Extracto
Adquirido quimio-resistencia es uno de los principales factores causales de muerte por cáncer. nuevas evidencias sugieren que los genes miARN y la transición epitelio-mesenquimal juegan un papel crítico en la quimio-resistencia en los cánceres. Aquí, hemos demostrado la asociación de paclitaxel-resistencia con el miR-375 sobre-expresión y la incitación transición epitelio-mesénquima en el cáncer de cuello uterino. El uso de diferentes modelos celulares de cáncer de cuello uterino, se encontró que el paclitaxel induce transitoriamente sobre regulación de la expresión de miR-375, la inhibición de la proliferación, la transición de epitelio a fenotipo mesenquimal, y por consiguiente alteración de la sensibilidad paclitaxel. Forzada sobre-expresión de miR-375 puede suprimir la expresión Ecadherin por una vía de orientación directa, lo que llevó a la resistencia a paclitaxel. Por el contrario, re-expresión de Ecadherin revirtió parcialmente fenotipo transición epitelio-mesenquimal y miR-375 inducida por el paclitaxel-resistencia. Nuestros hallazgos sugieren que el paclitaxel inducida por el miR-375 sobreexpresión facilita el proceso de transición epitelio-mesenquimal a través de la orientación directa Ecadherin, inhibición de la proliferación, y por lo tanto da lugar a la quimio-resistencia en células de cáncer cervical. Una reversión de la expresión de miR-375 o Ecadherin puede ser un nuevo enfoque terapéutico para la superación de la quimiorresistencia en cáncer de cuello uterino
Visto:. Shen Y, Zhou J, Li Y, YE M, X Wan, Lu W, et al. (2014) miR-375 mediada por la quimio-resistencia adquirida en el cáncer cervical mediante la facilitación de la EMT. PLoS ONE 9 (10): e109299. doi: 10.1371 /journal.pone.0109299
Editor: Zhi-Ming Zheng, Instituto Nacional de Salud - Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 28 Octubre, 2013; Aceptado 10 de septiembre de 2014; Publicado: 16 de octubre 2014
Derechos de Autor © 2014 Shen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Los autores le gustaría reconocer el apoyo financiero continuo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvención Nº 81172475 y 81172474), la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Zhejiang de China (Nº conceder Z2110056, LQ13H160005 y Y2110206). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
evidencias emergentes han revelado que la quimio-resistencia está asociada con la transición epitelial mesenquimal (EMT) en las células cancerosas, y la adquisición de quimio-resistencia en las células cancerosas está acompañada por una transición de un epitelial a un fenotipo mesenquimal [ ,,,0],1] - [3]. Por ejemplo, varios tipos de cáncer resistentes a los fármacos, incluyendo células de cáncer colorrectal oxaliplatino resistente a [4], las células de cáncer de ovario resistentes a paclitaxel [5], y las células de cáncer de pulmón gefitinib resistente a [6], presentan la transición de epitelio a fenotipo mesenquimal a lo largo con una pérdida de la molécula de adhesión epitelial Ecadherin y una ganancia de marcadores mesenquimales como la vimentina, Ncadherin, y fibronectina. Estudios más recientes han demostrado también que los agentes de quimioterapia pueden facilitar la epitelial a una transformación fenotípica mesenquimales en células de cáncer sobreviviente residuales que pueden ser uno de los pasos críticos en la resistencia a fármacos adquirida en tipos de cáncer [7], [8]. Por lo tanto, adquisición de EMT convierte en un proceso clave que contribuye a los fenotipos malignos de células cancerosas en la resistencia a la quimioterapia. Por lo tanto, la intervención del proceso de EMT se ha propuesto como un enfoque terapéutico contra la quimio-resistencia adquirida.
Los microARN (miARN) actuar como importantes reguladores de genes en los genomas humanos y su expresión aberrante puede promover no sólo Tumori-génesis y la agresividad del tumor, sino también la resistencia a la quimioterapia [9]. Más recientemente, los estudios han revelado que los miRNAs juegan un papel integral en la modulación de la EMT, como miR-200 que regula la EMT a través de la inhibición de ZEB1 /2, un represor de la transcripción de Ecadherin [1], [10], [11]. Recientemente hemos informado de que la expresión de miR-375 se redujo en células de cáncer cervical [12] y aplicado sobre-expresión de miR-375, inhibió la proliferación y bloqueó G1-S transición del ciclo celular [13]. En otro estudio, se observó, además, que el miR-375 fue hasta reguladas en las células y tejidos del cuello uterino tratados con paclitaxel, y obligó a la sobre-expresión de miR-375 disminución de la sensibilidad de paclitaxel en el cáncer de cuello de útero [14]. Sin embargo, la resistencia a los medicamentos regulados mecanismo molecular preciso subalterno de miR-375 que queda por explorar. Por el miARN dirigido a la predicción de genes, encontramos un sitio de unión entre el miR-375 y Ecadherin 3'-UTR, lo que indica que Ecadherin era un objetivo potencial directo de miR-375. Por lo tanto, suponemos que el miR-375 puede participar en la regulación de la EMT y adquirió paclitaxel-resistencia en células de cáncer cervical.
En el presente estudio, encontramos por primera vez que el paclitaxel inhibe la proliferación, induce la EMT, y hasta : regula la expresión de miR-375 de forma simultánea en las células de cáncer de cuello uterino. Y miR-375 sobreexpresión inhibe directamente la expresión Ecadherin y facilitó paclitaxel-resistencia. Por lo tanto, hay un mecanismo distinto positiva retroalimentación entre paclitaxel, miR-375, y EMT que conduce a fenotipos quimio-resistencia adquirida en células de cáncer de cuello uterino. Tales resultados un bucle de retroalimentación reguladora en el miR-375 sobre-expresión, el epitelio a una transformación fenotípica mesenquimales, y por consiguiente adquisición de paclitaxel-resistencia. De todos modos, se podría cree que un descanso de un bucle de retroalimentación tal sería, al menos en parte, superar -Resistencia quimioterapia en el cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
Pacientes y muestras
Las muestras de tejido de cáncer se obtuvieron de 23 pacientes con carcinoma de células escamosas del cuello uterino con la FIGO (2009) en estadio IB
2 o IIA
2 que se sometieron a la quimioterapia neoadyuvante seguida de histerectomía radical de tipo III del 1 de noviembre, 2008 y el 30 de mayo de 2010 en el hospital de Mujeres, la Escuela de Medicina de la Universidad de Zhejiang. La colección de todas las muestras fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica del Hospital de Mujeres, Facultad de Medicina, Universidad de Zhejiang y se obtuvieron los consentimientos informados escritos.
Todos los pacientes fueron sometidos a 2 ciclos de quimioterapia neoadyuvante intravenosa ( paclitaxel 135 mg /m
2 y 75 mg /m
2, intervalo de 3 semanas) antes de la cirugía. El efecto de la quimioterapia se evaluó de acuerdo con los criterios de evaluación de respuesta en tumores sólidos (RECIST) [15] como se ha descrito anteriormente
14. De los 23 pacientes, con una media de edad fue de 36,5 años (rango 20 a 65 años), tenía muestras pre y post-quimioterapia de tumores de cuello uterino. La composición específica de cada muestra se determinó por un patólogo experimentado.
Cultivo de células y EMT aliciente
Dos líneas celulares de cáncer cervical humano, SiHa y CaSki se cultivaron como se ha descrito anteriormente
14. TGF-β1 recombinante humano y EGF-β se obtuvieron de ProSpec-Tany Techno Gen Ltd (Israel), utilizados respectivamente a una concentración final de 5 ng /ml y 2 ng /ml. Las líneas celulares de cáncer se sembraron 1 x 10
5 /pocillo en placas de 6 pocillos y se incubaron en medio libre de suero durante la noche, y luego tratados con TGF-β1 o EGF-β durante 72 h, respectivamente, para inducir la EMT.
la extracción de RNA y en tiempo real RT-PCR
ARNs totales que contienen miRNAs fueron extraídos de los tejidos conservados de nitrógeno líquido o las células recolectadas utilizando 1 ml de reactivo Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se sintetizó ADNc con el kit de reactivos PrimeScript RT (Takara Otsu, Shiga, Japón). RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) para miRNA y el ARNm se realizó como se ha descrito previamente
14. Las secuencias de todos los primers se dan en la Tabla 1.
Ensayo de proliferación celular y MTS Ensayo
Para determinar el efecto de miR-375 y paclitaxel sobre la proliferación de líneas de células del cuello uterino, la la proliferación de células se determinó con el ensayo MTT y el ensayo de proliferación de células CFSE CellTrace a las 24, 48, 72, 96 horas y 5 días, respectivamente. Para los experimentos de viabilidad, células de cáncer cervical con o sin 10 nM tratamiento con paclitaxel se sembraron 72 horas (SiHa, 3 × 10
3 /pocillo en placas de 96 pocillos y 2 × 10
5 placa /pocillo en 6 pocillos ; CaSki, 2 × 10
3 /pocillo en placas de 96 pocillos y 1 × 10
5 /pocillo en placas de 6 pocillos) y se cultivaron durante la noche. En el ensayo de MTT la absorbancia de las muestras se midió con un lector de espectrofotómetro a 490 nm. ensayo de proliferación celular CellTrace CFSE se realizó por tinción cáncer cervical activado con CellTrace CFSE colorante proliferación celular (2,5 M) (Invitrogen) y analizar usando por citometría de flujo con filtros de excitación y emisión de 488 nm. Un paclitaxel quimio-sensibilidad in vitro de células de cáncer cervical se evaluó usando el ensayo de MTS (Promega, Madison, WI) tal como se describe anteriormente [12]. Cuatro pocillos duplicados se utilizaron para cada análisis, y se realizaron al menos tres experimentos independientes.
Análisis Western Blot
Un total de 50 mg de proteína fue separada mediante la desnaturalización de 8-15% SDS-poliacrilamida electroforesis en gel. Se llevó a cabo análisis de Western como se describe anteriormente [12]. Las películas se analizaron mediante densitometría con un sistema de imágenes VersaDoc; Modelo 3000 (BioRad) utilizando un software Cantidad. Se utilizó el análisis de la varianza con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas para determinar la significación. Los anticuerpos primarios utilizados fueron anti-Ncadherin (1:5000), anti-Ecadherin (1:2000), anti-fibronectina (1:1000), anti-vimentina (1:1000) y anti-actina (1:2000) como control endógeno, todos de Epitomics Biotecnología (Epitomics).
la inmunohistoquímica
Secciones (6 m de espesor) de tejido tumoral se cortaron de paraffinised 23 parejas de auto-emparejado pre-y post-quimioterapia muestras cervicales cáncer, y el análisis de inmunohistoquímica y de puntuación fueron descritas anteriormente
12. Los anticuerpos primarios utilizados para el análisis de inmunohistoquímica fueron anti-Ecadherin anticuerpo (1:1000) y el anticuerpo anti-actina como control endógeno (1:2000), ambos de Epitomics Biotecnología (Epitomics).
construcción Lentivirus y transfección
Para generar el miR-375 y Ecadherin sobre-expresión de transfectantes estables, células de cáncer cervical fueron transfectadas con vectores lentivirales que expresan. La construcción del plásmido y el paquete de lentivirus estaban completas en GENECHEM Company. Las secuencias pre-miR-375 se amplificaron y se clonaron en el vector pGCsil-GFP usando los siguientes cebadores: (hacia adelante) HSA-pre-miR-375-XhoI-F, ACCGCTC GAGCCCCGCGACGAGCCCCTCGC; (Marcha atrás) HSA-pre-mi-R-375-R-MfeI, ACCGCAATTGAAAAAGCCTCACGCGAGCCGAACG. El CDH1-HSA (CDS) de genes se amplificó y se clonó en un vector de PGC-FU-GFP usando los siguientes cebadores: (hacia adelante) 5'-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGGGCCCTTGGAGCCGCAG-3 ', (marcha atrás) 5'-TCATCCTTGTAGTCGCTAGCGTCGTCCTCGCCGCCTCCGTACATG-3'. Los virus envases se realizaron en células HEK 293 células T después de la cotransfección de 20 mg pGCsil-GFP-pre-miR-375 vector o vector de PGC-GFP-CDH1 con 15 mg del plásmido de empaquetamiento pHelper 1.0 Vector y 10 mg de la pHelper plásmido de la cubierta 2,0 vector usando Lipofectamine 2000. Los virus se cosecharon 48 h después de la transfección, y se determinaron los títulos virales. Los títulos de la vírico utilizado en este estudio estaban en el rango de 5 x 10
8~2 × 10
9 TU /ml.
Para generar el miR-375 y Ecadherin sobre-expresión estable transfectantes, células de cáncer cervical fueron transfectadas con vectores lentivirales que expresan tal como se describe anteriormente [12]. Un MOI = 5 se utilizó para SiHa y MOI = 10 se utilizó para CaSki. Después de 4~7 d de la transfección, se seleccionaron clones estables con GFP mediante citometría de flujo y se cosechan para la experimentación adicional. Un vector de PGC-FU GFP-NC-LV vacía se utilizó como control negativo.
Ensayo de la actividad de luciferasa
Para investigar si la expresión de CDH1 fue regulada por el miR-375, un psicheck-2 de doble -luciferase miRNA vector de expresión diana (psicheck-2-UTR vector) se utilizó para realizar el ensayo de actividad de luciferasa. El salvaje y mutante tipo 3'-UTR de CDH1 contiene predijo miR-375 sitio de unión se sintetizó y se insertó en la región 3'-UTR de aguas abajo del gen de la luciferasa de luciérnaga de psicheck-2 vector (psicheck-2-UTR) utilizando el Xho sitios de restricción NotI I y I. Todas las construcciones fueron verificadas por secuenciacion. Después de cotransfectadas con miR-375 imita (20 uM) y vectores informadores (0,2 g /ml), se midieron las actividades de luciferasa a las 24 horas utilizando un sistema Dual-Glo de ensayo de luciferasa (Promega). la actividad de luciferasa relativa en todas las cifras se refiere a Firefly luciferase actividades normalizadas de la luciferasa de Renilla. Las células con valores vacíos psicheck-2 vector se establecieron por igual a 1.
Análisis estadístico
Los experimentos se repitieron al menos tres veces. Los resultados se expresan como media ± s.e.m. La prueba t de un estudiante independiente o un ANOVA se utilizó para comparar las variables continuas. Se utilizó la prueba coeficiente de correlación de Pearson para evaluar la correlación entre dos variables continuas. P & lt;. 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
EMT inducida por paclitaxel inhibió la proliferación y simultáneamente en células de cáncer cervical
Cuando la morfología de las células de cáncer de cuello uterino rutinariamente cultivadas tratadas con o sin paclitaxel fueron examinadas por microscopía, se observó que las células SiHa creció tan bien repleto "de adoquines" -como las células epiteliales, mientras que las células tratadas con paclitaxel parecieron una forma de huso como aplanado y perdieron la mayoría de sus contactos célula-célula. (Figura 1a) Mientras tanto, la expresión de la proteína Ecadherin se redujo (10,5% ~66.6% y 43,75% ~67.6% bajo 5 nM a 20 nM tratamiento con paclitaxel, respectivamente) y las expresiones de Ncadherin y la proteína fibronectina se incrementaron en una dosis-sensible manera. También se observaron (Figura 1b) efectos similares en las células CaSki. (Figura 1b, la figura S1).
(a) cambios morfológicos visibles de "adoquines" -como a "fibroblasto" -como se observó en las células SiHa a las 72 h del tratamiento con paclitaxel. Las células representativas con cambios morfológicos fueron etiquetados (b) Immunoblotting midió la expresión de Ecadherin y otras proteínas relacionadas EMT (vimentina, Ncadherin, y fibronectina) en células de cáncer cervical (SiHa y CaSki) bajo diferentes cantidades (0, 5, 10, 20 nM) de tratamiento con paclitaxel. La expresión de la proteína Ecadherin se redujo y las expresiones de la vimentina, Ncadherin, y la proteína fibronectina se incrementaron en las células tratadas con paclitaxel durante 72 horas de una manera sensible a la dosis. Todas las expresiones de las proteínas se normalizaron a ß-actina y los datos en el gráfico de barras se presentan como media de las muestras triples de tres experimentos independientes. Todas las barras de error indican s.e.m. (** P≤0.01, * p = 0.05). se observaron (c, d) La inhibición de la proliferación celular transitoria y los cambios morfológicos inducidos por paclitaxel. Los cambios de proliferación en células SiHa y CaSki después de la administración de paclitaxel fueron analizadas por la proliferación CellTrace CFSE de células (c) y el ensayo de MTT (d) a las 24 h, 72 h, 96 h, día 5, día 7, día 14, y día 21, respectivamente. La tasa de proliferación de paclitaxel tratada SiHa y células CaSki se redujo significativamente en el día 7 y se restauran en día 21 después de la administración de paclitaxel. Las células CaSki sobrevivido fueron restaurados en morfología normal en el día 21 después de la administración de paclitaxel.
Además, una inhibición de la proliferación celular transitoria inducida por el paclitaxel se observó por citometría de flujo y MTT. células SiHa y CaSki fueron rutinariamente cultivadas con 10 paclitaxel nM, después de 72 horas, el paclitaxel se retiró y las células se cultivaron con medio completo de forma continua, posteriormente, los cambios de proliferación en células SiHa y CaSki antes y después de la administración de paclitaxel revelado en 24 h, 72 h, 96 h, día 5, día 7, día 14, y el día 21, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1c, 1d, la tasa de proliferación de las células tratadas con paclitaxel SiHa y CaSki en el día 7 se redujo significativamente (SiHa, p = 0,002 y p = 2,3 x 10
-5; CaSki, p = 3,1 × 10
-4 y p = 1,2 × 10
-5 respectivamente), en comparación con el de control en blanco, y restaurado a los niveles antes del tratamiento de drogas a día 21. al mismo tiempo, el "adoquines" -como cambios morfológicos inducida por paclitaxel en células sobrevivido también fueron restaurados a la morfología normal a día 21. estos hechos indican que el paclitaxel inhibe transitoriamente la proliferación e induce EMT simultáneamente en células de cáncer cervical, pero todos estos cambios de paclitaxel inducida invirtió después de la retirada del fármaco.
paclitaxel hasta regula el miR-375 durante la inducción de la inhibición de la EMT y la proliferación
Hemos explorado el miR-375 expresión que cambia implicado en la inhibición de la EMT y la proliferación inducida por el paclitaxel en células de cáncer de cuello uterino, y el efecto dependiente de la dosis de paclitaxel en clara miR-375 se observó sobreexpresión
14. Por otra parte, la expresión regulada en marcha progresiva de miR-375 alcanzó un máximo en el día 7 después de la administración de paclitaxel, paclitaxel disminuyó gradualmente después de removido y restaurado al nivel antes del tratamiento de drogas alrededor del día 21
14. Además, había una fuerte correlación negativa entre la expresión de miR-375 y la proporción relativa de la proliferación de células de cáncer cervical (SiHa, r = -0,472, P = 1,52 × 10
-3; CaSki, r = -0.835 , P = 3,03 × 10
-4). (Figura S2) Nuestros datos revelaron que el paclitaxel hasta reguladas expresión de miR-375 y inhibió la proliferación de manera simultánea en las células de cáncer de cuello uterino, pero tanto los cambios inducidos por paclitexel revirtieron después de la retirada del fármaco, lo que sugiere que algunas de las células del cáncer de cuello uterino sobreviven en paclitaxel, aunque probablemente arriba regulación de la expresión de miR-375 y la adquisición de fenotipos mesenquimales malignos, para luego desarrollar un potencial de disminuir la proliferación y resistir la toxicidad del fármaco. Estos correlación sugieren que el miR-375 sobreexpresión podría tener un papel causal en la EMT inducida por la quimioterapia.
miR-375 media la EMT atacando directamente a Ecadherin
Por miRDB y TargetScan análisis de los programas de búsqueda, nos encontrado un predicho unión de miR-375 con CDH1 (Ecadherin) 3'-UTR, lo que indica que Ecadherin era un objetivo potencial directo de miR-375 (Figura 2c). Para determinar además que Ecadherin es un gen diana de miR-375, que en primer lugar se analiza la relación entre Ecadherin y expresión de miR-375 en células de cáncer de cuello uterino con diferentes cantidades de tratamiento con paclitaxel. Como se muestra en la Figura 1b y la Figura S2, la expresión de miR-375 en las células fue marcadamente no regulada de una manera dependiente de la dosis durante el proceso de EMT paclitaxel inducida, así como la proteína Ecadherin y miR-375 de expresión se correlaciona inversamente (r = -0,752, P = 2,32 × 10
-4). A continuación, se utilizó adicionalmente la actividad de ensayo de luciferasa para confirmar la unión de miR-375 al extremo 3 'UTR de Ecadherin. (Figura 2c).
(a) las imágenes de contraste de fase de células de cáncer cervical infectadas con el vector lentivirus pre-miR-375 o negativo y el control en blanco. (B) la medición de inmunotransferencia de Ecadherin y EMT proteínas relacionadas con el cáncer de cuello uterino en tercells infectadas con el vector de lentivirus pre-miR-375 o negativo. (C) Un predijo la formación de dúplex entre CDH1 humana (Ecadherin) 3'-UTR y miR-375. Se observó una reducción de la actividad de luciferasa después de la cotransfección de Ecadherin 3'-UTR vector de tipo salvaje con el miR-375, pero no mutado o vector vacío (p = 0,014). Los datos de la a-c se presentan como la media de tríos muestras de experimentos independientes. Todas las barras de error indican s.e.m. (** P≤0.01, * p = 0.05).
Para probar si la sobre regulación de miR-375 contribuyó a paclitaxel inducida EMT, los efectos de miR-375 sobre-expresión de se evaluaron estos eventos. La expresión de miR-375 se analizó por PCR en tiempo real en la segunda semana, la tercera semana y el primer mes después de la pre-miARN transfección estable lentiviral. Como se muestra en la Figura 2a y 2b, el forzado sobre-expresión de proceso EMT inducida miR-375 en células de cáncer de cuello uterino, que se caracteriza por la adquisición de la morfología celular similar a fibroblastos, supresión de la expresión Ecadherin (65% ~69.2%), y la mejora de vimentina, Ncadherin, y la expresión de fibronectina, similar a los efectos observados en las células tratadas con paclitaxel.
por lo tanto, nuestros resultados indican que miR-375 sobre-expresión promueve EMT paclitaxel inducida en parte por la orientación directamente Ecadherin en el cáncer cervical las células.
EMT regula la sensibilidad paclitaxel, pero no la expresión de miR-375
Para determinar si la EMT puede regular la expresión de miR-375 a la inversa, la siguiente serie de experimentos se llevó a cabo. Inducimos EMT por el TGF-β1 o EGF-β en células de cáncer de cuello uterino (SiHa y CaSki) y observamos la influencia de la EMT en la sensibilidad a paclitaxel y miR-375 expresión. Estimulado por TGF-β1 o EGF-β, células de cáncer cervical EMT se sometieron acompañan cambios visibles morfológicas (figura 3A), como la apariencia de una forma de huso, como en las células, y EMT alteración marcador, incluyendo disminución de la expresión de la proteína Ecadherin (28,5% ~ 65,8% para TGF-β1 y 47,5% ~67.6% para EGF-β), así como una mayor Ncadherin, vimentina, y expresión de la proteína fibronectina (Figura 3c). Sin embargo, la expresión de miR-375 no ha cambiado durante el TGF-β1 o inducida por EGF β proceso de EMT en células de cáncer cervical (SiHa,
p = 0,538
; CaSki
p = 0,542
) (Figura 3d).
(a) cambios morfológicos visibles en SiHa y CaSki menores de TGF-β1 o inducción EGF-β. (B) el análisis de paclitaxel MTS-sensibilidad en células de cáncer de cuello uterino. (C) el análisis de inmunotransferencia de Ecadherin y otras proteínas relacionadas EMT después de TGF-β1 o la inducción del EGF-β. (D) el miR-375 expresión en SiHa y CaSki bajo el TGF-β1 o inducción EGF-β. Los datos de la b-d se presentaron como media de tríos muestras de experimentos independientes. Todas las barras de error indican s.e.m. (** P≤0.01, * p = 0.05).
Además, delineamos la sensibilidad a los fármacos de las células sometidas a EMT utilizando ensayo MTS. La sensibilidad paclitaxel fue significativamente menor en las células SiHa y CaSki después de TGF-β1 o estimulación EGF-β en comparación con los controles de cultivo libre de suero (Figura 3b). Los valores de IC50 se incrementaron en SiHa y CaSki con 5 ng /ml de TGF-β1 (95,81 ± 2,53 nM y 66,66 ± 2,32 nM, respectivamente, SiHa,
p
= 0,032; CaSki,
p
= 0,023) o 2 ng /ml estimulación EGF-β (96,74 ± 2,47 nM y 94,78 ± 1,72 nM, respectivamente, SiHa,
p
= 0,038; CaSki
p
= 0,028) en comparación con el suero controles de cultivo exento de (24,54 ± 1,37 nM, y 23,98 ± 2,62 nM, respectivamente).
Nuestros hallazgos indican que el TGF-β1 o EGF-β induce EMT, pero la dosis no alteran el miR-375 expresión en células de cáncer cervical, y células de cáncer cervical de células mesenquimales como inducida por TGF-β1 o EGF-β son normalmente resistentes a paclitaxel. La expresión significativamente upregulated de miR-375 en células tratadas con paclitaxel Caner cervicales es inducida por el paclitaxel, pero no EMT.
Ecadherin sobreexpresión atenúa la capacidad de miR-375 para mediar EMT y paclitaxel resistencia
Ecadherin no sólo es una molécula importante en la iniciación de la EMT, pero también una característica fundamental para la EMT y miR-375 medie EMT atacando directamente a Ecadherin.To investigar el papel de Ecadherin en EMT y la sensibilidad paclitaxel y para probar si la sobre regulación ofEcadherin se atenúa el efecto de miR-375 en la EMT y paclitaxel-resistencia en células de cáncer cervical; Ecadherin la sobre-expresada se utilizó lentviral vector de PGC-bandera-CDH1. Nos respectivamente transfectadas Ecadherin sobre-expresada vector lentviral y control negativo en las células SiHa y CaSki con y sin el miR-375 sobre-expresión, y observamos que el efecto de la sobreexpresión forzada Ecadherin en EMT y paclitaxel-resistencia. En Ecadherin sobre-expresión de clones con y sin miR-375 sobre-expresión, había un aumento pronunciado y significativo en la expresión de Ecadherin (Figura 4a). En las células sin el miR-375 sobre-expresión, no se observaron diferencias notables de marcadores morfología y mesenquimales en células SiHa y CaSki después Ecadherin expresión excesiva, que es probablemente debido a que sus células parentales ya exhiben un fenotipo epitelial. Por el contrario, en las células con miR-375 sobre-expresión, hubo una transición de células fibroblásticas aisladas para "adoquines" -como células epiteliales. Mientras tanto, las expresiones de Ncadherin, vimentina, fibronectina y se redujo significativamente después de Ecadherin la sobre expresión (Figura 4a, 4c).
inmunotransferencia (a) y MTS (b) el análisis de Ecadherin y otras proteínas relacionadas con EMT en SiHa con y sin sobreexpresión de miR-375 después de la transfección de vectores lentivirus Ecadherin que expresan o negativo. Los datos en (a) y (b) se presentan como la media de tríos muestras de experimentos independientes. Todas las barras de error indican s.e.m. (** P≤0.01, * p≤0:05). (C) Los cambios morfológicos en SiHa con y sin el miR-375 sobre-expresión después de la transfección de vectores lentivirus Ecadherin que expresan o negativo. Las células representativas con cambios morfológicos se habían marcado.
El paclitaxel quimio-sensibilidad se evaluó a continuación mediante ensayos de MTS. Como era de esperar, la sensibilidad paclitaxel se incrementó significativamente en células lentvirus transfectadas Ecadherin con y sin miR-375 sobreexpresión en comparación con las células de control. Los valores de IC50 se redujo en SiHa y CaSki con Ecadherin sobreexpresión (12,82 ± 2,54 nM y 7,62 ± 0,93 nM, respectivamente, SiHa,
p = 0,043
; CaSki,
p = 0,038
) en comparación con controles negativos (20,73 ± 1,23 11,68 ± nm y 0,62 nm, respectivamente, SiHa,
p = 0,028
; CaSki,
p = 0,021
). Por otra parte, la resistencia paclitaxel fue significativamente atenuada después de Ecadherin era efectivamente sobre-expresado en las células del cuello del útero con sobre-expresado miR-375 en comparación con el control negativo (Figura 4b). Los valores de IC50 se redujo en SiHa y CaSki con Ecadherin y miR-375 co-transfección (22,82 ± 3,54 nM y 13,68 ± 0,64 nM, respectivamente, SiHa,
p = 0,033
; CaSki,
p =
0,038) en comparación con SiHa y CaSki con el control negativo y miR-375 co-transfección (82,83 ± 2,23 nM y 20,31 ± 3,01 nM, respectivamente, SiHa,
p = 0,032
; CaSki,
p = 0,025
). Nuestros resultados revelaron que Ecadherin sobre-expresión mejora de forma significativa la sensibilidad paclitaxel en células de cáncer cervical con o sin miR-375 sobre-expresión, lo que sugiere que Ecadherin sobre-expresión aumenta dramáticamente la sensibilidad paclitaxel, además, re-expresión de Ecadherin invierte, al menos en parte, el fenotipo de EMT y paclitaxel-resistencia mediada por el miR-375 en células de cáncer de cuello uterino.
miR-375 sobre-expresión se correlaciona con la expresión Ecadherin en los tejidos humanos después de la quimioterapia del carcinoma de cuello uterino
Para establecer la relevancia clínica de miR-375 entre las expresiones Ecadherin bajo los efectos de la quimioterapia, se evaluó el miR-375 y Ecadherin expresión en 23 parejas de auto emparejado tejidos de cáncer cervical humano pre y post-quimioterapia. La inmunotinción para Ecadherin reveló una mayor y mejor expresión en pre-quimioterapia que en los tejidos tumorales después de la quimioterapia (Figura 5). Al mismo tiempo, miR-375 se upregulated notablemente (4,67 veces) en muestras cervicales tratados con paclitaxel, Ecadherin y miR-375 de expresión se correlacionan inversamente en todos los tejidos incluyendo pre y post-quimioterapia (r = -0,905, P = 1,81 × 10
-3) (Tabla S1).
(a) Ecadherin y miR-375 expresión se correlacionó inversamente en todos los tejidos, incluyendo pre-y post-quimioterapia (r = -0,905, p = 1,81 × 10
-3). (B) La tinción de expresión Ecadherin humano específico en tres representantes (1 PD y 2 PR) (× 200). Una expresión Ecadherin disminución se demostró en los tejidos después de la quimioterapia (p = 0,0023).
De los 23 pacientes, 19 eran sensibles a la quimioterapia y 4 quimio-resistencia, la expresión regulada por incremento de miR-375 es más significativamente en pacientes con quimio-resistencia en comparación tejidos post-quimioterapia con su auto emparejaron los tejidos pre-quimioterapia (6,7 ± 2,3 veces en la quimio-resistencia y 4,35 ± 0,63 veces mayor en los pacientes sensibles a la quimioterapia, respectivamente,
p = 0,033
) . Sin embargo, cabe señalar que no hay energía suficiente para concluir que la expresión de miR-375 es mayor en pacientes quimio-resistencia, en parte debido al pequeño tamaño de la muestra para los pacientes quimio-resistencia (N = 4).
Discusión
quimio-resistencia es uno de los principales factores causales en las recaídas y progresión del cáncer. La mayoría de las células cancerosas responde bien inicialmente a la quimioterapia, pero finalmente se desarrolla la resistencia después de la exposición de drogas. evidencias emergentes han puesto de manifiesto que las células cancerosas se someten EMT promueve la supervivencia celular y la resistencia a la quimioterapia [3]. Aunque se ha informado de que miRNAs pueden desempeñar un papel integral en la modulación de EMT [16]; Sin embargo, de reglamentación detallada permanece sin explorar. miR-375 se encontró inicialmente que se expresa en los islotes pancreáticos, donde regula la secreción de la insulina y el metabolismo de la glucosa [17]. Recientemente, miR-375 fue identificado como un regulador importante en la tumorigénesis y la progresión del cáncer; sin embargo, las funciones precisas de este miARN permanecen en gran medida oscuros. miR-375 fue identificado como un supresor de tumores en la mayoría de los cánceres, como el cáncer gástrico [18], [19], cáncer de hígado [20], de cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas [21] y de próstata [22], pero las obras un papel oncogénico en cáncer de mama ER-positivo [23], en pacientes con adenocarcinoma de pulmón [24], y en pacientes con HCC VHB positivo [25]. Por lo tanto, estos informes contradictorios con respecto a la asociación entre el nivel de miR-375 y el cáncer sugirieron una relación específica más compleja y posiblemente cáncer. En otro estudio de la nuestra, se observó la asociación entre el miR-375 sobre-expresión y -Resistencia paclitaxel en cáncer de cuello uterino
16. En este sentido, enlazar directamente el miR-375 al proceso de EMT inducida por la quimioterapia en el cáncer de cuello uterino. Hemos encontrado por primera vez que el paclitaxel inhibe la proliferación, induce la EMT, y hasta regula miR-375 de expresión de una manera dependiente de la dosis simultáneamente en células de cáncer cervical, pero todos estos cambios de paclitaxel inducida invierten después de la retirada del fármaco. Mecánica, ectópico sobreexpresión de miR-375 dio lugar a la reducción de expresión Ecadherin y acompañado por características mesenquimales adquiridos y quimio-resistencia en células de cáncer cervical. Por lo tanto, nuestros hallazgos sugieren que el paclitaxel no elimina todas las células de cáncer cervical y algunas de las células residuales pueden sobrevivir bajo la exposición al fármaco. Durante este procedimiento, las células de cáncer cervical residuales con hasta reguladas expresión de miR-375 probablemente poseen un potencial de adquirir fenotipos mesenquimales, reducir la velocidad de proliferación, y resistir a la toxicidad del fármaco.