Extracto
El cáncer de pulmón es la principal causa de mortalidad por cáncer en el mundo de hoy. Aunque se han hecho algunos avances en el tratamiento del cáncer de pulmón, la supervivencia del paciente sigue siendo pobre. Los microARN (miARN) puede actuar como oncogenes o genes supresores de tumores en la malignidad humana. La familia de miR-34 se compone de miRNAs con el tumor supresor, y su reducción de expresión se ha informado en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). En este estudio, se encontró que miR-34a y objetivo miR-34c derivado de plaquetas receptor alfa del factor de crecimiento y beta (PDGFR-α y PDGFR-β), los receptores de tirosina quinasa de la superficie celular que inducen la proliferación, la migración y la invasión en el cáncer. MiR-34a y miR-34c fueron regulados a la baja en los tumores de pulmón en comparación con los tejidos normales. Por otra parte, hemos identificado una correlación inversa entre PDGFR-α /β y miR-34a /c expresión en muestras de tumores de pulmón. Por último, el miR-34a /c sobreexpresión o regulación a la baja de PDGFR-α /β de siRNAs, aumentado fuertemente la respuesta a la apoptosis relacionada con el TNF-ligando inductor (TRAIL), mientras que la reducción de capacidad migratoria e invasiva de las células de NSCLC.
Visto : M Garofalo, Jeon YJ, Nuovo GJ, J Middleton, Secchiero P, P Joshi, et al. (2013) miR-34a /c-dependiente PDGFR-α /β inhibe la regulación a la baja Tumorigénesis y mejora inducida por TRAIL-apoptosis en el cáncer de pulmón. PLoS ONE 8 (6): e67581. doi: 10.1371 /journal.pone.0067581
Editor: Noriko Gotoh, Instituto de Ciencias Médicas, Universidad de Tokio, Japón
Recibido: 10 de noviembre de 2012; Aceptado: 23-may de 2013; Publicado: 21 de junio 2013
Derechos de Autor © 2013 Garofalo y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyada por los Institutos nacionales de Salud CA152758. Los autores agradecen el apoyo de investigadores de la Universidad Estatal de Ohio inversiones puntuales en premio a la excelencia. MG es un ganador del Premio Académico Kimmel 2011. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. GJN es un empleado de la filogenia , Inc. No hay patentes, productos en desarrollo o los productos comercializados para declarar. Esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
El cáncer de pulmón es la causa más común de muerte por cáncer en todo el mundo [1]. A pesar de años de investigación, el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón sigue siendo pésimo. El tipo más frecuente, el cáncer no microcítico de pulmón no microcítico (CPNM) (85%), muestra una supervivencia global a los cinco año de 15%. Las isoformas de receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) y su ligando, PDGF, constituyen una familia de receptores y ligandos involucrados en proliferativa y prosupervivencia de señalización dentro de las células. El sistema /PDGF PDGFR incluye dos receptores (PDGFR-alfa y PDGFR-beta) y cuatro ligandos (PDGFA, PDGFB, PDGFC, y PDGFD). Ligando la dimerización del receptor induce la unión, lo que permite la autofosforilación de residuos de tirosina específicos y la posterior reclutamiento de una variedad de moléculas de transducción de señales. PDGFR regula el crecimiento normal y la diferenciación celular [2] y la expresión de PDGFR activado promueve la transformación oncogénica [3]. Numerosos
in vitro
y
in vivo
estudios mostraron que la inhibición de la señalización PDGFR-α altera la supervivencia de células de cáncer en el subconjunto de tumores del estroma gastrointestinal (GIST) con la activación de mutaciones PDGFR-α [4, 5]. En un reciente estudio de 150 muestras de pacientes de NSCLC, activa PDGFR-α se detectó en 13% de los casos [6], lo que sugiere que un subconjunto de estos pacientes podría beneficiarse de las terapias dirigidas contra PDGFR-α. Por otra parte, la sobreexpresión del PDGFR-α se ha observado en metastásico en comparación con las muestras de pacientes no metastásicos meduloblastoma y alterar la función PDGFR-α inhibe el potencial metastásico de células de meduloblastoma in vitro [7]. Teniendo en cuenta su papel favorable al crecimiento en la señalización celular, PDGFR-α se ha convertido en una atractiva diana terapéutica en una serie de tumores malignos humanos. En el cáncer de pulmón de células no pequeñas, la expresión de PDGFR-α citoplásmica por el tumor es un indicador pronóstico negativo [8], lo que confirma que el eje de PDGF pueden ser biológicamente relevante. Todos los miembros de la familia PDGF pantalla potente actividad angiogénica
in vivo
, y desde este punto de vista, el eje de PDGF-B /PDGFRß fue la más extensa evaluado. En los ratones nulos se demostró que PDGF-B y PDGFRß son críticamente implicado en el desarrollo vascular. El papel de PDGF /PDGFR en el desarrollo vascular es apoyada por experimentos knockout [9,10]. Los microARN (miARN), una clase de ~ 22 nt ARN endógenos, son importantes reguladores de la expresión génica y se han implicado en la regulación de procesos críticos que están desregulados en células de cáncer, como la proliferación [11] diferenciación [12] y la apoptosis [13 ]. Alteraciones en la expresión de los genes miARN en el cáncer se han documentado en numerosos estudios y sugieren que miRNAs contribuyen críticamente al fenotipo de células de cáncer [14,15]. Por otra parte, algunos genes miARN que codifica han sido clasificados como genes supresores de tumores oncogénicos o de acuerdo a su función en la transformación celular y la expresión alterada en los tumores.
En 2007, los informes de varios laboratorios mostraron que los miembros de la miR-34 familia son p53 objetivos directos, y que su regulación positiva inducida por apoptosis y detención del ciclo celular [16,17]. En los mamíferos, la familia miR-34 se compone de tres miRNAs procesados que están codificadas por dos genes diferentes: el miR-34a está codificada por su propia transcripción, mientras que miR-34b y la cuota de miR-34c un transcrito primario común. Por otra parte, la región promotora de miR-34a, 34b MIR-MIR-34c y contiene islas CpG y la metilación aberrante CpG reduce la expresión de la familia miR-34 en varios tipos de cáncer [18,19,20].
este estudio, mostramos que el miR-34a y miR-34c, están fuertemente regulados a la baja en las células NSCLC y tumores de pulmón, mientras que son altamente expresado en los tejidos pulmonares normales. Por otra parte, el miR-34a y miR-34c, apuntando a PDGFR-α y β-PDGFR, aumentan la apoptosis inducida por TRAIL y disminuyen la capacidad de invasión de las células del cáncer de pulmón. Por otra parte, nuestros resultados sugieren, por primera vez, que el tratamiento combinatorio de los inhibidores de TRAIL y PDGFR podría ser eficaz para la terapia contra el NSCLC.
Resultados
miR-34a y miR-34c PDGFR objetivo -α y PDGFR-β 3 'UTRs
Entre los miRNAs, los miembros de la familia miR-34 desempeñan importantes funciones supresoras tumorales, ya que están directamente regulados por p53 y p53 componen la red [16,17]. Un estudio anterior indicaba que el miR-34 metilación estaba presente en NSCLC y se relacionó significativamente con un mal pronóstico [20]. En primer lugar, se analizaron mediante PCR en tiempo real (QRT-PCR) miR-34a, expresión -34b y -34c en 5 líneas celulares de cáncer diferentes con WT p53, mutante o nula (Figura S1a en S1 Archivo). MiR-34a, -34b y -34c tenían expresión baja o ausente en todas las cinco líneas celulares (Figura S1b en Archivo S1). Para identificar el miR-34a, -34b y -34c objetivos, se realizó una búsqueda bioinformática (TargetScan, PicTar) para los objetivos de mRNA putativos. Entre los objetivos de candidatos, 3 'UTR de PDGFR-α humano y PDGFR-β contenía regiones (nucleótidos PDGFR-alfa 2670-2676; nucleótidos PDGFR-beta 1535-1541; 2699-2705) que coincidían con las secuencias de semillas de hsa-miR 34a, -34b y -34c (Figura 1a). Se han reportado PDGFR-α y PDGFR-β que se sobreexpresa y en relación con un peor pronóstico en el cáncer de pulmón [21]. Para verificar si el PDGFR-α y β-PDGFR fueron blancos directos de miR-34a, -34b y -34c, PDGFR-α UTR 3 ', que contiene dos sitios de unión de miR-34a, -34b y -34c y PDGFR-β 3' UTR, que contiene uno miR-34a, -34b y -34c sitio de unión (Figura 1a, b), se clonaron aguas abajo del marco de lectura abierto de la luciferasa. Curiosamente, el aumento de expresión de miR-34a y miR-34c, y no miR-34b, después de la transfección, confirmado por qRT-PCR (datos no mostrados), redujo significativamente la actividad de luciferasa, lo que indica una interacción directa entre los miRNAs y PDGFRa y PDGFRß 3 'UTRs (Figura 1 C, D). la represión de genes diana fue rescatado por mutaciones en los sitios de siembra complementarias (Figura 1b, c, d). Tomados en conjunto, los resultados indican que el miR-34a y miR-34c y no miR-34b se dirige directamente a PDGFR-α y β-PDGFR.
(a) contienen PDGFR-alfa y PDGFR-beta 3 'UTR, respectivamente , dos y un predijo miR-34a, -34b y -34c sitios de unión. En la figura se muestra la alineación de las regiones de semillas de miR-34a /c con PDGFR-α y β-PDGFR 3 'UTRs. Los sitios de mutagénesis objetivo se indican en rojo. _deleted nucleótidos. (B) construcciones de control PGL3-PDGFR-alfa que contienen dos sitios de unión a PDGFR-alfa (en rojo). La deleción de uno de los dos sitios de PDGFR-alfa se utilizó para generar los palsmids de luciferasa mutantes. (C-d) PDGFR-α y β-PDGFR 3 'UTRs son blancos directos de miR-34a y miR-34c. pGL3-PDGFR-alfa y de luciferasa pGL3-PDGFR-β construcciones, que contienen un tipo salvaje (lado izquierdo de los histogramas) o mutado (lado derecho de los histogramas) PDGFR-α y PDGFR-β 3 'UTRs, se transfectaron en Calu células -6. represión relativa de expresión de luciferasa de luciérnaga se normalizó a un control de transfección. Los ensayos de reportero se realizaron tres veces con resultados esencialmente idénticos. * P & lt; 0,0001, ** P & lt;. 0,05 por la prueba t de dos de Student de cola
miR-34a y miR-34c están inversamente relacionadas con PDGFR-α /expresión de β
in vitro
y
in vivo
a continuación, se analizaron las consecuencias de la expresión ectópica de miR-34a y -34c en las células Calu-6 y H1703. Elegimos estas dos líneas celulares debido a los altos niveles de expresión de PDGFR-α (H1703 y Calu-6) y PDGFR-β (Calu-6) (datos no mostrados). El aumento de expresión de miR-34a y miR-34c después de la transfección se confirmó mediante qRT-PCR (datos no mostrados) y luego los efectos sobre PDGFR-α y PDGFR-β mRNA y los niveles de proteína se analizaron mediante qRT-PCR y Western blot. MiR-34a y -34c (y no miR-34b) sobreexpresión redujeron significativamente PDGFR-α y mRNAs PDGFR-beta (Figura 2A) y los niveles de proteína endógenos, en comparación con las células transfectadas con un revueltos pre-MIR (figura 2b). Los niveles de expresión de los cuatro ligandos de PDGF (PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD) después de miR-34a y miR-34c expresión forzada también se evaluaron tanto en las células Calu-6 y H1703. PDGFD apenas se expresó en ambas líneas celulares; no hemos encontrado ninguna variación de la expresión de PDGFA, PDGFB y PDGFC (datos no mostrados). En resumen, estos resultados apoyan las predicciones bioinformáticas que indican PDGFR-α y β-PDGFR 3 'UTRs como objetivos de miR-34a y -34c.
(a) QRT-PCR que muestra PDGFR-α y β-PDGFR ARNm regulación a la baja en Calu-6 y H1703 células después de miR-34 y miR-34c pero no miR-34b expresión forzada (b) miR-34a y la expresión forzada de miR-34c disminuye los niveles endógenos de los niveles de proteína /ß PDGFR-alfa en H1703 y Calu-6 NSCLC. Las células fueron transfectadas con cualquiera revueltos, miR-34a-34c o MIR durante 72 h. PDGFR-α y la expresión de PDGFR-β se evaluó mediante Western blot. Se obtuvo el control de la carga con anticuerpos GAPDH. * P & lt; 0,05, ** P & lt;. 0,001 por la prueba t de Student de dos de cola
Para verificar la regulación a la baja de miR-34a -34c y también
in vivo
, 9 tumores de pulmón (entre el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas) y los tejidos pulmonares histológicamente normal adyacente se analizaron para miR-34a -34c y expresión. Como se muestra en la Figura 3a yb, miR-34a y la expresión de miR-34c fue menor en el tumor en comparación con las muestras normales (Figura 3a, b).
(a-b) QRT-PCR, el 18 de pulmón tumor y los tejidos normales. MiR-34a y miR-34c están regulados a la baja en los tumores en comparación con los tejidos pulmonares normales. parcelas (c) de cajas de los miR-34a y la expresión de miR-34c en los tejidos normales y el cáncer de pulmón 48. parcelas (d) XY dispersión que muestra una correlación inversa entre el miR-34a /C y PDGFR-α /β. Dos colas se utilizó la prueba t de Student para verificar la significación. P & lt;.
0,05
Por otra parte, se analizaron miR-34a, 34c y la expresión de ARNm /β-α PDGFR en 24 muestras de tumores de pulmón humanos primarios en comparación con 24 tejidos normales. MiR-34a -34c y eran casi indetectables en el tumor y altamente expresado en las muestras de pulmón normal probado (Figura 3c). Sorprendentemente, una correlación inversa entre el miR-34a /C y PDGFR-α y β-PDGFR se observó (Figura 3d). Para corroborar estos resultados, la hibridación in situ (ISH) análisis se realizó utilizando sondas marcadas de LNA-5'-excavación en los tumores de pulmón y tejidos normales, seguido por inmunohistoquímica (IHC) para PDGFR-α y PDGFR. La mayoría de las células de cáncer de pulmón mostraron una baja expresión de miR-34a y alta expresión de PDGFR-α /β, mientras que el pulmón no malignas adyacentes expresó PDGFR-α y rara vez se expresa abundantemente miR-34a. MiR-34a y expresión /β-PDGFR α en la mayoría de los 107 tumores diferentes analizados fue básicamente excluyentes entre sí (Figura 4a, b y Figura S2 S1 en el archivo).
(a-b) La inmunohistoquímica y en hibridación in situ en 107 muestras de tejidos de cáncer de pulmón. MiR-34a (azul) y PDGFR-α /β (marrón /rojo, respectivamente, en cada uno de RGB y rojo fluorescente en Nuance convierte en una imagen) expresión fue inversamente proporcional en los cánceres de pulmón y los tejidos pulmonares normales adyacentes. Estas secciones en serie se analizaron para la expresión de miR-34a mediante hibridación in situ, seguido por inmunohistoquímica para PDGFR-α /β. (A) Representante ejemplo: análisis de co-expresión de miR-34a y PDGFR-α. Nota falta de expresión en la imagen resultante de la concentración (panel b) (amarillo fluorescente = co-expresión). (B) Ejemplo representativo: miR-34a = azul (panel a), PDGFR-β = rojo (panel b), la co-expresión = amarillo (panel c). RGB = Regular Verde azul de la reacción ISH /LHC se muestra en los paneles a-c. La barra de escala indica 50 micras. La ampliación es el mismo para todos los paneles.
miR-34a y miR-34c RUTA resistencia de superar las células NSCLC través de PDGFR-α y β-regulación a la baja PDGFR
TNF-relacionados ligando inductor de apoptosis (TRAIL) es un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral, se sabe que induce la apoptosis en una variedad de diferentes tipos de tumores. TRAIL es capaz de inducir específicamente la muerte celular en las células cancerosas sin dañar las células normales y se está probando actualmente como un agente anti-tumor prometedor en ensayos clínicos [22]. Sin embargo, muchos tumores incluyendo NSCLC son resistentes a TRAIL lo que limita su aplicación terapéutica. Desde PDGFR-α y PDGFR-β regulan la PI3K /Akt y Erk1 /2 vías [23,24,25], se examinaron siguiente, por inmunotinción, la expresión y /o activación de algunas de las proteínas implicadas en estas vías siguientes MIR -34a y miR-34c cumplir expresión o PDGFR-α /β silenciamiento de siRNAs. Como se muestra en la figura 5a, los niveles de fosforilación de ERK disminuyeron después de miR-34a y la expresión forzada miR-34c en comparación con las células transfectadas con el control de MIR. silenciamiento PDGFR-α reduce la activación de Akt tanto y ERK1 /2 (Figura 5b). Hemos demostrado anteriormente que la vía PI3K /AKT desempeña un papel clave en la apoptosis inducida por TRAIL [26], por lo tanto, se examinaron los efectos de miR-34a y la sobreexpresión de miR-34c en la supervivencia celular y la resistencia a la estela de NSCLC. En primer lugar, se realizó un ensayo de proliferación de células semi-resistentes Calu-6 y H1703 TRAIL después de la expresión de miR-34a y miR-34c forzadas. 48 horas después de la transfección las células fueron expuestas a TRAIL durante 24 h y luego la proliferación celular se evaluó mediante un ensayo MTT. células Calu-6 y H1703 que sobreexpresan el miR-34a y -34c mostraron una tasa significativa la proliferación menor en comparación con las células control (Figura s3a en Archivo S1). Por otra parte, la caspasa 3/7 ensayo reveló un aumento en la sensibilidad a TRAIL después de miR-34a y -34c cumplir expresión o silenciamiento PDGFR-α /β, en comparación con las células transfectadas con un revueltos de miR o siRNA (Figura 5c, d).
(a) Western blot en Calu-6 células después de miR-34a, -34b y -34c expresión forzada. MiR-34a-34c o MIR y no miR-34b forzada expresión disminuye PDGFRß niveles de expresión y reduce la activación de la ERK1 /2. (B) de transferencia de Western que muestra la inactivación de las vías Akt y ERK después de silenciamiento PDGFR-α. 3/7 de ensayo (c) de la caspasa. MiR-34a y la expresión forzada -34c en células semi-resistentes Calu-6 y H1703, aumenta la respuesta a la apoptosis inducida por TRAIL. 3/7 de ensayo (d) de la caspasa que muestra que PDGFR-α o el silenciamiento PDGFR-β aumenta la respuesta a la apoptosis inducida por TRAIL. (E) PDGFR-α o sobreexpresión PDGFR-β en las células sensibles a TRAIL H460 disminuye la respuesta al fármaco. (F) El tratamiento combinado de inhibidor de PDGFR (20 M) y diferentes concentraciones de TRAIL (0-100-150 ng /ml) durante 24 h sensibiliza a las células de NSCLC a la apoptosis inducida por TRAIL. * P & lt; 0,001, ** P & lt;.
0,05
Además, la sobreexpresión de PDGFR-α y β-PDGFR en células H460 sensibles a TRAIL, aumenta la resistencia al fármaco (Figura 5e y Figura S3c en S1 File). Por el contrario, el tratamiento de Calu-6 células con un inhibidor de PDGFR aumentó significativamente la sensibilidad a la apoptosis inducida por TRAIL (Figura 5f y la Figura S3d en S1 File). Curiosamente, la sobreexpresión de PDGFR-α o PDGFR-β (utilizando dos plásmidos que contienen sólo las secuencias codificadoras y no a los 3 'UTRs de PDGFR-α /β), junto con el miR-34a o miR-34c, disminución de la sensibilidad a la inducida por TRAIL apoptosis, según lo evaluado por tanto MTT y la caspasa 3/7 de ensayo (Figura S4 en S1 archivo). Los resultados sugieren que PDGFR-α y β-PDGFR desempeñan un papel importante en la apoptosis inducida por TRAIL y que inhibidor de PDGFR pueden sensibilizar a las células NSCLC rastro con importantes consecuencias terapéuticas.
Regulación a la baja
PDGFR-α /β por miR 34a y miR-34c inhibe la migración y la invasión de células de NSCLC
Debido a PDGFR-α /β regula la vía PI3K /AKT, especialmente implicado en la migración e invasión de diferentes tumores [27,28], se investigó si el miR -34a /c podría influir en la migración y la invasión a través de NSCLC PDGFR-α y β-regulación a la baja PDGFR. Para probar directamente el papel funcional de miR-34a /c en la tumorigénesis, overexpressed estos dos miRNAs o silenciado PDGFR-α /β en Calu-6 o H1703 células. Curiosamente, se observó una disminución significativa de las capacidades migratorias e invasivas de las células H1703 Calu-6 y después de miR-34a o sobreexpresión de miR-34c (figura 6a), así después de PDGFR-α y la regulación a la baja PDGFR-β (Figura 6b), confirmamos también mediante el ensayo de los arañazos de la herida (Figura 6c). A fin de verificar que PDGFR-α y PDGFR-β estaban implicados en la tumorigénesis de células de NSCLC, miR-34a y -34c se transfectaron en Calu 6 células solas o en combinación con un plásmido que sobreexpresa sólo la secuencia de codificación y no el 3 'UTR de PDGFR-α y PDGFR-β. MiR-34a /c expresión forzada reducción de la migración y la invasión de las células Calu-6, pero la sobreexpresión de PDGFR-α o PDGFR-β, junto con los dos microARN, parcialmente restaurado las capacidades de migración y la invasión, lo que sugiere que el miR-34a /c regular NSCLC tumorigénesis, al menos en parte, a través de PDGFR-α /β (Figura 6 d, e).
expresión (a) miR-34a y -34c cumplir reduce las capacidades migratorias e invasivas de las células H1703. (B) PDGFR-α y β-PDGFR silenciamiento reduce las capacidades migratorias e invasivas de Calu-6 células. RFU = unidades relativas de fluorescencia. (C) fotografías representativas de áreas rayadas de la monocapa confluente de células Calu-6 células transfectadas con miR-34a /c o control miARN (miR-CTR) en 0h, 12h y 24h después de la herida con una punta de pipeta. Barra de escala, 100 micras. La ampliación es el mismo para todos los paneles. (D-e) PDGFR-α y β sobreexpresión del PDGFR-rescata parcialmente capacidades migratorias e invasivas de Calu-6 células. * P & lt;. 0,05
Discusión
El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en hombres y mujeres en todo el mundo
1. La Sociedad Americana del Cáncer estima 156,940 muertes por cáncer de pulmón en los Estados Unidos para el año 2011 por sí sola [29]. cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es responsable de la mayoría de los casos de cáncer de pulmón y es la principal causa de mortalidad por cáncer [30].
La alta tasa de mortalidad asociada con el cáncer de pulmón ha llevado a numerosos esfuerzos exhaustivos a identificar nuevas dianas terapéuticas y modalidades de tratamiento para esta enfermedad mortal. receptores derivados de plaquetas factor de crecimiento (PDGFR) y sus ligandos, factores de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) juegan papeles críticos en la migración de células mesenquimales y la proliferación. Se cree que las anormalidades de PDGFR /PDGF de contribuir a una serie de enfermedades humanas y especialmente malignidad [31].
Los microARN son pequeños ARN no codificantes que muestran la desregulación en la mayoría de los cánceres. Existe una creciente evidencia de que juegan papeles importantes en la patogenia y pronóstico de tumores malignos humanos y en la resistencia a los fármacos quimioterapéuticos [32,33]. factor relacionado ligando inductor de apoptosis (TRAIL) de necrosis tumoral desencadena la apoptosis en las células tumorales, pero cuando se usa solo, es ineficaz en el tratamiento de tumores resistentes a TRAIL. Esta resistencia es un reto para las terapias contra el cáncer basadas-TRAIL. En este estudio, encontramos que el miR-34a y miR-34c están fuertemente downmodulated tanto en las células de NSCLC y tumores de pulmón en comparación con los tejidos normales. la expresión forzada de miR-34a y miR-34c downregulated PDGFR-α y β-PDGFR mRNA y los niveles de proteína. Luciferasa y Western Blot experimentos demostraron que PDGFR-α y β-PDGFR son blancos directos de miR-34a y miR-34c, pero no de miR-34b. La resistencia de muchos tipos de cáncer a quimioterapias convencionales es un factor importante socavar el tratamiento del cáncer con éxito. la activación de Akt también contribuye a la tumorigénesis y metástasis tumoral, y como se muestra más recientemente, la resistencia a la quimioterapia [26,34]. Como resultado, tanto
in vitro
y
in vivo
estudios sobre la combinación de inhibidores de moléculas pequeñas de la vía PI3K /Akt con la quimioterapia estándar han demostrado su eficacia en la atenuación de la resistencia a quimioterápicos. Específicamente, la inhibición de la actividad de Akt puede ser un enfoque válido para el tratamiento del cáncer y aumentar la eficacia de la quimioterapia.
quinasas de proteínas son importantes reguladores de la mayoría de las vías de señalización celular. Entre ellos, los receptores tirosina quinasas (RTK), tales como PDGFR, desempeñan papeles clave en la promoción del crecimiento y la proliferación celular por transducción de estímulos extracelulares a los circuitos de señalización intracelular [35]. Un componente importante de la maquinaria de señalización intracelular es la vía PI3K /Akt (PKB) Objetivo /la rapamicina en mamíferos (PI3K /Akt [PKB] /mTOR) vía [36,37]. activación aberrante de esta ruta por la mutación de cualquiera de los múltiples genes se sabe que ocurre en la mayoría de los cánceres humanos a través de diversos mecanismos de [38,39]. En un trabajo previo [26], hemos demostrado que el trato de economía, a través de la activación de la vía PI3K /AKT, la tumorigénesis inducida por TRAIL y la resistencia en el CPNM. Por lo tanto, la hipótesis de que PDGFR-α /β, a través de la activación de la ruta AKT debe estar involucrado en la apoptosis inducida por TRAIL. De hecho, la sobreexpresión de miR-34a y miR-34c o regulación a la baja de PDGFR-α /β de siRNAs, incrementa notablemente la respuesta de las células NSCLC semi-resistentes a la apoptosis inducida por TRAIL. Es importante destacar que, el tratamiento de un inhibidor de PDGFR con TRAIL, aumento de la apoptosis y la proliferación celular reducida combinado, según la evaluación de la caspasa 3/7 ensayos de ensayo y de MTT. Tomados en conjunto, los resultados sugieren que el tratamiento combinado de TRAIL con inhibidores de la PDGFR podría sensibilizar un subconjunto de tumores de pulmón, que expresan los receptores de PDGF, a la droga. Por otra parte, es bien sabido que la PI3K /AKT, así como las /2 vías ERK1 regular la migración celular y la invasión de diferentes tipos de cáncer [40,41]. Aquí, se informó de que miR-34a y la sobreexpresión de miR-34c o PDGFR-α silenciamiento /β inhibieron la capacidad de migración y la invasión de Calu-6 y H1703 células, en comparación con las células transfectadas con un control de miR o siRNA revueltos. la expresión forzada de PDGFR-α o β-PDGFR restauró parcialmente la migración y la invasión de apoyo NSCLC que la regulación de la expresión de estos receptores por miR-34a /C juega un papel importante en la tumorigénesis NSCLC. Sin embargo, reconocemos que otros objetivos de miR-34a /c incluyendo c-Met [16] y Axl [42] también podrían estar involucrados. Si bien este manuscrito estaba en preparación Silber et al. informado de que la expresión de miR-34a fue menor en los gliomas proneurales en comparación con otros subtipos de tumores identificados y PDGFR-α como un objetivo directo de miR-34a [43]. En este caso, nos informan de que no sólo el miR-34a-34c, pero MIR también regula a la baja PDGFR-α en las células NSCLC. Por otra parte, se demuestra que PDGFR-β es un /blanco directo c miR-34a, mientras que no hemos visto ningún efecto significativo sobre la expresión de PDGFR-α y β-PDGFR después de miR-34b expresión forzada. Sorprendentemente, nuestro estudio demuestra que la inhibición o regulación a la baja de PDGFR-α y PDGFR-β por miR-34a /c antagoniza tumorigenicidad y aumenta la sensibilidad a la muerte celular inducida por TRAIL con aplicación terapéutica importante para el futuro la terapia anti-tumoral de cáncer de pulmón.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de pulmón y muestras de tejido
H460 humano, A549, las líneas celulares H1299, H1703 se cultivaron en medio RPMI que contiene 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) y con 2 mM de L-glutamina y 100Uml-1 de penicilina-estreptomicina. Calu-6 células se cultivaron en MEM suplementado con suero bovino fetal al 10%, 2 mM de L-glutamina y 100Uml-1 de penicilina-estreptomicina. 9 tumores pulmonares (incluyendo el adenocarcinoma y el carcinoma de células escamosas) y sus homólogos normales fueron amablemente proporcionados por el Dr. S. P. Nana-Sinkam, pulmonar, alergia, Cuidados Críticos y Medicina del Sueño, El Centro Integral del Cáncer de la Ohio State University, Columbus, OH. muestras de tejido normal y tumor de pulmón 48 se proporcionan desde el Departamento de Patología, Universidad del Estado de Ohio. Todos los tejidos humanos se obtuvieron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Estado de Ohio.
luciferasa ensayo
3 'UTRs de los PDGFRA y PDGFRB genes humanos, se amplificaron por PCR utilizando la siguiente cebadores:
PDGFR-α FW 5 'TCTAGACCG GCCTGAGAAACACTATTTGTG 3'
PDGFR-α RW 5 'TCTAGAACATGAACAGGGGCATTCGTAATACA 3 "
PDGFR-β FW 5' TCTAGAAAAGAGGGCAAATGAGATCACCTCCTGCA 3 '
PDGFR-β RW 5 'TCTAGATATTGAGAACCCACTCTCCCTCCTTGGA 3'
y clonado aguas abajo de la luciferasa de Renilla codón de parada en el vector pGL3 control (Promega). Estas construcciones se utilizaron para generar, mediante PCR inversa, los p3'-UTRs- mutantes-plásmidos usando los siguientes cebadores:
PDGFR-α mut1 FW 5 'ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATCGCCTCG 3'
PDGFR-α mut1 RW 5 'CGAGGCGATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT
PDGFR-αmut2 FW: 5' ACTGCCAAAACATTTATGACAAGCTGTATGGTCGTTTATATTT 3 '
PDGFR-RW αmut2: 5' AAATATAAACGACCATACAGCTTGTCATAAATGTTTTGGCAGT 3 '
PDGFR-β Mut FW 5' -ATGGGGGTATGGTTTTGTCAGACCTAGCAGTGAC-3 '
PDGFR-β Mut RW 5'-GTCACTGCTAGGTCTGACAAAACCATACCCCCAT-3'
Calu-6 células se cotransfectaron con 1 g de p3'UTR-PDGFR-α, p3 'UTR-PDGFR-β o con p3'UTRmut-PDGFR-α y p3'UTRmut-PDGFR-β, 1 g de una expresión de la luciferasa de Renilla construyen pRL-TK (Promega) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se recogieron 24 horas después de la transfección y se ensayaron con Dual Luciferase Assay (Promega) según las instrucciones del fabricante. Tres experimentos independientes se realizaron por triplicado.
Western Blot Analysis
proteínas totales de NSCLC se extrajeron con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (0,15 mM NaCl, 0,05 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1% de Triton, 0,1% SDS, 0,1% desoxicolato de sodio y 1% Nonidet P40). extracto de la muestra (50 mg) se resolvió en 7,5 a 12% en geles de SDS-poliacrilamida (PAGE) utilizando un aparato de mini-gel (Bio-Rad Laboratories) y se transfirió a Hybond-C nitrocelulosa extra. Las membranas se bloquearon durante 1 hora con leche en polvo desnatada al 5% en solución salina tamponada con Tris que contiene 0,05% de Tween 20, se incubaron durante la noche con el anticuerpo primario, se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario, y se visualizaron por quimioluminiscencia. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-PDGFR-α, anti-PDGFR-β, anti-ERK1 /2, anti-p-ERK, anti-pAKT, AKT anti-total de, los anticuerpos anti-GAPDH (Señalización Celular). Se utilizó un anti-conejo o anti-ratón inmunoglobulina secundaria G (IgG) conjugado con peroxidasa de anticuerpos (Chemicon).
PCR en tiempo real
PCR en tiempo real se realizó utilizando un TaqMan PCR estándar kit de protocolo en un sistema de Applied Biosystems 7900HT de detección de secuencias (Applied Biosystems). El 10 l de reacción de PCR incluía 0,67 l RT producto, 1 l TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems), sonda TaqMan 0,2 mM, cebador directo 1,5 mM y 0,7 mM de cebador inverso. Las reacciones se incubaron en una placa de 96 pocillos a 95
° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de 95
° C durante 15 s y 60
° C durante 1 min. Todas las reacciones se realizaron por triplicado. El ciclo umbral (CT) se define como el número de ciclo fraccional al que la fluorescencia pasa el umbral fijo. Se utilizó el método CT comparativa para la cuantificación relativa de la expresión génica (Applied Biosystems) para determinar los niveles de expresión de genes miARN. El eje y representa el 2 (-ΔCT), o la expresión relativa de los diferentes miRs. MIRS expresión se calculó en relación al U44 y U48 rRNA. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado para cada punto de datos, y se realizó el análisis de datos mediante el uso de software (Bio-Rad).
La muerte celular y la proliferación celular cuantificación
Para la detección de caspasa 3/7 actividad, las células se cultivaron en placas de 96 pocillos, por triplicado, se trató con TRAIL (100-150ng /ml) y se analizó usando la caspasa-Glo 3/7 kit de ensayo (Promega) según las instrucciones del fabricante. Las variables continuas se expresan como valores medios ± desviación estándar (S. D.). La viabilidad celular se examinó con 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-dipheniltetrazolium (MTT) -Cell Titer 96 Una solución acuosa Ensayo de proliferación celular (Promega), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células metabólicamente activas se detectaron mediante la adición de 20 l de MTT a cada pocillo. Después de 1 h de incubación, las placas se analizaron en un contador Multilabel (Bio-Rad Laboratories).
Anti-PDGFR-alfa y siRNAs de transfección anti-PDGFR-β
Las células se cultivaron a 50% de confluencia y se transfectaron transitoriamente durante 72 h utilizando Lipofectamine 2000 con 100 nM anti-PDGFR-α y /o con 100 nM anti-PDGFR-β SmartPool siRNAs o el control de siRNAs (Dharmacon), un grupo de cuatro diana específica 20-25 nt siRNAs diseñado para derribar la expresión génica.
Mirna ácido nucleico cerrado hibridación in situ de formol fija, embebido en parafina sección de tejido
en la hibridación in situ (ISH) se llevó a cabo en los tejidos pulmonares humanos desparafinados utilizando previamente protocolo publicado [44], que incluye una digestión en pepsina (1,3 mg /ml) durante 30 minutos. La secuencia de la sonda que contiene el ácido nucleico dispersado bloqueado (LNA) bases con digoxigenina conjugado con el 5 modificado 'final fue: 5' ACAACCAGCTAAGACACTGCCA 3 '. El cóctel de tejidos y miRNA sonda se co-desnaturalizados a 60
° C durante 5 minutos, seguido por hibridación a 37
° C durante la noche y un lavado de rigurosidad en 0,2X SSC y 2% de albúmina de suero bovino al 4
° C durante 10 minutos. 0.05.