Extracto
Los microARN (miRNA) desempeñan un papel fundamental en la progresión del cáncer gástrico y metástasis. En este estudio se investigó el papel de los genes miARN-135a en el cáncer gástrico temprano (CGT), incluyendo la metástasis de los ganglios linfáticos (LN). Se examinó la correlación entre la expresión de los genes miARN-135a y los resultados clínicos en 59 pacientes que se sometieron a cirugía para el EGC. El uso de líneas celulares de cáncer gástrico, se realizó funcional y análisis del gen diana. la expresión de los genes miARN-135a se había reducido regulado en el 33,9% de los pacientes. Estos pacientes mostraron una etapa significativamente más avanzada (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045) y una mayor tasa de LN metástasis (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014) que aquellos con regulación de la expresión de los genes miARN-135a. En un análisis multivariado, la baja regulación de los genes miARN-135a era un factor de riesgo independiente para la metástasis LN (odds ratio ajustado, 8,04; intervalo de confianza del 95%, 1,08-59,81; p = 0,042). análisis funcionales utilizando líneas celulares de cáncer gástrico mostraron que los genes miARN-135a suprimió la viabilidad celular, la transición epitelio-mesenquimal, la invasión celular y la migración. Rock1 era un objetivo de miRNA-135a y su expresión se correlaciona inversamente con la de los genes miARN-135a. Rock1 expresión fue significativamente mayor en los pacientes con EGC LN metástasis que en aquellos sin metástasis LN. Nuestros resultados confirman el papel de tumor supresor de miRNA-135a, y demuestran su papel en la metástasis LN en EGC. miRNA-135a y su gen diana
Rock1
pueden ser nuevas dianas terapéuticas y pronósticas de EGC
Visto:. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) MicroARN 135a suprime la metástasis de ganglios linfáticos a través de la baja regulación de Rock1 en el cáncer gástrico precoz. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10.1371 /journal.pone.0085205
Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, Japón
Recibido: 28 Octubre, 2013; Aceptado: 23 Noviembre 2013; Publicado: 21 Enero 2014
Derechos de Autor © 2014 Shin et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue financiado por la subvención 1110532-3 del Centro Nacional del cáncer, Corea. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. HA es un miembro de la junta editorial de PLOS ONE y esto no altera la adhesión de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
el cáncer gástrico sigue siendo la segunda causa más común de mortalidad por cáncer en todo el mundo, a pesar de la disminución de las tasas de incidencia y mortalidad en los países desarrollados [1 ].
En las áreas, incluyendo Corea y Japón, donde se realiza el cribado para el cáncer gástrico ampliamente, la detección temprana es a menudo posible. Debido a una mayor tasa de detección temprana de cáncer gástrico puede conducir a un mejor pronóstico, intereses en mejorar la calidad de vida de los pacientes y la utilización de tratamientos mínimamente invasivos han aumentado. En pacientes con cáncer gástrico, de los ganglios linfáticos (LN) metástasis es uno de los factores pronósticos más importantes, y la incidencia global de una metástasis LN en el cáncer gástrico precoz (EGC) varía de 5 a 20% [2] - [4].
la gastrectomía con disección LN es considerado como el tratamiento estándar para el cáncer gástrico; sin embargo, 80 a 95% de los pacientes con EGC no requieren una disección LN si el cáncer gástrico está completamente extirpado por tratamientos menos invasivos, tales como la resección endoscópica [5] - [7] o cirugía mínimamente invasiva (
por ejemplo
, resección en cuña simple o cirugía de navegación centinela LN) [8] - [10]. Aunque se han realizado estudios de los marcadores pronósticos y predictivos biológicos para LN metástasis en EGC, no existen herramientas de predicción de metástasis ganglionar de EGC realidad.
Varios estudios han informado de que la profundidad de la invasión, el tamaño del tumor y la invasión linfática son asociado con la metástasis en LN EGC [4], [11]. Sin embargo, la mayoría de estos factores han sido determinados después de un examen patológico definitivo de tejidos resecados, que no es útil para determinar la estrategia de tratamiento
.
Los microARN (miRNA) son los ARN no codificante de proteínas pequeñas. Los estudios han demostrado que las alteraciones en la expresión de miRNAs contribuye a la patogénesis de los cánceres, incluyendo los de origen gastrointestinal [12] - [15].
miRNAs también se han demostrado ser útil en la diferenciación de cáncer y tejidos normales [ ,,,0],16], [17]. Además, miRNAs se expresan diferencialmente en cada etapa de la carcinogénesis del cáncer gástrico [18]. miARN-27 [19] y la familia de miRNA-200 ZEB1 regulados [20] han demostrado estar relacionada con la etapa de la transición epitelio-mesenquimal (EMT) en el cáncer gástrico. Por lo tanto, miRNAs puede estar asociada con el proceso de la metástasis en LN EGC. Entre los miRNAs, miRNA-135a se ha demostrado que es un supresor tumoral miARN, y su expresión es el regulado en varios tipos de cáncer, incluyendo el carcinoma renal de células [21] y el linfoma [22]. A su vez, la sobreexpresión o la restauración de los genes miARN-135a promueve la apoptosis y suprime la proliferación de las células tumorales a través de sus genes diana c-Myc [21] y JAK2 [22], respectivamente. En un
in vitro
estudio, miRNA-135a suprime las actividades migratorias e invasivas de células de cáncer gástrico [23]. Sin embargo, la función supresora de tumores de miARN-135a en el cáncer gástrico no es claro.
El objetivo de este estudio fue investigar la correlación entre la expresión de los genes miARN-135a y los resultados clínicos en pacientes con EGC incluyendo LN metástasis.
Materiales y Métodos
muestras de tejidos humanos y los datos clínicos
Cincuenta y nueve pacientes adultos con diagnóstico de EGC en el Centro Nacional del cáncer, Corea, desde enero 2011 a abril 2013 se incluye en forma prospectiva este estudio. Estos pacientes fueron tratados con una gastrectomía abierta o laparoscopia asistida con D1 + o más disección LN. La extensión de la disección LN siguió las recomendaciones del cáncer gástrico Asociación Japonesa [24]. La etapa después de la cirugía se evaluó de acuerdo con el 7
ª edición del American Joint Committee on sistema de estadificación TNM del cáncer [25]. Los tejidos humanos incluyendo tanto el cáncer gástrico y los tejidos normales emparejados de cada paciente se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenan a -80 ° C. A partir de la revisión de las historias clínicas, características clínico, como la edad, el sexo,
Helicobacter pylori
estado, las características del tumor, el estadio y el estado de la metástasis LN se obtuvieron y analizaron. Consentimiento informado, se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Consejo del Centro Nacional del Cáncer, Corea Revisión Institucional (NCCNCS-11-445).
Cultivo de células y transfección
La línea celular humana normal epitelial gástrica HFE145 [26], [27] fue un regalo del Dr. Hassan Ashktorab y Duane T. Smoot (Howard University, Washington, EE.UU.) y disponibles comercialmente líneas celulares de cáncer gástrico AGS, YCC2, MKN28, KATOIII, snu1 , SNU5, SNU16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 y SNU719 se obtuvieron de la célula Corea Línea de banco (KCLB, Seúl, Corea). Todas las líneas celulares se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de antibióticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Entre las líneas celulares de cáncer gástrico, se seleccionaron líneas de células MKN28 y SNU668 porque rara vez expresan los genes miARN-135a, y se seleccionaron líneas celulares YCC y KATOIII porque tienen una expresión basal sustancial de miRNA-135a (Figura 1A). Las transfecciones con imita miRNA-135a (imita mirVana ™ miARN, Ambion, Austin, TX, EE.UU.), un inhibidor de miRNA-135a (inhibidor mirVana ™ miARN, Ambion, Austin, TX, EE.UU.), y Rock1 siRNA (5'-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 '; UGBioneer, Seúl, Corea) en SNU668, YCC2, MKN28, y las líneas celulares KATOIII se realizaron con Lipofectamine RNAiMAX y Lipofectamine 2000 reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. MKN28, SNU668, YCC2, y KATOIII líneas celulares se cosecharon dos días después de la transfección, y se realizaron diversos análisis.
(A) la expresión de los genes miARN-135a, examinado por análisis de PCR en tiempo real, es el regulado en las células de cáncer gástrico en comparación con células de la mucosa gástrica normal (HFE 145 células). (B) la expresión de los genes miARN-135a relativa de tejido tumoral en referencia a las contrapartes normales por análisis de PCR en tiempo real de acuerdo con la etapa del paciente.
* Los pacientes con cáncer en etapa más avanzada (estadio IB o mayor) muestran significativamente las reguladas miRNA- los niveles de expresión 135a en los tejidos tumorales en comparación con los niveles en los pacientes con menos estadio avanzado (estadio IA) cáncer (media 9,97 vs. 2,30, p = 0,009). (C) la expresión de los genes miARN-135a relativa de tejido tumoral en referencia a homólogos normales en el análisis de PCR en tiempo real de acuerdo con el estado de la metástasis LN. Los pacientes con metástasis LN muestran significativamente las reguladas miRNA-135a niveles de expresión en los tejidos tumorales (en comparación con los correspondientes tejidos normales) que los pacientes sin metástasis LN (media: 9,63 vs 0,61, p = 0,002). * 7
Reunión del Comité Conjunto sobre el Cáncer de estadificación TNM.
extracción de RNA y cuantificación miRNAs
El ARN total se aisló de 13 líneas de células y tejidos de 59 pacientes con cáncer gástrico, respectivamente, mediante el uso de Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) según el protocolo del fabricante. Se utilizó el kit de reactivos de la mezcla maestra TaqMan PCR Universal (Applied Biosystems, Tokio, Japón). La amplificación y detección se realizaron usando un Sistema de Detección de Secuencia 7900HT (Applied Biosystems, Tokio, Japón) con 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C (15 segundos) y recocido /extensión a 60 ° C (60 segundos). Esto fue precedido por transcripción inversa a 50 ° C durante 30 minutos y desnaturalización a 95 ° C durante 10 minutos. Para cuantificar miRNAs maduros, se utilizaron TaqMan microARN Ensayos kits (Applied Biosystems, Tokio, Japón) para la detección de los genes miARN-135a y un control miARN (RNU6B).
Análisis de transferencia Western
La proteína fue extraído de 13 líneas celulares y muestras de tejido 59 'EGC pacientes mediante el uso de tampón RIPA (Biosesang, Seúl, Corea) que incluye un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, se realizó la transferencia Western utilizando anticuerpos anti-Rock1 y anti-β-actina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE.UU.) anticuerpos. Las señales se detectaron con un kit ECL primer (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante.
Ensayos de proliferación celular
La proliferación celular se midió usando un ensayo MTT. Las células se sembraron en placas de cultivo de 96 pocillos (3 × 10
3 células por pocillo) y se transfectaron con imita miRNA-135a después de dos días de incubación. Posteriormente, 200 l de MTT (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.) se añadieron a cada pocillo. Después de cuatro horas de incubación adicional, soluciones MTT se desecharon, se añadieron 200 l de DMSO (Amresco, Solon, OH, EE.UU.) a cada pocillo, y la placa se agitó suavemente. Se midió la absorbancia en un lector de ELISA (Moecular dispositivos, Sunnyvale CA, EE.UU.) a una longitud de onda de ensayo de 570 nm.
análisis del ciclo celular
Las células se sembraron en placas de cultivo de 60π y transfectadas con los genes miARN -135a imita o un control negativo imita miARN (imita-NC). Estas células se recogieron por tripsinización y se fijaron en etanol al 70% durante al menos dos horas a -20 ° C. Los sedimentos celulares se lavaron con solución salina tamponada con fosfato fría y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en PI /RNasa tinción Buffer (BD Biosciences, San Diego, CA, EE.UU.). Después de la tinción, las muestras se analizaron con un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.) y 10.000 eventos fueron recogidos por muestra. Los datos de citometría de flujo se analizaron utilizando el software Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA, EE.UU.).
Ensayos
migración trans-filtro y de invasión
Las células fueron transfectadas con imita miRNA-135a , inhibidores de miRNA-135a, Rock1 siRNA, y el control Rock1 siRNA negativo (scARN) por un día y luego se transfiere a la cámara superior de la placa transwell recubierto con 0,5 mg de colágeno de tipo /ml I (BD Bioscience, Bedford, MA, EE.UU.) y una dilución 01:15 de Matrigel (BD Bioscience, Bedford, MA, EE.UU.). RPMI 1640 con FBS al 10% y 1% de antibióticos (Gibco BRL, Grand Island, NY, EE.UU.) se añadió a la cámara inferior y la placa de incubación fue de 20 horas. La migración de las células invasoras y se cuantificaron utilizando hematoxilina y eosina.
Las construcciones de plásmidos reportero luciferasa
El tipo salvaje 3 'UTR de Rock1 que contiene sitios de unión para los genes miARN-135a se amplificó usando gDNA de SNU668 células como una plantilla. Las construcciones mutantes correlacionadas fueron creados mediante la mutación de las regiones de siembra de los sitios de unión de miRNA-135. Tanto de tipo salvaje y mutante 3 'UTR se clonaron en aguas abajo del gen de la luciferasa en un vector de control pGL3. Las construcciones se verificaron por secuenciación.
Ensayo de la luciferasa
Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo en células SNU668 y YCC2. células SNU668 y YCC2 fueron transfectadas con cada uno de los plásmidos (vector vacío [MOCK], Rock1 3 'UTR de tipo salvaje [WT], y Rock1 3' UTR mutante [MUT], como un sitio de unión de los genes miARN-135a) junto con miRNA- 135a imita, inhibidores de miRNA-135a, y el ARN control negativo en placas de 24 pocillos. Dos días después de la transfección, se recogieron y se lisaron las células. Los ensayos de luciferasa se realizaron en los lisados mediante el uso de un kit de ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). La actividad de luciferasa se normalizó a ß-galactosidasa.
La tinción inmunohistoquímica
inmunohistoquímica (IHC) tinción se realizó durante 20 casos representativos de Rock1 grupos de baja y alta expresión. La recuperación del antígeno se realizó con un tratamiento térmico durante 30 minutos en pH 8,0 tampón Tris-EDTA (CC1, Sistema de Ventana Medical, Tucson, AZ, EE.UU.) a 95 ° C. diapositivas de tejido fueron incubadas a 42 ° C durante 30 minutos con anti-Rock1 MAB (ab134181, EPR638Y clon, monoclonal de conejo, 1:5,000; Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.). Los controles negativos se utilizaron de forma idéntica con IgG de conejo no inmunizado. Los resultados fueron interpretados por un patólogo experimentado (MC Kook).
El análisis estadístico
Escala datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher y la prueba de Mann-Whitney se utilizaron para comparar variables categóricas y las variables continuas, respectivamente. El coeficiente de correlación de Pearson fue usado para comparar el patrón de expresión de genes entre los genes miARN-135a y Rock1. Se utilizó un modelo de regresión logística multivariante para determinar los factores independientes asociados a la metástasis LN. Covariables que fueron significativas usando chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher (
P Hotel & lt; 0,05) se introdujeron en el modelo de regresión logística. Todos los datos fueron analizados con el programa STATA 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, EE.UU.). Un
valor de P Red de menos de 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
Resultados
niveles de expresión de miRNA-135a están asociados con la progresión y metástasis LN en EGC
Un estudio previo mostró que la expresión de miRNA-135a es el regulado en líneas celulares de cáncer gástrico [23]. Mediante el uso de QRT-PCR, también se encontró que la expresión de los genes miARN-135a es el regulado en diversas líneas celulares de cáncer gástrico en comparación con la de una línea celular epitelial gástrica normal (Figura 1A).
Sin embargo, la correlación entre la expresión de los genes miARN-135a y los resultados clínicos en el cáncer gástrico no se ha investigado. Por lo tanto, medimos los miRNA-135a niveles de expresión en el cáncer gástrico primario y sus correspondientes niveles en los tejidos normales de 59 pacientes con EGC. Abajo y la regulación de genes en los tejidos tumorales con respecto a los tejidos normales se define como la relación de tumor a los niveles de expresión génica de tejidos normales de & lt; 1,0 y & gt;. 1.0, respectivamente
contrario al resultado de
in vitro
experimento, sólo el 20 (33,9%) de 59 pacientes con EGC exhibió baja regulación de la expresión de los genes miARN-135a. Sin embargo, estos pacientes mostraron significativamente una etapa más avanzada (TNM stage≥IB, 35,0% vs. 12,8%, p = 0,045; odds ratio crudo [OR] = 2,11; intervalo de confianza del 95% [IC]: 01/08 a 04/10) y una mayor tasa de metástasis LN (30,0% vs. 5,1%, p = 0,014; OR crudo, 2,73; IC del 95%, 1,50 a 4,98) que aquellos con la regulación de la expresión de los genes miARN-135a (Tabla S1). La sensibilidad y la especificidad del estado de la expresión de los genes miARN-135a para la predicción de LN metástasis fueron 75,0% y 72,5%, respectivamente. Además, los pacientes con más avanzado (Figura 1B) o metástasis LN (Figura 1C) mostraron una proporción significativamente menor de tumores a los niveles de expresión de miRNA-135a normales que aquellos con estadio IA o sin metástasis LN. Un análisis de regresión logística multivariante también mostró que los genes miARN-135a baja regulación se asoció independientemente con metástasis LN (OR ajustado, 8,04; IC del 95%, 1,08-59,81; p = 0,042, Tabla 1). En conjunto, estos resultados sugieren que la baja regulación de la expresión de los genes miARN-135a pueden estar asociados con la progresión del cáncer gástrico incluyendo LN metástasis.
suprime miRNA-135a viabilidad celular de cáncer gástrico, EMT, la migración y la invasión
a fin de investigar la asociación entre los genes miARN-135a y los resultados clínicos, hemos realizado ensayos funcionales para la viabilidad celular, ciclo celular, EMT, la migración y la invasión en líneas celulares de cáncer gástrico. La sobreexpresión de los genes miARN-135a por imita miRNA-135a suprimió significativamente la viabilidad celular (Figura 2A) y el aumento de la fracción subdiploide de SNU668 células, una línea celular que rara vez se expresa miRNA-135a (Figura 2B), lo que sugiere el aumento de la apoptosis de las células de cáncer gástrico. Sin embargo, la supresión de los genes miARN-135a por los inhibidores de miRNA-135a indujo ni un aumento de la viabilidad celular ni una disminución en la fracción subdiploide YCC2 células, una línea celular que expresa sustancial miRNA-135a (Figura 2A y 2B). También se investigó la asociación entre la expresión de los genes miARN-135a y EMT en células de cáncer gástrico, porque miRNA-135a baja regulación fue un factor de riesgo independiente para LN metástasis en pacientes con EGC (Tabla 1). El aumento de expresión de los genes miARN-135a se asoció con supresión de EMT y mostró un aumento en la expresión de E-cadherina y la supresión de ambos N-cadherina y Slug en células SNU688. Por el contrario, la inhibición de la expresión de los genes miARN-135a resultó en la activación de la EMT incluyendo la supresión de la expresión de E-cadherina y la sobre regulación de ambos N-cadherina y la expresión de Slug en YCC2 células (Figura 2C). En la evaluación de las consecuencias funcionales, la sobreexpresión de los genes miARN-135a por imita miRNA-135a suprimió de forma significativa las capacidades de migración y la invasión de células de cáncer gástrico SNU668 (Figura 2D). Por el contrario, el bloqueo de los genes miARN-135a por los inhibidores de miRNA-135a aumentó significativamente la migración y la invasión de células de cáncer gástrico YCC2 (Figura 2E). En general, nuestros resultados sugieren que los genes miARN-135a es un regulador de supresión tumoral para la proliferación del cáncer gástrico y metástasis.
(A) Sobre regulación de los genes miARN-135a inducida por imita miRNA-135a suprime la viabilidad de las células del cáncer gástrico en SNU668 línea celular, una línea celular que rara vez se expresa miRNA-135a (p = 0,012), mientras que los inhibidores de miRNA-135a raramente afectan la viabilidad celular en la línea celular YCC2, una línea celular que expresa sustancialmente miRNA-135a. (B) Sobre regulación de los genes miARN-135a por imita miRNA-135a aumenta la fracción subdiploide de ADN, según lo determinado por análisis de citometría de flujo, lo que sugiere aumento de la apoptosis en células SNU668. (C) En la presencia de imita miRNA-135a, RT-PCR análisis muestra que las células SNU668 tienen una mayor expresión de ARNm de E-cadherina y reprimir la expresión de ARNm de ambos N-cadherina y Slug. Por el contrario, en presencia de inhibidores de miRNA-135a, las células YCC2 muestran una disminución de la expresión de ARNm de E-cadherina y el aumento de la expresión de ARNm de ambos N-cadherina y Slug en el análisis de RT-PCR. (D) La sobreexpresión de los genes miARN-135a usando imita miRNA-135a suprime significativamente la migración y la invasión de las células SNU668. (E) La inhibición de los genes miARN-135a usando inhibidores de miRNA-135a aumenta significativamente migratoria y las células invasivas de las células YCC2. Los resultados mostrados son las medias ± SD de al menos tres experimentos. Carolina del Norte, control negativo.
Rock1 es un gen diana de los genes miARN-135a en
cáncer gástrico
Para dilucidar los mecanismos subyacentes a los efectos de los genes miARN-135a en los resultados clínicos, se realizaron búsquedas putativa objetivos mediante el uso de la base de datos TargetScan 6.2. De 718 objetivos conservadas, se seleccionaron los objetivos con mayor puntuación cuya baja regulación podría resultar en una mayor proliferación de células cancerosas, la migración y la invasión. Se encontró que Rock1 podría ser un gen diana de los genes miARN-135a ya que la inhibición o supresión de Rock1 ha sido reportado para promover la apoptosis y para suprimir la migración, invasión y proliferación de células cancerosas, incluyendo los del cáncer gástrico [28] - [30]. análisis TargetScan reveló que la secuencia 3'UTR del Rock1 tiene un sitio de unión posible que los genes miARN-135a (Figura 3A). Para confirmar si Rock1 es un objetivo de miRNA-135a, se realizó un ensayo de luciferasa. Las construcciones 3'UTR de luciferasa descritos en la sección de métodos fueron co-transfectadas en células SNU688 con imita miRNA-135a y en células YCC2 con inhibidores de miRNA-135a. También se construyó Rock1 3'UTR MUT por mutación puntual C → G en el posible sitio de unión (Figura 3A). La actividad luciferasa relativa del Rock1 3'UTR WT se incrementó significativamente en presencia de inhibidores de miRNA-135a (Figura 3B). Por el contrario, esta actividad se redujo significativamente en presencia de imita miRNA-135a (Figura 3C). En líneas celulares de cáncer gástrico, miRNA-135a y Rock1 mostraron un patrón de expresión de oposición. Western blot mostró que la expresión Rock1 se había reducido regulado en presencia de imita miRNA-135a, y hasta regulado en presencia de inhibidores de miRNA-135a (Figura 3D y 3E). Tomados en conjunto, estos resultados indican que los genes miARN-135a suprime la expresión Rock1 atacando directamente a su 3'UTR.
UTR secuencia (A) 3 'del Rock1 tiene un sitio de unión posible que los miRNA-135a, según lo determine El análisis TargetScan. El 3 'UTR construye para Rock1 WT y MUT se muestran. (B) En presencia de inhibidores de miRNA-135a, la actividad de luciferasa relativa de Rock1 3 'UTR WT considerablemente se aumentó en comparación con Rock1 3' UTR MUT en SNU668 células (p = 0,035). (C) Por el contrario, en presencia de imita miRNA-135a, la actividad de luciferasa relativa de Rock1 3 'UTR WT se redujo significativamente (p = 0,043), mientras que la actividad de luciferasa relativa de Rock1 3' UTR MUT no disminuye en la línea celular YCC2. (D) Análisis de transferencia Western muestra que la sobreexpresión de los genes miARN-135a usando imita miRNA-135a suprime la expresión de proteínas Rock1 en células de cáncer gástrico MKN28 y SNU688, que son líneas celulares que rara vez se expresan los genes miARN-135a. (E) La inhibición de los genes miARN-135a asociado con el aumento de expresión de proteínas Rock1 en células de cáncer gástrico y YCC2 KATO III, que son líneas celulares que expresan sustancialmente miRNA-135a. Los resultados mostrados son las medias ± SD de al menos tres experimentos. WT, de tipo salvaje; MUT, mutante; Carolina del Norte, control negativo.
Expresión de Rock1 se correlaciona inversamente con la de los genes miARN-135a en pacientes con EGC
El análisis de 59 pacientes con EGC mostró que los niveles de expresión de Rock1 tenían una correlación negativa significativa con los de los genes miARN-135a (r = -0,697, p & lt; 0,001; figura 4A). Además, los pacientes con la regulación de la expresión de los genes miARN-135a tenían niveles significativamente más bajos de expresión de la proteína Rock1 que aquellos con baja regulación de los genes miARN-135a (media del tumor al índice normal, 0,81 vs 1,55, p & lt; 0,001; Figura 4B) .
(A) la expresión de los genes miARN-135a se midió por análisis de PCR en tiempo real. El nivel de proteína Rock1 se evaluó mediante Western blot y se cuantifica usando el método densitométrico. En 59 pacientes con cáncer gástrico temprano, la expresión de Rock1 muestra una correlación negativa significativa con la de los genes miARN-135a (r = -0,697, p & lt; 0,001). (B) Análisis de transferencia Western muestra que los pacientes con expresión de los genes miARN-135a las reguladas tienen significativamente más alta expresión de la proteína Rock1 en los tejidos tumorales en comparación con la expresión en tejidos normales (p & lt; 0,001) correspondiente.
Rock1 es LN asociada con metástasis en EGC y está implicado en la migración celular y la invasión del cáncer gástrico suprimida por miRNA-135a
a fin de evaluar la asociación entre la expresión Rock1 y los resultados clínicos en EGC, se analizaron los patrones de expresión en referencia Rock1 para el estado de metástasis LN de los pacientes incluidos. Los pacientes con metástasis LN tenían una mayor expresión de la proteína Rock1 que aquellos sin metástasis LN (media del tumor al índice normal, 1,86 vs 0,93, p = 0,007; Figura 5A). Además, los niveles de tinción IHC Rock1 fueron similares a los de expresión Rock1 en análisis de transferencia Western (
es decir
, los pacientes sin metástasis LN tenían débiles patrones de tinción IHC [Figura 5B], pero aquellos con metástasis LN tenían una fuerte tinción IHC positivo [Figura 5C]).
(A) Western blot de 59 pacientes con cáncer gástrico inicial muestra que los pacientes con metástasis LN tienen mayor expresión de proteínas Rock1 que los pacientes sin metástasis LN (p = 0,007). imágenes microscópicas representativas de secciones tumorales con tinción inmunohistoquímica (aumento original x 100) muestran que (B) de los pacientes con cáncer gástrico tempranas sin LN metástasis tienen ninguna expresión Rock1 en los tejidos tumorales, pero (C) los que tienen LN metástasis tienen una fuerte expresión Rock1 dentro de la nuclear membrana y el citoplasma de los tejidos tumorales. (D) Rock1 siRNA suprime significativamente la migración (p & lt; 0,001) y la invasión (p = 0,002) en SNU668 células de cáncer gástrico. (E) la expresión de proteínas Rock1 se aumenta por el tratamiento con inhibidores de miRNA-135a y la disminución mediante el tratamiento con Rock1 siRNA, y se asocia con un aumento del nivel de los genes miARN-135a en células de cáncer gástrico YCC2, lo que sugiere que Rock1 patrones de expresión de proteínas están inversamente correlacionados con los de la expresión de los genes miARN-135a. (F) Cuando las células YCC2 son tratados con inhibidores de miRNA-135a, invasión celular y la migración son similares o incluso aumentado en comparación con los controles. Rock1 siRNA o combinado Rock1 siRNA y los inhibidores de miRNA-135a disminuyen la migración celular (p = 0,003) y la invasión (p = 0,017). Estos sugieren que Rock1 compensa los efectos supresores de tanto la migración y la invasión que es inducida por los genes miARN-135a. Los resultados mostrados son las medias ± SD de al menos tres experimentos. LN, ganglio linfático; Carolina del Norte, control negativo.
Por último, para investigar si las capacidades de migración e invasión suprimidas conferidos por el miARN-135a regulación observada en líneas celulares de cáncer gástrico fueron el resultado de Rock1 regulación, que realizado ensayos de migración e invasión utilizando líneas celulares de cáncer gástrico transfectadas con siRNA específico Rock1. Rock1 siRNA suprimido actividades migratorias e invasivas en SNU668 células (Figura 5D). En las células YCC2 co-transfectadas con inhibidores de miRNA-135a y Rock1 siRNA (Figura 5E), ensayos de migración e invasión mostraron que la inhibición de Rock1 de siRNA atenuó significativamente los potenciadores efectos migratorias e invasivas de miRNA-135a baja regulación de los inhibidores de miRNA-135a (Figura 5F).
en conjunto, estos resultados sugieren que Rock1 se asocia con LN metástasis en pacientes EGC, y que esto resulta del aumento de la expresión Rock1 en el contexto de los genes miARN-135a baja regulación. Por lo tanto, Rock1 puede estar implicado en suprimido-miARN-135a metástasis del cáncer gástrico.
Discusión
En el presente estudio, hemos encontrado que los genes miARN-135a tuvo papeles supresores tumorales en el cáncer gástrico. En los pacientes con EGC, la baja regulación de los genes miARN-135a era un factor de riesgo independiente para LN metástasis. En células de cáncer gástrico, regulado por los genes miARN-135a suprime la carcinogénesis gástrica por la proliferación de células suprimir, EMT, y la metástasis. Por otra parte, también hemos identificado un nuevo gen diana de los genes miARN-135a, Rock1, que se asoció con LN metástasis en el cáncer gástrico.
En los pacientes con EGC, la evaluación de la metástasis LN antes del tratamiento es un paso importante en la determinación de estrategias de tratamiento. tratamientos menos invasivos, tales como la resección endoscópica [5] - [7] o cirugía de navegación centinela LN [9], [10] puede ser posible en los pacientes sin EGC LN metástasis. Estos enfoques de tratamiento han mejorado la calidad de vida del paciente en relación con complicaciones tardías asociadas con los tratamientos quirúrgicos estándar incluyendo el síndrome de dumping, la pérdida de peso y síntomas asociados con el reflujo-[31]. Por lo tanto, se requiere que los biomarcadores más específicos y sensibles para predecir el estado de LN metástasis en pacientes con EGC. En el presente estudio, los genes miARN-135a baja regulación fue un factor independiente de LN metástasis, y el valor de predicción del estado de la expresión de miRNA-135a era relativamente alta, con una sensibilidad del 75% y una especificidad del 73%. Aunque se necesitan más estudios de validación, estos resultados mostraron que los niveles de medición de miRNA-135a antes de determinar el plan de tratamiento para los pacientes con EGC podría ser una prueba útil para predecir el estado LN.
Curiosamente, se ha informado de miRNA-135a ser de supresión tumoral y oncogénico. La sobreexpresión de los genes miARN-135a se ha asociado con la supresión de la proliferación de tumores y el crecimiento de carcinoma de células renales [21] y con aumento de la apoptosis y una mejor supervivencia libre de enfermedad en el linfoma [22]. En contraste, los genes miARN-135a estaba involucrado en la progresión de cáncer colorrectal [32] y en el aumento de la migración de células de mama y la invasión [33]. En el presente estudio, los genes miARN-135a ha demostrado ser un supresor tumoral miRNA, que está de acuerdo con los resultados de un estudio anterior [23]. Especialmente, la mayor expresión de los genes miARN-135a suprimido varias etapas de la carcinogénesis gástrica incluyendo la proliferación, la migración y la invasión. Además, también se encontró que los genes miARN-135a podría suprimir EMT, que se ha informado de que se asocia con el inicio del proceso de múltiples etapas de la carcinogénesis y la promoción de metástasis [34], [35]. Antes de este estudio, la asociación entre los genes miARN-135a y EMT no se ha investigado, aunque estudios previos han demostrado que los miRNAs como miARN-27 [19], la familia de miRNA-200 [20], los genes miARN-7 [36] y miRNA-1228 EMT [37] reprimir a través de sus propios genes diana en el cáncer gástrico. Tomados en conjunto, los genes miARN-135a es un supresor tumoral miARN en el cáncer gástrico.
Un estudio previo análisis de 353 tejidos de cáncer gástrico humano mostró que los patrones de expresión de miRNAs son diversas y que algunos miRNAs se asocia con la progresión y pronóstico de los gástrica cáncer [14]. En el estudio, los genes miARN-135a fue clasificado como un miARN oncogénicos en el cáncer gástrico en base a los resultados de los análisis de microarrays de ADN. Sin embargo, en una reciente [23] y nuestro estudio, los genes miARN-135a actuó como un supresor de tumores a pesar de la alta tasa de pacientes con miRNA-135a regulación.