante la noche después de la adición de 50 nM de sondas de LNA marcados con DIG, seguido de un lavado en tampones rigurosidad de SSC. Después del bloqueo (2% de suero de ovejas y 2 mg /ml de BSA en PBS con Tween-20) a temperatura ambiente, el complejo sonda-diana se visualizó utilizando un anticuerpo anti-DIG-POD, y complejo DAB.
La inmunohistoquímica se realizó en secciones de microarrays de tejidos utilizando anticuerpo anti-FGF9 (Santa Cruz, CA, EE.UU.). El complejo se visualiza con estreptavidina /peroxidasa y complejo DAB, y los núcleos contratinción con hematoxilina. La hibridación in situ e inmunohistoquímica resultados se puntuaron por la intensidad (0-4) y el porcentaje de tinción (0 a 100%). expresión relativa se obtiene multiplicando la intensidad por porcentaje. Las diapositivas fueron analizados por dos patólogos independientes.
vector recombinante
lentivirus recombinantes que contienen precursores o revueltos secuencias de miR-26a se adquirieron de SunBio (Shanghai, China). Para el análisis de la luciferasa, la FGF9 de longitud completa 3 'UTR se amplificó a partir de ADN genómico de sangre humana y después se clonó en la región aguas abajo de un casete de luciferasa de luciérnaga en el vector PMIR-INFORME luciferasa (Ambion, Austin, TX, EE.UU.). Las construcciones mutantes correspondientes, en los que los primeros seis nucleótidos complementarios a la semilla-región de miR-26a se mutaron por mutagénesis dirigida al sitio (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.). Para construir vectores que expresan FGF9, FGF9 ORF cDNA se adquirió de GeneCopeia (Rockville, MD, EE.UU.) y se subclonó en el vector de expresión eucariota pcDNA3.1 (+) (Invitrogen).
luciferasa reportero de ensayo
miR-26a o lentivirus revueltos y el vector PMIR-3'UTR se co-transfectaron en células HEK-293T. Renilla y las actividades de luciferasa de luciérnaga se midieron con el sistema Dual-Luciferase Reporter (Promega, Madison, WI) 24 h después de la transfección. Firefly actividad de luciferasa se normalizó a la expresión de luciferasa de Renilla para cada muestra. Cada experimento se realizó por triplicado.
Western Blot
Western Blot se llevó a cabo como se describe anteriormente [16]. Brevemente, los lisados de proteínas fueron separadas por 10% SDS-PAGE, y elec-trophoretically transfirieron a PVDF (difluoruro de polivinilideno) de membrana. A continuación, la membrana se incubó con anticuerpo de ratón contra el anticuerpo anti-FGF9 (Santa Cruz, CA, EE.UU.), seguido de HRP (peroxidasa de rábano picante) marcado con anti-ratón de cabra-IgG (Santa Cruz, CA, EE.UU.) y detectado por quimioluminiscencia. β-actina se utilizó como control de carga de proteína.
Ensayo de proliferación celular
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a las concentraciones de células deseados. Los recuentos de células se estimaron por tripsinización de las células y la realización de análisis utilizando un contador Coulter (Beckman Coulter, Fullerton, EE.UU.) en los puntos de tiempo indicados por triplicado.
migración celular y la invasión ensayos
La migración celular se examinó mediante ensayos de curación de heridas. Una "herida" artificial fue creado en una monocapa de células confluentes, y se tomaron fotografías utilizando un microscopio invertido (Olympus, Tokio, Japón) a las 24 horas.
Para el ensayo de invasión de células, las células fueron sembradas en la membrana basal matriz presente en la pieza de inserción de una placa de cultivo de 24 pocillos (matriz de EC, Chemicon, Temecula, CA) y suero bovino fetal se añadió a la cámara inferior como un quimioatrayente. Después de otras 48 horas, las células no invasoras y la matriz CE se retiraron suavemente con un bastoncillo de algodón. células invasoras situados en el lado inferior de la cámara se tiñeron con cristal violeta, se contaron y la imagen.
formación de colonias de ensayo
placas de seis pocillos se cubrieron con una capa de agar al 0,6% en el medio suplementado con suero bovino fetal 20%. Las células (1 × 10
4) se prepararon en 0,3% de agar y se sembraron por triplicado. Después las placas se incubaron a 37 ° C durante dos semanas, se contaron las colonias.
Análisis Apoptosis
Las células apoptóticas fueron evaluadas por Anexina V-FITC y yoduro de propidio tinción (BD, EE.UU. ) y se analizaron con un instrumento FACS Calibur (BD, EE.UU.). Los datos obtenidos fueron analizados mediante FlowJosoftware.
Ratón modelo de xenoinjerto
El modelo de cáncer gástrico en ratones desnudos se construyó como se describe antes [25]. Para evaluar el papel de miR-26a en la formación de tumores, las células SGC-7901 infectados con virus de miR-26a o revueltos se propagaron y se inocularon por vía subcutánea en los flancos dorsales de ratones desnudos (5 en cada grupo). El tamaño del tumor se midió cada 5 días. Después de 30 días, se sacrificaron los ratones, se realizaron las necropsias y se pesaron los tumores. Los volúmenes tumorales se determinaron de acuerdo con la siguiente fórmula: A × B
2/2, donde A es el diámetro más grande y B es el diámetro perpendicular a A. Para ensayar el efecto de miR-26a en la metástasis tumoral, las células SGC-7901 infectado con virus de miR-26a o revueltos fueron inyectadas en la vena de la cola de ratones desnudos (6 en cada grupo). Después de 45 días, se realizaron necropsias. Números de micrometástasis en el pulmón por la sección HE-manchadas en ratones individuales se analizaron mediante la observación morfología. Los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de Protección de Experimentación Animal de la Universidad Médica de Guangzhou. cuidado de los animales y de laboratorio directrices estándar fueron seguidos.
Análisis estadístico
Las comparaciones entre grupos se analizaron mediante el
t-
de prueba y x
2 test. curvas de supervivencia global y curvas sin recaídas se representaron usando el método de Kaplan-Meier, con la prueba de log-rank se aplica para la comparación. La supervivencia se midió desde el día de la cirugía. Las variables con un valor de
P Hotel & lt; 0,05 según el análisis univariado fueron utilizados en el análisis multivariante posterior basado en el modelo de riesgos proporcionales de Cox. pruebas de correlación de Spearman se utilizaron para evaluar la correlación entre la expresión de pares de miR-26a y FGF9 en los tejidos GC. Todas las diferencias fueron estadísticamente significativas en el nivel de
P
≤0.05. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software SPSS15.0.
Apoyo a la Información
Figura S1.
QRT-PCR mide los miR-26a niveles de expresión en SGC-7901 y las células AGS infectadas con lentivirus miR-26a, así como células GES-1 transfectadas con inhibidores de miR-26a
doi:. 10.1371 /journal.pone .0072662.s001 gratis (TIF)
figura S2.
QRT-PCR mide los miR-26a niveles de expresión de los tejidos tumorales extraídas de ratones desnudos a los 30 días después de la inyección células cancerosas. Todos los datos se muestran como media ± E.E.M
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s002 gratis (TIF)
Tabla S1.
genes diana que se predijo por los tres algoritmos (TargetScan, PicTar y Miranda)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0072662.s003 gratis (XLS)
Tabla S2.
Características de los pacientes con cáncer gástrico
doi: 10.1371. /journal.pone.0072662.s004 gratis (DOC)
Reconocimientos
Agradecemos J Ma y CK Wang por su asistencia técnica.