Extracto
Antecedentes
Los microARN actúan como reguladores de la expresión génica postranscripcional en muchos procesos biológicos. Sus desregulaciones ocurren comúnmente en el cáncer gástrico (GC). A pesar de que la metilación del ADN constituye un mecanismo importante para la desregulación de microARN en el cáncer, este campo se mantiene en gran parte inexplorado.
Metodología /Principales conclusiones
ARN total fue extraído de los tejidos de 100 pacientes con GC y cuatro gástrica líneas celulares de cáncer. Los niveles de expresión de miR-10a se determinaron mediante PCR en tiempo real con sondas TaqMan específicas. Por otra parte, se realizó un análisis funcional de miR-10a en la regulación de la proliferación celular, la migración y la invasión. se utilizó posteriormente, la metilación específica de PCR cuantitativa (qMSP) para detectar el estado de metilación del ADN en las islas CpG aguas arriba de
miR-10a
. En este estudio, se encontró que la expresión de miR-10a en las células GC fue menor que en las células normales, lo cual fue debido a la hipermetilación de las islas CpG aguas arriba de
miR-10a
. También se validó la expresión ligeramente inferior de miR-10a en los tejidos de GC que sus tejidos adyacentes no neoplásicas en 100 pacientes con cáncer gástrico y confirmó la hipermetilación de las islas CpG aguas arriba de
miR-10a
en algunos pacientes. Por otra parte, la reintroducción de miR-10a en células GC fue capaz de inhibir la proliferación celular, la migración y la invasión. Bioinformáticas y análisis de inmunoblot indican que las funciones supresoras de tumores de miR-10a en células GC eran posiblemente a través de la orientación HOXA1.
Conclusiones /Importancia
Nuestros datos indican que el miR-10a actúa como un supresor de tumores en células de GC y se silenció parcialmente por hipermetilación del ADN en GC, lo que sugiere que el miR-10a puede servir como una diana de diagnóstico o terapéutico potencial de GC
Visto:. Jia H, Zhang Z, Zou D, Wang B, Yan Y, Luo M, et al. (2014) microARN-10a es el regulado por la metilación del ADN y funciona como un supresor tumoral en células de cáncer gástrico. PLoS ONE 9 (1): e88057. doi: 10.1371 /journal.pone.0088057
Editor: Jorg Tost, CEA - Institut de génomique, Francia |
Recibido: 26 Enero, 2013; Aceptado: January 4, 2014; Publicado: 31 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Jia et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (2011, 91129716, a JY), el Beijing Municipal de Ciencia & amp; Tecnología de la Comisión (2010B071, a J.Y.), Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas (2009RC03, a J.Y .; 2010PYB06, a J.Y .; 2012G04, a J.Y.). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en el mundo [1]. Hasta el momento, se han reportado pocos genes supresores de tumores y genes relacionados con el tumor en GC. Aunque extensos estudios se han realizado para identificar las vías y mecanismos implicados en el desarrollo del cáncer genéticos, se han hecho algunas mejoras en el diagnóstico precoz del cáncer. MicroARNs (miRNAs) son endógenos pequeños ARN no codificantes que se han identificado como reguladores de la expresión génica posttranscriptional. Estudios anteriores han indicado que los miRNAs ejercen sus funciones a través imperfecta apareamiento de bases con la región 3 'no traducida (3'UTR) del ARNm diana [2] y miRNAs han sido ampliamente estudiados en el contexto de la regulación del ciclo celular, la diferenciación, el desarrollo y la apoptosis [3], [4]. La evidencia acumulada indica que los miRNAs están desreguladas en diversas enfermedades, especialmente en el cáncer. Por ejemplo, el miR-216b es notablemente las reguladas en el carcinoma nasofaríngeo [4]; miR-340 está desregulado en el cáncer de mama y puede inhibir la migración de células de cáncer de mama y la invasión [5]; y miR-31 se identificó como un oncogén en el carcinoma de células escamosas de esófago [6]. Tomados en conjunto, los miRNAs han sido identificados como candidatos potenciales para nuevos biomarcadores de diagnóstico o dianas terapéuticas de cáncer.
miR-10a se ha informado a desempeñar un papel importante en la génesis y el desarrollo de una variedad de cánceres humanos. Por ejemplo, el miR-10a está desregulado en la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas y también en el carcinoma hepatocelular [7], [8]. Además, en el cáncer cervical humano, miR-10a sirve como un oncogén mediante la regulación de CHL1 [9]; baja regulación de miR-10a en la leucemia mieloide crónica promueve CD34
+ células de proliferación [10]. Sin embargo, la función de miR-10a y el mecanismo subyacente carcinogénesis gástrica siguen sin estar claros. En este estudio, que mide con precisión la expresión de miR-10a en 100 pacientes con cáncer gástrico y se investigaron los papeles de miR-10a en células de cáncer gástrico. Encontramos que el miR-10a se había reducido regulado en los tejidos de GC y la expresión forzada de miR-10a reprimida la proliferación, la migración y la invasión de las células GC
.
Las modificaciones epigenéticas incluyendo la hipermetilación del ADN, la desacetilación de histonas y la metilación de histonas están estrechamente asociado con la inactivación de genes. hipermetilación del promotor se cree que es un mecanismo alternativo para regular a la baja los genes supresores tumorales en cánceres humanos [11]. MiRNAs cuya expresión está reprimida por la metilación del ADN se han reportado en algunos cánceres humanos [12] - [14]. Para investigar más a fondo si la baja regulación de miR-10a se origina de la hipermetilación de la región genómica aguas arriba de
miR-10a
, analizamos la metilación del ADN de la isla CpG en la región promotora de
miR 10a
en 55 pacientes con cáncer gástrico y se ha encontrado que la baja regulación de miR-10a en los tejidos GC podría ser debido a la hipermetilación de secuencias CpG en su promotor.
Materiales y Métodos
los pacientes las muestras y
muestras clínicas humanas se obtuvieron de muestras quirúrgicas a partir de 100 pacientes con CG en el Instituto del cáncer y el hospital de la Academia china de Ciencias médicas, hospital general del Ejército Popular de Liberación y el hospital del cáncer de Shanxi. Los correspondientes tejidos no neoplásicas adyacentes de la margen del tumor macroscópico se aislaron al mismo tiempo y se utilizan como controles. Los tumores se clasifican de acuerdo a la TNM (2010) Criterios de clasificación de la Unión Internacional contra el Cáncer (UICC). Todas las muestras se dividieron en dos partes e inmediatamente se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 ° C hasta la extracción de ARN. Cuatro líneas celulares de cáncer gástrico (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 y MKN-45) fueron todos preservados en nuestro laboratorio y mantenidos en DMEM o 1640 con 10% de SFB. El Comité Ético de Investigación Clínica del Instituto de Ciencias Médicas Básicas de la Academia China de Ciencias Médicas aprobó los protocolos de investigación y consentimiento informado por escrito se obtuvo de los participantes.
La extracción de RNA, síntesis de cDNA de mRNAs y miRNAs, y Real- los ensayos PCR en tiempo
ARN total fue extraído de los tejidos y las células de cáncer gástrico utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. RNA se cuantificó por absorbancia a 260 nm y se sintetizó ADNc de M-MLV transcriptasa inversa (Invitrogen) a partir de 2 g de ARN total. Oligo (dT) 18 se usó como los cebadores de RT para la transcripción inversa de ARNm. Un cebador RT tallo-bucle se utilizó para la transcripción inversa de los genes miARN. RT-PCR cuantitativa se realizó en un sistema de PCR (Bio-Rad, CA, EE.UU.) Bio-Rad CFX96 en tiempo real utilizando el kit SYBR Premezcla Ex Taq (Takara, Dalian, China) o TaqMan sondas (Applied Biosystems, Foster City, CA , EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante s. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s y 60 ° C durante 34 s. Para los ARNm, los datos se normalizaron mediante el control GAPDH endógeno. Para miRNAs, U6 snRNA se utilizó como control endógeno. La cantidad relativa de miR-10a se midió con el método -ΔΔCT 2
. Primer secuencias se presentan en la Tabla S1.
extracción de ADN, a partir de tejidos de cáncer de metilación específicos de PCR (MSP) y cuantitativo de metilación específicos de PCR (qMSP)
Se extrajo ADN genómico de alto peso molecular gástricos usando un equipo de extracción de ADN (biomédico, BJ, china) según las instrucciones del fabricante. modificación con bisulfito se realizó usando el kit de secuenciación de bisulfito Epitect (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con el protocolo. Hasta 2 g de ADN genómico fue usado como material de partida. Normal de ADN de linfocitos tratados con CpG metiltransferasa (M.SssI) (NEB, MA, EE.UU.) se utilizó como control positivo, y se utilizó un sistema de reacción sin ninguna plantilla como un control en blanco.
El sodio bisulfate- ADN tratado se amplificó usando el sistema de PCR (Bio-Rad) Bio-Rad CFX96 tiempo real usando Kits qPCR RÁPIDO KAPA SYBR® (Kapa Biosystems) con las siguientes condiciones: 95 ° C durante 5 min seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 54 ° C durante 30 s y 72 ° C durante 30 s y una extensión final a 72 ° C durante 10 min. GAPDH se utilizó como control interno. reacciones qMSP se realizaron por triplicado. El nivel de metilación en una muestra se estimó como Lu L et al. se describe [15]. Primer secuencias se presentan en la Tabla S1.
5-aza-2'- deoxyazacytidine Tratamiento
células de cáncer gástrico se sembraron en placas de 10 cm (1 × 10
6 células por placa) un día antes de tratamiento con fármacos. Las células fueron tratadas con 1 mM 5-aza-2'- deoxyazacytidine (5-AZA) (Sigma, MO, EE.UU.) cada 24 h durante 3 días.
Cultivo de células y transfección Los oligonucleótidos
Las líneas de células gástricas humanas HGC-27, SGC-7901 y MKN-45 se cultivaron en RPMI 1640 (Gibco, BRL, UK) medios suplementados con suero bovino fetal 10%, y MGC-803 se mantuvo en DMEM (Gibco, BRL , Reino Unido) suplementado con suero bovino fetal 10%. Estas líneas celulares se mantuvieron a 37 ° C en el aire humidificado que contiene 5% de CO
2.
El miR-10a mímica, la lucha imitan, siHOXA1 siRNA y revueltos siRNA fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, China ) y se transfectaron en las células a una concentración final de 50 nmol /L utilizando DharmaFECT1 Reactivo (Dharmacon, TX, EE.UU.).
proliferación celular y la formación de colonias de ensayo
los mimic- o siRNA- células transfectadas se sembraron en placas de 96 pocillos (5000 células /pocillo). Las células se incubaron con 10% CCK-8 (DOJINDO, Japón) a 37 ° C hasta que se produjo la conversión de color visual. las tasas de proliferación se determinaron a los 0, 12, 24, 48, 72, 96 horas después de la transfección.
Las células transfectadas se trataron con tripsina imitan y se volvieron a sembrar en 200 células por pocillo en placas de 6 pocillos y se mantuvieron en 1640 con 10% de FBS. Las células se cultivaron durante 7 días, se fijaron con metanol y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta en 20% de metanol durante 15 min.
apoptosis de las células de ensayo
Ensayos de apoptosis se realizaron en HGC-27 y líneas de células MGC-803 utilizando el kit Annexin V-FITC de detección de apoptosis I (BD Biosciences) de acuerdo con el protocolo del fabricante y después se analizaron por Calibur citómetro de flujo (Becton Dickinson).
migración celular y la invasión ensayos
Un ensayo de cicatrización de la herida se realizó para evaluar la migración celular. Una herida artificial fue creado en una monocapa de células confluentes sin FBS utilizando una punta de pipeta de 200 l de 24 horas después de la transfección. Para visualizar las células y la migración de la cicatrización de heridas, las imágenes fueron tomadas a los 0, 12, 24, 36, 48, 60 horas.
Células
Para los ensayos de invasión Transwell, HGC-27 y MGC-803 suspendidas en 0,2 ml de RPMI 1640 o DMEM sin FBS se colocaron en la cámara superior de cada inserto (Millipore, MA, EE.UU.) pre-revestido con 40 l de 1 mg /ml de Matrigel. La cámara inferior se llenó con 600 l de RPMI 1640 o medio DMEM con 10% de FBS como el atrayente nutricional. 24 horas después, las células de invasión unidos a la superficie inferior se fijaron con 20% de metanol y se tiñeron con May-Gruwald-Giemsa (MGG). Las membranas fueron talladas y embebidos bajo cubreobjetos. Las células en tres campos visuales diferentes se contaron, y todos los ensayos se realizaron por triplicado.
Western Blotting
análisis de transferencia Western se realizó de acuerdo con métodos estándar. Las proteínas fueron separadas por 10% SDS-PAGE y después se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham, Buckinghamshire, UK). Las membranas se bloquearon durante la noche con leche en polvo al 5% sin grasa y se incubaron durante 2 h con un anticuerpo anti-HOXA1 (Bioworld, MN, EE.UU.) a 1:500 diluciones o anticuerpo anti-GAPDH (Proteintech, Chicago, EE.UU.) a 1: 50.000 diluciones. Después de lavar con TBST (Tris 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, y 0,1% de Tween 20), las membranas se incubaron durante 2 h con el anticuerpo secundario (zsgb-bio, Beijing, China).
Estadísticas
Cada experimento se repitió al menos tres veces. Se llevaron a cabo la prueba de la t de Student (dos colas) y la x
2 de prueba, y la significación estadística se definió como α = 0,05 (dos lados). Las medias ± SD se muestran en las figuras.
Resultados
miR-10a es el regulado en células de cáncer gástrico
Se examinó la expresión de miR-10a madura en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico humano (HGC-27, MGC-803, SGC-7901 y MKN-45) y una línea celular de epitelio gástrico humano (GES). El nivel de expresión de miR-10a en GES fue significativa más alta que los niveles en las dos líneas celulares de cáncer gástrico (HGC-27 y MGC-803) y fue mayor no significativamente, pero observable que los niveles en las otras dos líneas celulares de cáncer gástrico (MKN-45 y SGC-7901) (Fig. 1a). Estos datos sugieren que la baja regulación de miR-10a podría ser relevante para la génesis y desarrollo de la GC.
a La expresión de miR-10a en cuatro líneas celulares de cáncer gástrico humano (HGC-27, MGC- 803, SGC-7901 y MKN-45) y una línea celular humana gástrica epitelio (GES) se detectó mediante PCR en tiempo real con sondas TaqMan. b La expresión de miR-10a en 100 pares de tejidos GC en comparación con sus tejidos adyacentes no neoplásicas emparejados. c La expresión de miR-10a en los tejidos GC fue menor que en los tejidos adyacentes, aunque no hubo diferencias estadísticamente significativas. P = 0,148, prueba t pareada, de dos colas. U6 snRNA se utilizó como control endógeno.
La expresión de miR-10a en pacientes clínicos de GC y su correlación con las características clinicopatológicas
Para estudiar más a fondo la relación entre el miR-10a y GC génesis, que detecta la expresión de miR-10a en 100 pacientes clínicos por TaqMan sonda derivada de PCR en tiempo real como se describió anteriormente. De los 100 pares de muestras de GC, la expresión de miR-10a se había reducido regulado en 58 casos (58/100, 58%) en comparación con los tejidos adyacentes correspondientes (Fig. 1b). En general, la expresión de miR-10a se había reducido regulado en los tejidos de GC en comparación con los tejidos adyacentes, a pesar de la baja regulación no fue estadísticamente significativa (p = 0,148, prueba t pareada, de dos colas) (Fig. 1c).
para evaluar la correlación entre la expresión de miR-10a y las características clínico-patológicas, los pacientes fueron divididos en dos grupos de acuerdo con la expresión relativa de miR-10a en tejidos de cáncer de acuerdo con un artículo publicado anteriormente [16] . Como se muestra en la Tabla S2, se observó una asociación estadísticamente significativa entre los dos grupos TNM. Hay más pacientes que están en fase de I + II en el grupo con menor expresión de miR-10a en sus tejidos GC. Esta relación indica que el miR-10a puede ser más importante en la carcinogénesis del cáncer temprano. Sin embargo, nuestros datos demuestran que el nivel de expresión de miR-10a no tiene correlación con la edad, sexo, tipo histológico, el porcentaje tumoral, invasión venosa, invasión del nervio, la posición, la tipificación Borrmann, estadio pT, pN fase o etapa pM.
miR-10a inhibe la proliferación celular
in vitro
Para explorar el papel de miR-10a en la carcinogénesis gástrica, transfectadas de miR-10a imitar en las líneas celulares GC-27 y HGC MGC-803, ambos de los cuales exhibe alta eficiencia de la transfección (Fig. 2a). Como se ha demostrado por CCK 8-ensayos de crecimiento 0, 1, 2, 3 y 4 días después de la transfección mímica, la sobreexpresión de miR-10a reducido la proliferación celular en ambas líneas celulares, mientras que el imitador scramble no tuvo ningún efecto sobre la proliferación celular en comparación con las células no tratadas (Fig. 2b). Posteriormente, se realizaron ensayos de formación de colonias para evaluar la capacidad proliferativa de las células transfectadas-mímica HGC-27 y MGC-803 y revelaron que la sobreexpresión de miR-10a en HGC-27 células reducido la formación de colonias (Fig. 2c). Sin embargo, ninguna de las células MGC-803 colonias formadas, lo que podría ser debido a la adhesión relativamente débil de las células. Para seguir haciendo frente a los efectos de miR-10a en la apoptosis de las células en las dos líneas celulares de GC, la apoptosis temprana del MGC-803 y HGC-27 células se examinó mediante la tinción con anexina V después de la transfección imitador de miR-10a. Como era de esperar, pocas células temprana de apoptosis (20,8% en HGC-27 y el 22,9% en el MGC-803) se detectaron en las células-mímica tratado de mucho revuelo, mientras que el tratamiento imita el miR-10a aumentó el porcentaje de células apoptóticas tempranas (28,4% en HGC -27 y 27,7% en MGC-803) (Fig. 2d). En conjunto, llegamos a la conclusión que el miR-10a pudo reprimir la supervivencia celular en las células de GC mediante la inducción de la apoptosis celular.
una expresión de miR-10a en las células HGC-27 y MGC-803 transfectadas con 50 nmol /L o scramble miR 10a imitar durante 48 h. b Los ensayos de crecimiento de CCK-8 a 0, 1, 2, 3, 4 días después de la transfección sinóptico. c ensayo de formación de colonias de células no tratadas HGC-27, revolver-transfectadas y transfectadas miR-10a. d MGC-803 y HGC-27 células fueron teñidas con anexina V PE y 7-AAD 72 h después del tratamiento con imita el miR-10a o despegue en tiempo mínimo. A principios células apoptóticas se muestran en el cuadrante inferior derecho. Todos los datos se presentan como las medias ± SD. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01, ***, P & lt;. 0.001
miR-10a inhibe la migración celular y la invasión
in vitro
Se evaluó además la efectos de miR-10a en la migración celular y la invasión, que eran los principales determinantes de la progresión maligna y metástasis. La capacidad de migración se demostró mediante un ensayo de cicatrización de la herida /cero en HGC-27 y células MGC-803. Ambas líneas celulares tratadas con miR-10a mímica eran distintivamente menos migratoria que los tratados con el control de mezcla aleatoria o las células no tratadas a los 12, 24, y 36 horas después del rascado (Fig. 3a). Además, se realizó un ensayo de invasión de células Matrigel y se tiñeron las células invadidas para medir las habilidades de invasión de dirección de las células después de expresar ectópica de miR-10a en las dos líneas celulares. La invasividad de las células transfectadas con imitador miR-10a se dramáticamente disminuyó en comparación con el control de mezcla aleatoria y las células no tratadas (Fig. 3B). Estos resultados demostraron que el miR-10a jugó un papel importante en la regulación de la migración celular y la invasión en GC y sugirió que la baja regulación de miR-10a podría contribuir a la metástasis del tumor en la carcinogénesis gástrica.
a HGC-27 y MGC -803 células se dejaron sin tratar o transfectada con 50 nmol /L scramble o miR-10a durante 24 h, y se hicieron las heridas. La proporción relativa de cierre de la herida por campo se muestra a 0, 12, 24, 36, 48 horas. Bar, 500 micras. b HGC-27 y las células MGC-803 se dejaron sin tratar o transfectada con 50 nmol /L scramble o miR-10a durante 24 h, y un ensayo de invasión se realizó transwell. Se muestra la proporción relativa de células invasivas por campo. Bar, 50 micras y 100 micras. Todos los datos se presentan como las medias ± SD. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01, ***, P & lt;. 0.001
miR-10a Objetivos HOXA1 en GC
MiRNAs realizan funciones biológicas a través de la regulación negativa de sus genes diana. Se ha informado de que el HOXA1 oncogén es un objetivo directo de miR-10a en megacariocitopoyesis y cáncer de páncreas humano [17] - [19]. Como se predijo por PicTar, había una secuencia complementaria entre tiene-miR-10a y HOXA1 3'UTR (Fig. 4a). Sin embargo, se desconoce si el miR-10a regula la proliferación celular, la migración y la invasión en GC por la orientación HOXA1. Para aclarar su relación regulatoria, lo primero que detectó la proteína y los niveles de ARNm de HOXA1 en las células de miR-10a-mímica transfectadas HGC-27 y MGC-803 utilizando el Western Blot y RT-PCR. Se observó una disminución evidente en el nivel de proteína en presencia de HOXA1 imita miR-10a en comparación con el control scramble en las dos células (Fig. 4b). El nivel de ARNm de HOXA1 fue también el regulado en HGC-27 células, lo que sugiere que el miR-10a inhibe la expresión HOXA1 mediante la degradación de ARNm de HOXA1 en HGC-27 células. Sin embargo, hubo poca alteración en el nivel de mRNA de HOXA1 en células MGC-803, lo que sugiere que el miR-10a puede regular a la baja la expresión HOXA1 a través de la represión de traducción pero no ARNm de escisión en MGC-803 células (Fig. 4C). Además, se analizaron los niveles de proteína de HOXA1 en 24 pacientes con cáncer gástrico. Entre estas muestras, hubo 12 pacientes en los que el miR-10a se redujo reguladas en sus tejidos GC y 12 pacientes en los que el miR-10a fue regulada hasta en sus tejidos GC (Fig. 4d). HOXA1 fue hasta reguladas en la mayoría de los pacientes en los que el miR-10a se redujo reguladas en sus tejidos GC. Del mismo modo, HOXA1 se había reducido regulado en la mayoría de los pacientes en los que el miR-10a fue regulada hasta en sus tejidos GC. Una comparación de los niveles de miR-10a y los niveles de proteína de HOXA1 en GC reveló una correlación inversa entre el miR-10a y HOXA1 (r
2 = 0,1839, p = 0,0366) (Fig. 4e). En conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que HOXA1 es un objetivo directo de miR-10a en GC. También se detectó el ARNm de HOXA1 en estos pacientes y se observó que el nivel de ARNm de HOXA1 en varios pacientes no era coherente con el nivel de proteína que indica que el miR-10a regula la expresión de su objetivo, HOXA1, a través de la represión de traducción, pero no ARNm la escisión en estos pacientes (Fig. S1).
a la predicción de la unión entre el miR-10a y HOXA1 por PicTar. b expresión de la proteína HOXA1 en HGC-27 y células MGC-803 transfectadas con imita el miR-10a. c nivel de ARNm en células HOXA1 HGC-27 y MGC-803 transfectadas con imita el miR-10a. d Western blot de análisis de nivel de proteína HOXA1 en 24 pacientes con cáncer gástrico. El panel izquierdo presenta la expresión de HOXA1 en 12 pacientes con cáncer gástrico en los que el miR-10a se redujo reguladas en sus tejidos GC (C) en comparación con los correspondientes tejidos no tumorales adyacentes (N). El panel derecho presenta la expresión de HOXA1 en 12 pacientes con cáncer gástrico en los que el miR-10a se reguló en sus tejidos GC (C) en comparación con los tejidos no neoplásicos (N). e correlación inversa entre los niveles de proteína HOXA1 y la expresión de miR-10a en los 24 pacientes con cáncer gástrico anteriores.
Knock-down de HOXA1 suprimió el crecimiento celular de cáncer gástrico y Migración
in vitro
a continuación, se preguntó si HOXA1 jugó un papel importante en células de cáncer gástrico. Para examinar el papel de HOXA1 en GC, derribaron HOXA1 endógena en líneas celulares de MGC-803 HGC-27 y para detectar el efecto sobre la proliferación celular y la migración celular. Hemos observado que la represión HOXA1 inhibe la proliferación celular y la migración de HGC-27 y MGC-803 células, respectivamente (Fig. 5a y 5b). Estos resultados sugieren que las funciones de miR-10a como supresor de tumores en las células de GC mediante la supresión de la expresión HOXA1.
Los ensayos de crecimiento de CCK-8 a 0, 1, 2, 3, 4 días después de la transfección siHOXA1. b HGC-27 y las células MGC-803 eran sin tratar o transfectadas con siHOXA1 o control durante 24 h, y se hicieron las heridas. La proporción relativa de cierre de la herida por campo se muestra a 0, 12, 24, 36 horas. Bar, 500 micras. Todos los datos se presentan como las medias ± SD. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01, ***, P & lt;. 0.001
miR-10a es silenciado epigenético en líneas celulares de GC
Para dilucidar si la baja expresión de miR-10a GC en el tejido fue el resultado de alteraciones epigenetical, se trataron HGC-27, MGC-803, células SGC-7901 y MKN-45 con un inhibidor de la metilación del ADN 5-AZA. La expresión de miR-10a fue hasta reguladas en HGC-27, SGC-7901 y MKN-45 células cuando fueron tratados con AZA, lo que sugiere que la expresión de miR-10a puede ser reprimida en estas células mediante la metilación del ADN (Fig. 6a).
una validación de la expresión de miR-10a en HGC-27, MGC-803, líneas de células MKN-45 SGC-7901 y se trató con 5-AZA. b La estructura genómica de
miR-10a Opiniones y su región circundante. La isla CpG se encuentra en 1,6 kb aguas arriba de
miR-10a
. garrapatas verticales representan los sitios CpG. c qMSP análisis del nivel de metilación del
miR-10a
región genómica en líneas celulares de GC y después de tratamiento con 5-AZA. d El nivel de metilación del
miR-10a
región genómica en los tejidos GC (cáncer) fue mayor que sus tejidos emparejados adyacentes no neoplásicas (normales) en 55 pacientes con cáncer gástrico. e La correlación inversa entre la expresión de miR-10a y el estado de metilación de la región genómica de miR-10a en los 55 pacientes investigados GC. f El nivel de metilación de la región genómica de miR-10a en GES, HGC-27 y MGC-803 células. Todos los datos se presentan como las medias ± SD. *, P & lt; 0,05; **, P & lt; 0,01, ***, P & lt;. 0.001
Para estudiar la regulación de miR-10a por la metilación del ADN, se realizaron búsquedas en la base de datos del genoma humano para la presencia de islas CpG en todo el miR -10A utilizando el software "CpG Island Searcher" e identificó una isla CpG ubicada 1.638 pb aguas arriba de
miR-10a gratis (Fig. 6b). Además, hemos detectado el estado de metilación del ADN utilizando qMSP y MSP en las cuatro líneas celulares GC. La isla CpG se hypermethylated en las cuatro líneas celulares de GC, que era consistente con la baja expresión de miR-10a en estas líneas celulares GC. Cuando las líneas de células de GC fueron tratados con 5-aza-CDR, el nivel de metilación se disminuyó en comparación con el grupo DMSO (Fig. 6c).
El descenso de regulación de miR-10a en GC Los pacientes se debió a la hipermetilación de las islas CpG sus
además, examinó el estado de metilación de la isla CpG en el tejido GC y el tejido normal adyacente de 55 casos seleccionados al azar a través qMSP. El nivel de metilación en los 55 tejidos de GC fue mayor que en los tejidos adyacentes no cancerosas (p & lt; 0,01), que era consistente con la baja expresión de miR-10a en los tejidos GC (figura 6d.). Además, se seleccionaron al azar dos pares de muestras en el que analizar el nivel de metilación del ADN mediante secuenciación de bisulfato de PCR (BSP) para validar la precisión del MSP. Los resultados de BSP fueron consistentes con la de qMSP y se complementaron como la figura. S2. Por otra parte, el nivel de metilación de miR-10a (M /M + T) en estos pacientes GC mostró una correlación inversa con la expresión de miR-10a (r
2 = 0,1956, p = 0,0006) (Fig. 6e). También se detectó el nivel de metilación de miR-10a en las células gástricas normales y líneas celulares de cáncer gástrico. Los resultados de qMSP revelaron que la isla CpG fue parcialmente metilado en las células GES pero extremadamente hypermethylated en las dos líneas celulares de cáncer gástrico HGC-27 y MGC-803, que también sugerían que la isla CpG aguas arriba de
miR-10a
fue hypermethylated en las células GC (Fig. 6f). En conjunto, estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que la expresión de miR-10a estaba regulada por la metilación del ADN en estos pacientes GC. La baja regulación de miR-10a en pacientes GC fue debido a la hipermetilación de las islas CpG.
Discusión
En este estudio, se determinó que el miR-10a se había reducido regulado en humanos cáncer gástrico en parte debido a su promotor hipermetilación del ADN. Otros estudios demostraron que la sobreexpresión de miR-10a suprime la proliferación celular, la migración y la invasión en las líneas celulares GC HGC-27 y MGC-803, posiblemente a través de la orientación de la HOXA1 oncogén.
Se han reportado MiRNAs para regular diversos desarrollo y los procesos celulares, y están implicados en muchas enfermedades humanas, especialmente en el cáncer. MiRNAs suprimen la expresión de genes por la orientación mRNAs través de la unión a sus 3 'UTRs. Estos miRNAs exhiben un papel regulador en la patogénesis del cáncer y están involucrados en la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, la metástasis y la resistencia [4], [20]. MiR-10a juega un papel importante en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer hepatocelular [9], el cáncer de páncreas [17], la leucemia mieloide aguda [21] y la leucemia mieloide crónica [10]. La expresión anormal de miR-10a es probable que desempeñe un papel crucial en la transformación maligna y es relativa a la especificidad tisular. Su desregulación puede contribuir al desarrollo de la neoplasia del estómago.
La validación de la expresión de miR-10a en muestras clínicas demostró que el miR-10a se había reducido regulado en 58 (58/100, 58%) los tejidos GC en comparación con los tejidos adyacentes. Sin embargo, Weidong Chen
et al.
Investigó la expresión de miR-10a en 33 casos de GC y se observó que la expresión de miR-10a fue mayor en tejidos de GC que en los tejidos adyacentes [22]. La inconsistencia puede ser el resultado de la diferente cantidad de muestras clínicas y el cambio indistinta de miR-10a en los tejidos GC. Nuestros datos deberían ser más biológicamente su Representante debido a los grandes números de muestras clínicas. Sólo una mayor parte pero no todos los pacientes con cáncer gástrico tienen una baja regulación de miR-10a en sus tejidos GC Aunque las funciones de miR-10a como un supresor tumoral en las células de cáncer gástrico. Esto puede ser debido a la distinta mecanismo de la génesis de la GC en diferentes individuos. Puede haber algunos otros genes o factores importantes responsables de la tumorigénesis en los pacientes con cáncer gástrico en cuyos tejidos GC miR-10a se mantuvo sin cambios o hasta reguladas. Además, la expresión de miR-10a no mostró correlación con las características clínico-patológicas, excepto para el estadio TNM, lo que indica que el miR-10a podría desempeñar un papel parcial en la tumorigénesis especialmente en las primeras etapas.
Muchas miRNAs se ha informado que se correlaciona con tumorigénesis, sin embargo, el mecanismo molecular subyacente sigue siendo poco clara. En nuestro informe, un análisis funcional de miR-10a, incluyendo la proliferación celular, ensayos de migración e invasión, nos ha ayudado a entender mejor la contribución de miR-10a a la carcinogénesis gástrica. La transfección de miR-10a imitan la proliferación celular significativamente inhibido, la migración y la invasión en las células de GC, lo que indica que la represión de miR-10a podría promover la progresión del tumor en la carcinogénesis gástrica. Se necesitan más estudios para dilucidar este mecanismo.
En el genoma humano,
miR-10a
se encuentra aguas arriba de
HOXB4
.
miR-10b
, otro miembro de la familia de miR-10, se encuentra aguas arriba de
HOXD4
. Estos dos miembros son diferentes entre sí en una sola base y exhiben secuencias de semillas idénticos, lo que sugiere sus funciones similares. Kwoneel Kim [12] ha informado de que el miR-10b juega un papel en la GC como un supresor de tumores. En nuestro estudio, hemos demostrado que la sobreexpresión de miR-10a inhibe la proliferación de tumores, la migración y la invasión, que era similar a la función de miR-10b en GC. HOX genes están muy conservadas factores de transcripción que son determinantes para la correcta patrón anterior-posterior del eje del cuerpo [23]. HOXA1 ha sido validado como un objetivo directo de miR-10a en el cáncer de páncreas humano [17] y megacariocitopoyéticos [18].