Extracto
Fondo
microARNs (miRNAs) son una clase de ARN no codificantes cortos que regulan la homeostasis de las células mediante la inhibición de la traducción o degradación de mRNA de los genes diana, y por lo tanto puede actuar como tumor o genes supresores de oncogenes. El papel de los microRNAs en el meduloblastoma sólo recientemente ha sido abordado. La hipótesis de que los microRNAs expresados diferencialmente durante el desarrollo normal del SNC pueden ser anormalmente reguladas en el meduloblastoma y son funcionalmente importantes para el crecimiento celular meduloblastoma.
Metodología y Principales conclusiones
Se examinó la expresión de microRNAs en el meduloblastoma y entonces investigado el papel funcional de uno uno específico, miR-128a, en la regulación de crecimiento celular meduloblastoma. Hemos encontrado que muchos microARN asociados con la diferenciación neuronal normal son significativamente las reguladas en el meduloblastoma. Uno de ellos, miR-128a, inhibe el crecimiento de células de meduloblastoma apuntando el oncogén Bmi-1. Además, el miR-128a altera el estado redox intracelular de las células tumorales y promueve la senescencia celular.
Conclusiones y Importancia
A continuación se presenta la novedosa regulación de las especies reactivas de oxígeno (ROS) por microARN 128a a través de la inhibición específica del oncogén Bmi-1. Se demuestra que el miR-128a tiene actividad supresora de crecimiento en el meduloblastoma y que esta actividad está mediada en parte por la orientación Bmi-1. Estos datos tienen implicaciones para la modulación de los estados redox en las células madre cancerosas, que se cree que son resistentes a la terapia debido a sus estados de baja ROS
Visto:. Venkataraman S, Alimova I, Ventilador R, Harris P, capataz N, Vibhakar R (2010) 128a MicroARN Aumenta intracelular de ROS Nivel al dirigirse a Bmi-1 e inhibe el crecimiento de células cancerosas meduloblastoma promoviendo la senescencia. PLoS ONE 5 (6): e10748. doi: 10.1371 /journal.pone.0010748
Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Febrero 2010; Aceptado: 30 de abril de 2010; Publicado: 21 de junio 2010
Derechos de Autor © 2010 Venkataraman et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Pediatric Brain tumor (http://www.pbtfus.org/), las necesidades del oso Fundación de cáncer Pediátrico (http://www.bearnecessities.org), y los Institutos nacionales de Salud-Instituto Nacional de Trastornos neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS NIH) K08NS059790 subvención. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el meduloblastoma es el tumor cerebral maligno más frecuente en la infancia. Si bien los resultados han mejorado, hay una significativa morbilidad relacionada con el tratamiento [1], [2]. Además, los pacientes con características de alto riesgo siguen teniendo un mal pronóstico. Los avances recientes indican que meduloblastoma surge de precursores de células granulares del cerebelo o células madre neuronales ubicadas en el cerebelo [3], [4], [5], [6]. Si bien los mecanismos moleculares implicados en la tumorigénesis meduloblastoma no están bien definidos, es evidente que existe un control anormal de los mecanismos normales del desarrollo [7].
Recientemente trabajar desde nuestro laboratorio y otros han implicado a los microARN como importantes reguladores de meduloblastoma el crecimiento celular [8], [9], [10]. Los microARN consisten en moléculas de ARN de 18-22 nucleótidos con la actividad de silenciamiento génico post-transcripcional [11]. Más comúnmente que controlan la expresión de genes a través de la asociación con la región 3 'no traducida (3' UTR) de genes e inhiben la traducción de la proteína [12]. MicroARNs también puede desestabilizar y mediar la degradación de transcritos de ARN [13]. Además de su papel en el desarrollo normal, microRNAs también están asociados con la carcinogénesis [14], [15]. Muchos microRNAs están bajo expresado en tumores humanos en comparación con los tejidos normales, mientras que algunos son más expresado [16]. Es importante destacar que la desregulación de los resultados del procesamiento de microARN en la tumorigénesis mejorada [17]. Además, un número creciente de microRNAs están asociados con cánceres humanos específicos. Por ejemplo, microARN 21 (miR-21) se sobreexpresa en el glioblastoma, y la inhibición de miR-21 inhibe el crecimiento del glioblastoma
in vitro
y
in vivo
[18]. Otros han demostrado que miR-137 y miR-124 induce la diferenciación de las células madre glioma [19]. Hemos demostrado previamente que el miR-124 también actúa como un supresor de tumores en las células de meduloblastoma mientras que otros estudios recientes han implicado la polycistron MIR 17-92 como un oncogén en el meduloblastoma mediada por sonic hedgehog [9], [10], [20].
Estos y otros estudios recientes sugieren que los microARNs son reguladores críticos de la tumorigénesis y que su contribución a la tumorigénesis meduloblastoma es importante. Por lo tanto, decidimos investigar la función microARN en el meduloblastoma. Exploramos la posibilidad de que la expresión de microRNAs cerebrales enriquecida se altera en el meduloblastoma y que algunos de estos microRNAs puede jugar un papel regulador crítico en este tumor. Se encontró que varios microARN asociados con la diferenciación neuronal normal son significativamente las reguladas en el meduloblastoma. De estos microARN 128a (miR-128a) se reguló fuertemente hacia abajo. Mientras que el papel de miR-128a ha sido investigado en los tumores astrocíticos, tales como glioblastoma, su papel en los tumores neuronales, tales como meduloblastoma no se conoce. A continuación se describe el papel funcional de miR-128a en el meduloblastoma por primera vez. Encontramos que el miR-128a inhibe el crecimiento de células de meduloblastoma apuntando el oncogén Bmi-1 y por lo tanto el aumento de los niveles de estado estacionario de superóxido y la promoción de la senescencia celular.
Resultados
microRNAs cerebrales son enriquecidos diferencialmente expresado en el meduloblastoma
Como un primer paso para abordar el papel de microARN en el meduloblastoma se realizó un análisis basado en microarrays de microARN en células de meduloblastoma y lo comparó con el cerebelo humano adulto normal. Elegimos para examinar explantes primarios de células de meduloblastoma en el paso 2 en la cultura para evitar el ruido de elementos de cerebro normal en muestras de biopsia contaminante. De los 385 microARN humanos ensayadas, 167 se expresaron en niveles más bajos en el meduloblastoma cuando se compara con el cerebelo normal. La agrupación jerárquica de la expresión microRNA separa correctamente el cerebelo normal a partir de las muestras de meduloblastoma (Figura S1-A). Análisis posteriores revelaron que la disminución de la expresión de 90 microRNAs en meduloblastoma fueron estadísticamente significativas (p & lt; 0,05). Se examinó entonces esta lista para separar los microARN que se expresaron en las tres muestras del cerebelo y estadísticamente disminuido en las tres muestras de meduloblastoma. Esto redujo la lista de los microARN humanos estadísticamente significativa con una menor expresión en las tres muestras de meduloblastoma a 30 microRNAs (Figura S1-B). Es de destacar que muchos de los microRNAs previamente habían sido identificados como siendo enriquecido en el cerebro normal [21]. Algunos, pero no todos estos microRNAs también fueron reportados previamente como siendo disminuido en meduloblastoma en comparación con cerebelo normal [8], [9]. La comparación de los conjuntos de datos de microRNAs disminución informó anteriormente y nuestros datos reveló que sólo cinco microRNAs fueron detectados por los tres grupos (Figura S2). Estos son miR-124, miR-129, miR-138, miR-150 y miR-323. Hemos demostrado previamente que el miR-124 es funcionalmente importante en el meduloblastoma, mientras que la biología de los otros cuatro miRs comunes aún no está claro [10]. Ferretti
et al
tenía un 12 microRNAs adicionales en común con nuestro conjunto de datos donde como Northcott
et al
tenía sólo 3 microRNAs adicionales en común con nosotros (Figura S2). Además hubo 10 microRNAs adicionales que sólo fueron identificados por nosotros como ser disminuido significativamente en el meduloblastoma (Figura S2).
A continuación realizó en tiempo real RT-PCR en una cohorte de estos miARN en muestras adicionales para validar nuestra microarrays de datos (Figura 1A). La comparación de las células de meduloblastoma primarios a adultos y pediátrica normal cerebelo reveló una regulación a la baja significativa de los microARN enriquecidos cerebrales en el meduloblastoma. Hay cuatro microARN altamente regulados hacia abajo a saber, el miR-125, miR-128a, el miR -139 y dejar-7 g. De estos cuatro microARN, miR-139 fue identificado por nosotros, pero no en los dos informes anteriores [8], [9]. Además nos, así como Ferretti
et al
pero no Northcott
et al
detectamos miR-128a como una disminución en el meduloblastoma. Curiosamente cerebelo adulto tenía una expresión más alta de muchos de estos microRNAs en comparación con el cerebelo pediátrica. La expresión de microRNAs altamente reprimidos fue validado en un panel de líneas celulares de meduloblastoma. Similar a los explantes primarios los cuatro microRNAs se redujeron en las líneas celulares en comparación con cerebelo normal (Figura 1 B). En consonancia con los datos publicados anteriormente también encontramos miR17-5p que se sobre-expresado en el meduloblastoma [9].
A) de calor MicroARN mapa de perfiles de muestras de pacientes con meduloblastoma y la comparación de cerebelo normal. B) La represión de miR-125, miR-128, miR-139, let-7 g y una mayor expresión de miR17-5p en líneas celulares de meduloblastoma. C) Expresión relativa de microRNAs en muestras de pacientes con meduloblastoma.
A continuación se analizó la expresión de let-7 g, miR-125 y miR-128a en los tumores primarios de meduloblastoma y el tejido del cerebelo normal. Uso de QRT-PCR, se encontró que los tres miRNAs se redujo significativamente en la expresión en 10 muestras archivadas de pacientes meduloblastoma (ANOVA, P & lt; 0,001, figura 1C). Dado el pequeño conjunto de la muestra, es difícil desarrollar cualquier correlación con tumor subtipo o resultados de los pacientes. Sin embargo, las muestras no se Gli1 alta y por lo tanto no en la subcategoría SHH [9], [22]. Estos datos indican que estos microRNAs podrían tener un papel biológico importante en meduloblastoma. Sobre la base de la medida de miR-128a reprimida en el meduloblastoma en contraste con su alta expresión en el cerebelo normales, se optó por seguir investigando el papel funcional de miR-128a en el meduloblastoma.
Re-expresión de miR-128a disminuye Daoy crecimiento celular meduloblastoma
Para determinar si re-expresión de los microARN altera el crecimiento de las células tumorales, las células transfectadas con meduloblastoma Daoy oligonucleótidos precursores de microARN. Estas moléculas precursoras microARN están diseñados para imitar microRNAs endógeno. Re-expresión de miR-128a disminución del crecimiento celular meduloblastoma, medido por el ensayo MTT (Figura 2A). Hallazgos similares se observaron en la línea celular de meduloblastoma D283 (datos no mostrados). A fin de evaluar el efecto inhibidor del crecimiento de miR-128a, las células transfectadas con el control de miR Daoy u oligonucleótidos miR-128a y contaron las células durante 5 días usando el método de exclusión de colorante azul de tripano. En consonancia con los datos de MTT, miR-128a disminución del crecimiento celular Daoy en una forma dependiente de la dosis (Figura 2B).
A) miR-128a inhibe la proliferación de células de meduloblastoma, medido por el ensayo de MTT. (P & lt; 01) B) Número de células Daoy, medido por el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. C) La disminución de la formación de colonias en las células transfectadas miR-128a (fila superior está vector de miR-128a, la fila inferior es el control de vectores). D) Colonia cuenta por triplicado de 2 experimentos independientes. (P & lt; 0,001) guía empresas
Para evaluar mejor el impacto de los microARN en células de meduloblastoma se utilizó un plásmido lentiviral, que expresa el casete de miR-128a y ensayos de formación de colonias realizadas. Como se muestra en la Figura 2C y D, la transfección con miR-128a la formación de colonias potentemente inhibida por las células de meduloblastoma que indican que miR-128a es un supresor de tumor putativo en el meduloblastoma. Además de miR-128a disminuyó de forma potente la capacidad de las células Daoy para crecer en agar blando más que sugiere un papel supresor tumoral para miR-128a en el meduloblastoma (Figura S3).
MicroARN 128a hacia abajo regula Bmi-1 en células de meduloblastoma
a continuación realizó un análisis de los posibles sitios diana microARN utilizando dos algoritmos de predicción de uso común, TargetScan (http://www.targetscan.org) y PicTar (http://pictar.bio.nyu.edu) [23], [24]. Ambos algoritmos predijeron el gen Polycomb Bmi-1 a ser un objetivo para el miR-128a. El sitio diana cumple con los criterios de coincidencia de semillas (Figura 3A). Para probar experimentalmente si nuestros objetivos previsto estaban regulados por miR-128a, el sitio de destino Bmi-1 se clonó en el 3'UTR del gen de luciferasa de Renilla en el vector siCHECK. Daoy células fueron transfectadas con oligonucleótidos de control o miR-128a. La co-transfección con miR-128a disminuyó significativamente la actividad de luciferasa de Renilla en los vectores objetivo sitio Bmi-1 pero no en los vectores de sitio mutado (Figura 3B). Estos datos sugieren que el IMC-1 es un objetivo de miR-128a. Otro estudio reciente de miR-128a en el glioma también informó de que el IMC-1 es un objetivo para el miR-128a [25]. Esto es especialmente interesante ya que los genes Polycomb juegan un papel vital en la renovación de células madre durante la embriogénesis y también son conocidos por ser biológicamente importante en la proliferación de células neurales y meduloblastoma patogénesis [26] - [27].
A) miR sitio de destino 128a en el 3'UTR Bmi-1. B) los ensayos de reportero de luciferasa indican que el miR-128a se dirige funcionalmente el peso Bmi-1 3'UTR, * p & lt; 0,01 C) Western blot confirma que el miR-128a, pero no la expresión de la proteína de control MIR (CM), inhibe de bmi -1 en células de meduloblastoma. D) La cuantificación de las bandas de transferencia de Western. (P & lt; 0,01) guía empresas
A fin de validar el IMC-1 como diana de miR-128a, se realizó un análisis de inmunotransferencia de control o miR-128a células transfectadas. células Daoy fueron transfectadas con oligonucleótidos de control o miR-128a y se recogieron 48 horas más tarde. Western blot se realizó utilizando el IMC-1-anticuerpo anti. MiR-128a disminuyó Bmi-1 los niveles de proteína en las células Daoy consistentes con los datos de la luciferasa. (Figura 3C, D).
128a microARN inhibe Bmi-1 señalización mediada
Bmi-1 se sabe que reprime la expresión de p16 [28]. En ausencia de Bmi-1, p16 está regulada hasta en las células madre neuronales que reducen la proliferación celular [26]. Además, se ha demostrado que Bmi-1 mediada por la represión de p16 puede conducir a un mayor comportamiento agresivo de las células madre melanoma [29]. Daoy células de meduloblastoma y ONS76 transfectadas con miR-128a hasta reguladas p16 detectada por Western Blot (Figura 4A). Las mismas líneas celulares cuando se transfectaron con el IMC-1 de expresión de p16 completamente reprimida. Para confirmar aún más que el miR-128a impide la represión de p16 mediante la inhibición de Bmi-1, tanto ONS76 líneas celulares Daoy y fueron co-transfectadas con el miR-128a y el IMC-1. Esto dio como resultado un aumento moderado en el nivel de proteína p16 en comparación con la de las células transfectadas solamente con el análisis de transferencia Western mostró un incremento Bmi-1.
A) la expresión de p16 en las células transfectadas con Daoy miR-128a en comparación con la de la vector de control, pVETL. El nivel de expresión de p16 se inhibió completamente en las células Daoy que fueron transfectadas con el vector de Bmi-1 solo mientras que se observó inhibición modesta en las células co-transfectadas con miR-128a. B) La disminución de la actividad de E2F1 en células transfectadas con Daoy miR-128a como se mide por los ensayos de reportero de luciferasa. (P & lt; 0,01) guía empresas
Los estudios previos indican que el IMC-1 inhibe p16 y por lo tanto aumenta la actividad E2F1 [30]. Los factores de transcripción E2F juegan un papel clave en la regulación de la proliferación celular y la diferenciación terminal. Por lo tanto se examinó el efecto de miR-128a sobre la actividad transcripcional E2F1. Se encontró que la transfección de miR-128a en células Daoy disminuyó significativamente la actividad de E2F1 medida por la actividad de luciferasa, p & lt; 0,05 (Figura 4B). Esto es consistente con nuestros resultados que el miR-128a disminuye Bmi-1 y p16 aumenta.
Bmi-1 es un componente funcional de miR-128a detención del crecimiento celular mediada por meduloblastoma
A fin de evaluar si Bmi-1 represión es un componente funcional del fenotipo de la detención del crecimiento de miR-128a se investigó si el IMC-1 podría rescatar a la detención del crecimiento de miR-128a en las células de meduloblastoma. Las células fueron transfectadas con meduloblastoma miR-128a, miR-128a y Bmi-1 o los correspondientes controles y las células sometidas al ensayo de colonias de enfoque. La co-transfección de miR-128a con Bmi-1 dio como resultado la atenuación de la mediada por miR-128a detención del crecimiento tanto en las células Daoy (Figura 5A y B). Daoy células co-transfectadas con el IMC-1 que carece de su 3'UTR y miR-128a también rescataron a la proliferación de las células como inhibido por el miR-128a sola (Figura S4A). Esto indica claramente que el miR-128a se dirige Bmi-1 y disminuye la supervivencia celular. Otra línea celular de meduloblastoma ONS76 células también mostró la misma tendencia en la eficiencia en placas cuando se transfectaron con el miR-128a y el IMC-1 (Figura S4B). Estos datos coloca funcionalmente Bmi-1 en la cascada de miR-128a.
A) La co-transfección de las células Daoy con miR-128a y el IMC-1 aumentó el número de colonias formadas en comparación con la de miR-128a solos . B) Análisis cuantitativo de la cantidad de colonias formadas por células Daoy después de diferentes transfecciones, incluyendo Bmi-1 que carece de su 3'UTR. pBABE-puro es un vector de control para toda la longitud Bmi-1. * P & lt; 0,05 para miR-128a vs. pVETL y ** p & lt; 0,001 para miR-128a-128a vs. MIR + Bmi-1
MicroARN 128a aumenta el nivel de estado estacionario de superóxido. en Daoy células
Recientemente se ha demostrado que la ausencia de Bmi-1 conduce a un aumento de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) en células derivadas de Bmi-1 knockout mice [31]. ROS son bien conocidos para modular una variedad de funciones celulares, incluyendo la biología de las células del cáncer [32]. Dado que el miR-128a disminuyó el IMC-1 los niveles de proteína, quisimos probar si un aumento similar en los niveles de ROS fue evidente en las células tratadas con Daoy miR-128a. Se realizó la captura giro de los radicales libres y la espectroscopia de resonancia paramagnética electrónica (EPR) para identificar si hubo un aumento del nivel de ROS en células re-expresión de miR-128a. La trampa de espín, DMPO fue elegido debido a su baja citotoxicidad, la accesibilidad a la célula, y la reacción con radicales hidroxilo (OH ·) para producir un distintivo DMPO-OH giro aducto [33]. La reacción de DMPO con superóxido da un producto (DMPO-OOH) que se convierte en DMPO-OH por GPx en las células. Por lo tanto, DMPO es una sonda útil para detectar radicales centrados en el oxígeno que surgen de superóxido y H
2O
2. Los espectros EPR muestran un cuarteto típico 1:2:2:1 DMPO-OH (círculos cerrados, Figura 6A-ii). resultados EPR muestran claramente un aumento en la intensidad cuarteto DMPO-OH en las células que expresan Daoy miR-128a en comparación con la del vector vacío (Figura 6A-i). Para identificar con precisión si la señal cuarteto DMPO-OH puede deberse directamente al superóxido o para H
2O
2, las células transfectadas con Daoy miR-128a se incubaron con CuZnSOD por 30 min antes de la adición de DMPO. La adición de SOD disminuyó significativamente la altura de la señal EPR lo que sugiere que la señal de DMPO-OH se debe directamente a dismutasa (Figura 6A-iii). El análisis cuantitativo de la altura de la señal cuarteto (Figura 6B) demostró un aumento significativo (p & lt; 0,05) de superóxido en células transfectadas transitoriamente con miR-128a, en comparación con las células tratadas con el vector de control. Este aumento en la intensidad de la señal fue inhibida por la adición de SOD. Por tanto, es claro que el miR-128a aumenta el nivel de estado estacionario de superóxido en células de meduloblastoma. Para confirmar aún más que el aumento de ROS se debe a la inhibición de la Bmi-1, las células Daoy fueron co-transfectadas con Bmi-1 y miR-128a. Esto resultó en una disminución del nivel de ROS en células en comparación con la de miR-128a solo (Figura 6A-iv). experimentos de rescate con el IMC-1 que carece de su 3'UTR también revelaron que el miR-128a se dirige Bmi-1 y por lo tanto lleva a un aumento en el nivel de ROS en las células (Figura S5) guía
a) Aumento de la formación de radicales superóxido en células Daoy que se transfectaron con miR-128a como se detectó usando espectros EPR del producto de adición giro DMPO-OH (círculos cerrados en (ii)). El espectros recogidos son un promedio de la señal de 15 exploraciones. La señal 1:2:2:1 (círculos cerrados) cuarteto visto es debido a la formación de DMPO-OH. Las células tratadas con miR-128a tienen ~ 3 veces de incremento en la intensidad de señal de ROS (ii) en comparación con el vector vacío (i). La co-transfección de las células con miR-128a y Bmi-1 como resultado una disminución del nivel de ROS en comparación con la de miR-128a solo (iii). El tratamiento de la SOD en las células transfectadas-miR-128a abolió las señales que muestran que el radical formado es principalmente superóxido (iv). B) El análisis cuantitativo de la altura del pico EPR normalizó al número de células. * P & lt;. MiR128a 0,05 vs. pVETL y miR-128a + SOD
128a MicroARN induce la senescencia celular en las células Daoy
especies reactivas del oxígeno, un subproducto de estrés oxidativo puede inducir irreversible la detención del crecimiento celular y la senescencia [34]. Además células senescentes tienen un número significativamente mayor de ROS en comparación con las células apoptóticas [35]. En la expresión de p16 Además es una de las marcas de salón de la senescencia celular [36]. Dado que nos encontramos células Daoy miR-128a transfectadas mostraron un aumento en el nivel de estado estacionario de ROS, el aumento en el nivel de la proteína p16 y demostraron una detención del crecimiento celular, se realizó un ensayo para la senescencia. Cinco días después de la transfección con miR-128a, un mayor número de asociada a la senescencia β-galactosidasa se observaron (SA-β-Gal) células positivas (Figura 7A). Hubo un aumento de cinco veces en las células senescentes después de la transfección de miR-128a de las células en comparación con las células transfectadas vector vacío (Figura 7B) se observó datos similares en ONS 76 células de meduloblastoma (Figura S6).
) miR-128a induce la senescencia en células de meduloblastoma como se detectó mediante tinción SA-beta galactosidasa (células de color azul oscuro; ejemplos indicados por las flechas rojas). conteos B) de células por campo de alta accionado de células positivas β-gal en vector de control (pVETL) o células transfectadas miR-128a, * p = 0,003. C) Análisis de transferencia Western que muestra aumento del nivel de proteína en las células H3K9me2 Daoy transfectadas con miR-128a cuando se compara con el vector vacío. Actina se utilizó como control interno.
Para apoyar aún más nuestra conclusión de que la transfección de miR-128a conduce a la senescencia celular, se examinaron los niveles de metilación de la histona 3, lisina 9 (H3K9) por el Western Blot. focos de heterocromatina asociada a la senescencia se asocian con la metilación de la histona 3 lisina 9 (H3K9me2). Curiosamente, re-expresión de miR-128a produjo un aumento de la metilación de la histona 3 lisina 9 (H3K9me2), otra marca de la expresión génica reprimida mediada por el Bmi-1 complejo Polycomb represor (Figura 7C). Todos estos resultados sugieren fuertemente que el efecto inhibidor del crecimiento de miR-128a se debe a la vía de señalización como la senescencia provocada por el aumento de ROS
Discusión
A continuación se presenta la nueva regulación de los reactivos las especies de oxígeno por microARN 128a a través de la inhibición específica del oncogén Bmi-1. El papel funcional de microARN 128a en el meduloblastoma no ha sido previamente descrita.
Nos encontramos regulación a la baja significativa de varios microRNAs se sabe están involucrados en el desarrollo del sistema nervioso central en el meduloblastoma ,. Nuestros datos están de acuerdo con estudios previos que han descrito disminución de la expresión de microRNAs en el meduloblastoma [8], [9]. Ferretti
y col Hola, ha encontrado 55 microRNAs a ser reguladas en el meduloblastoma con diferencias en la expresión entre los principales subtipos histológicos [8]. Del mismo modo Northcott
y col Hola, ha encontrado 61 microRNAs ser disminuido en el meduloblastoma cuando se compara con el cerebelo normal [9]. Es interesante que cuando se clasifican en 4 grupos moleculares hubo diferencias significativas en la expresión de microARN. Por ejemplo, el cerdo del seto de Sonic expresión (SHH) tumores dirigidos habían disminuido de 10 microRNAs pero ninguno que se superponen con los microRNAs identificados por nosotros o por Ferretti
et al
. De hecho el análisis de comparación reveló diferencias significativas entre los microRNAs detectados por los tres grupos (Figura S2). Estas diferencias se probablemente relacionados con las plataformas utilizadas por cada grupo, la fuente de tumor y la fuente y la edad del cerebelo normal utilizado. Utilizamos explantes de células primarias en cultivo a paso 2, mientras que los otros dos grupos utilizan material de biopsia. Además, nuestros tejidos del paciente eran todos de la histología clásica, y no tienen una expresión genética de SHH. Es de destacar que tanto en nuestro estudio y el informe de Ferretti
et al. Hola, ha encontrado que el miR-128a se redujo significativamente en la expresión en el meduloblastoma cuando se compara con el cerebelo normal.
Se demuestra que este es disminución de la expresión una propiedad de muestras de tumor primario, así como un panel de líneas celulares de meduloblastoma de uso común. Estos datos serán de uso particular como función microARN se sondea más en el meduloblastoma. Es de destacar que la agrupación miR17-5p se sobreexpresa en nuestras muestras, lo cual es consistente con informes anteriores [9].
El análisis de la re-expresión de miR-128a en las células de meduloblastoma mostró que el miR-128a inhibió el crecimiento de células de meduloblastoma más probables por la disminución de la proliferación. MiR-128a demostró efectos supresores tumorales inhibiendo potentemente la formación de colonias de células de meduloblastoma. Un análisis más detallado de los posibles mecanismos reveló que el oncogén Bmi-1 era un objetivo putativo de miR-128a. Hemos demostrado que la proteína Bmi-1 está regulada por abajo miR-128a, que a su vez conduce a un aumento de la p16 un inhibidor del ciclo celular. La regulación de Bmi-1 por microRNAs es emocionante ya que el IMC-1 se sobreexpresa en el meduloblastoma y crítico para el desarrollo del cerebelo normal [27]. Bmi-1 también es fundamental para neural de células madre auto-renovación [26]. Bmi-1 también ha demostrado recientemente ser un objetivo de miR-128a en el glioblastoma [25]. Nuestros datos se extiende esta observación mediante la demostración de que la inhibición de Bmi-1 es funcionalmente crítica para la función supresora de crecimiento de miR-128a. La restauración de Bmi-1 en las células que expresan el miR-128a rescata a las células de meduloblastoma de la detención del crecimiento. Luego trató de explorar más a fondo el mecanismo de la vía de miR-128a-IMC-1 en el meduloblastoma.
Los datos recientes sugieren que el IMC-1 regula especies reactivas del oxígeno [31]. Se demuestra que los microARN 128a induce la generación de superóxido intracelular, posiblemente mediante la regulación de los niveles de IMC-1 y que el IMC-1 reexpresión invierte la generación de superóxido. La evidencia reciente sugiere que las células madre de cáncer son más resistentes a la terapia debido a un estado redox en general inferior [37]. Por lo tanto la modulación de mecanismos de regulación de la generación de ROS en células madre de cáncer tal vez una estrategia útil para destruir estas células. Tenemos la visión de un escenario en el que el microARN 128a se puede utilizar para inducir ROS en las células madre meduloblastoma y de ese modo que sean más sensibles a la radiación. La clave es para modular la homeostasis de ROS. A concentraciones normales, ROS juegan un papel en las funciones celulares que implican la transducción de señales. Sin embargo, un desequilibrio entre la generación de ROS y la capacidad de antioxidantes para neutralizar ROS puede dar lugar a una interrupción del estado redox celular, que conduce a estrés oxidativo. Nuestra observación de un nivel de estado estacionario aumento de ROS, y la inducción de p16 puede contribuir a la prematura senectud en células que expresan el miR-128a (Figura S7).
En resumen, se describe el papel funcional de microARN 128a en el meduloblastoma. Se demuestra que el microARN 128a disminuye el crecimiento celular meduloblastoma medio de mecanismos de ROS y la senescencia. Ahora estamos investigando el papel de microARN 128a en el meduloblastoma de radio-sensibilizar utilizando
vivo y modelos de xenoinjertos ortotópico en.
Materiales y Métodos
células, tejidos y Cultura
células Daoy y meduloblastoma D283 se obtuvieron de American Type Culture Collection (Rockville, Md.) y se cultivaron en medio DMEM (Gibco, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero bovino fetal (Gibco) de acuerdo con las recomendaciones del proveedor . ONS76 línea celular fue proporcionado amablemente por el Dr. James T. Rutka (Universidad de Toronto, Canadá) y se cultivó en DMEM que contenía FBS al 10%. D341 se obtuvo de ATCC y se cultivaron en DMEM con 20% de FBS y 1% de piruvato de sodio y L-glutamina. cultivos celulares primarios se obtuvieron de muestras de biopsias de pacientes con meduloblastoma bajo un protocolo aprobado por el Comité de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa Hospitales y Clínicas. Se obtuvo el consentimiento por escrito de todos los pacientes según el mandato de la Universidad de Iowa IRB. Los cultivos se mantuvieron a bajos números de paso (p2-P4) en medio DMEM suplementado con suero bovino fetal 20%. Normales muestras de cerebelo y de pacientes meduloblastoma humanos se obtuvieron de la Pediatric Cooperativa de Tejidos Humanos de red (Columbus, Ohio) bajo una Universidad de Iowa IRB protocolo aprobado. Todas las muestras se obtuvieron de forma anónima a lo dispuesto por el IRB. Muestras que cerebelo muestras normales eran de pediatría y no maligno cerebro adulto. Todas las muestras de meduloblastoma eran de pacientes pediátricos. Los detalles de las muestras de pacientes se han descrito anteriormente [38]. En pocas palabras todas las muestras eran de tumores no metastásicos (M0) con histología meduloblastoma clásico.
Aislamiento microARN y análisis PCR cuantitativa
Pequeños ARN fueron aisladas utilizando el kit de aislamiento de ARN mirVana (Ambion).
expresión de microARN se midió por PCR cuantitativa usando un ciclador térmico ABI-7700. cebadores y sondas microARN se compraron de Applied Biosystems (Foster City, CA) y los ensayos realizados según las recomendaciones del fabricante con varias modificaciones que nos permiten detectar microRNAs baja abundancia. Para la reacción de transcripción inversa (RT) se utilizaron 20 nanogramos de RNA total. Para la reacción de qPCR se diluyó el ADNc resultante 01:02. Cada etapa de RT se realizó por duplicado y la qPCR por triplicado para cada reacción de RT. U6b y U66 pequeños RNAs se usaron como controles endógenos y la cantidad microRNA relativa calculada por el método ΔΔCT.
transfección transitoria de células Daoy con miR-128a y el análisis de la proliferación celular y la viabilidad
La proliferación celular se midió por ensayo de MTT y la viabilidad celular se determinó por el ensayo de exclusión de colorante azul de tripano. Para ensayo para la proliferación de células, células de meduloblastoma fueron transfectadas con el control Mir, miR-9 u oligonucleótido miR-128a en placas de 24 pocillos usando reactivo LT1 (Mirus, Madison WI). 6, 000 células /pocillo fueron sembradas por triplicado en placas de 96 pocillos en 100 ul de medio. Después de 2 días, se añadió 100 ul de Cell Titer AQeous (Promega, Madison, WI) y las células se incubaron durante 1 hora y la absorbancia medida a 490 nm usando un lector de microplacas por las recomendaciones de los fabricantes. número celular relativa se calculó mediante la normalización de la absorbancia a las células no tratadas.
Para ensayo para la viabilidad celular, las células se sembraron Daoy en una placa de 6 pocillos y 24 h más tarde las células fueron transfectadas con el control de miR o con dos concentraciones diferentes de