Extracto
Un creciente cuerpo de evidencia indica que el miR-149 se puede suprimir tanto y promover el crecimiento del tumor en función de el tipo de tumor. Sin embargo, se desconoce la función de miR-149 en la progresión del cáncer gástrico (GC). Aquí mostramos que el miR-149 es un supresor tumoral en el cáncer gástrico humano. la expresión de miR-149 se reduce en las líneas celulares y muestras clínicas GC en comparación con las células epiteliales gástricas normales y tejidos, respectivamente. Los niveles de expresión de miR-149 también se correlacionan con el grado de diferenciación de las células de GC y tejidos. Por otra parte, la expresión ectópica de miR-149 en células de cáncer gástrico inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular mediante la regulación negativa de
ZBTB2
, un potente represor de la vía de la FRA-HDM2-p53-p21, con un potencial sitio de unión para miR-149 en 3'UTR de su ARNm. También se encuentra que la expresión ZBTB2 aumentos en las células y tejidos de GC en comparación con las células normales gástrico tejidos epiteliales y, respectivamente. El silenciamiento de
ZBTB2
conduce a la supresión del crecimiento celular y la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1, lo que indica que ZBTB2 puede actuar como un oncogén en GC. Por otra parte, la transfección de miR-149 imita a las células de cáncer gástrico induce la baja regulación de ZBTB2 y HDM2, y sobre regulación de la IRA, p53, p21 y en comparación con los controles. En resumen, nuestros datos sugieren que el miR-149 funciona como un supresor tumoral en el cáncer gástrico humano por, al menos parcialmente, a través, de orientación
ZBTB2
Visto:. Wang Y, X Zheng, Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J, et al. (2012) microARN-149 inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular a través de la focalización de los
ZBTB2
en el cáncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10.1371 /journal.pone.0041693
Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Marzo, 2012; Aceptado: 25 Junio 2012; Publicado: 29 de octubre 2012
Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Ciencias Naturales Nacional de China (no. 30872966 y no. 31071135), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. ° 81.000.864, no. 81172290, no. 91129723, no. 81090270, y no. 81090273) y la Fundación de Ciencias de china Postdoctoral (n. ° 20100471776). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres más comunes y las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, especialmente en Asia Oriental, según la última estimación mundial publicado en 2011 [1]. A pesar de una notable disminución en la incidencia de GC en la mayoría de las partes del mundo, todavía hay una gran carga de la gran cantidad de casos de CG y las muertes en todo el mundo. La carcinogénesis de GC es un proceso muy complicado [2] - [5] que implica la desregulación de múltiples genes [6] - [8], incluyendo oncogenes [9] - [14] y tumorales supresores de [15] - [18]. Sin embargo, los mecanismos moleculares necesarios para el desarrollo y la progresión de GC deben estudiarse con mayor detalle.
Los microARN (miRNA) son un grupo de forma endógena expresó, no codificante ARN pequeños (20-25 nucleótidos de longitud) que se sabe que forma negativa regular la expresión génica mediante la supresión de la traducción o la disminución de la estabilidad de los ARNm mediante la unión directamente a la región 3 'no traducida (3'-UTR) del ARNm diana [19], [20]. La acumulación de pruebas indica que miRNAs juegan un papel importante en el desarrollo, el metabolismo, la proliferación, diferenciación y apoptosis. Además, la regulación post-transcripcional aberrante de ARNm por miRNAs está relacionado con la tumorigénesis [21]. los perfiles de expresión anormales de miRNAs se han detectado en varios tipos de tumores humanos, incluyendo de pulmón [22], de mama [23], de próstata [24], el hígado [25], colon [26], y el cáncer gástrico [27]. Por otra parte, algunos miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores de tumores mediante la regulación de la expresión de genes diana que desempeñan papeles importantes en la progresión del ciclo celular, apoptosis, o la proliferación. miR-22 [28], el miR-101 [29], y miR-7 [30], han demostrado ser downregulated en muestras de tumores y funcionan como supresores de tumores; miR-17 [31] y miR-21 [32] han demostrado ser upregulated en muestras de tumores y funcionan como oncogenes. Estos estudios indican que la desregulación de miRNAs participa con frecuencia en la carcinogénesis y la progresión del cáncer.
Estudios recientes han sugerido que miR-149 puede desempeñar un papel importante en varias enfermedades, incluyendo la progresión de tumores malignos. miR-149 se ha demostrado que funcionar como un supresor de tumores [33] y un oncogén [34] en el desarrollo de múltiples tipos de tumores sólidos. Por ejemplo, la pérdida de miR-149 conduce a la ganancia de función de algunos oncogenes y se correlacionan con el grado tumoral en carcinoma de células renales [35], astrocitomas [36], y el carcinoma de próstata [37]. La expresión ectópica de miR-149 induce la apoptosis de neuroblastoma y células HeLa [33]. La expresión elevada de miR-149 se ha informado que es importante en la progresión del carcinoma nasofaríngeo [38] y el melanoma metástasis [34]. Por otra parte, la desregulación de miR-149 también está implicado en algunas enfermedades no neoplásicas. Por ejemplo, la regulación por disminución de la expresión de miR-149 está implicado en el desarrollo de la mielofibrosis primaria, policitemia vera, trombocitemia esencial y [39], y la pérdida de miR-149 puede suprimir el virus de la hepatitis C (VHC) la abundancia de ARN [40]. Sin embargo, el patrón de expresión y el papel de miR-149 en el desarrollo de GC sigue siendo poco clara.
En el presente estudio, se encontró que el miR-149 es significativamente downregulated en líneas celulares y muestras clínicas GC en comparación con el normal de las células gástrico tejidos epiteliales y no tumorales adyacentes, respectivamente. La expresión ectópica de miR-149 inhibe la proliferación e induce la detención G0 /G1 del AGS y SGC7901 células
in vitro fotos: por la orientación
ZBTB2
. Por otra parte, el agotamiento de los
ZBTB2 fotos: por siRNA resultados en la inhibición de la proliferación y la detención del ciclo celular. El patrón de expresión de miR-149 y ZBTB2 en líneas celulares y muestras clínicas de GC, se correlacionó inversamente, lo que sugiere, además, que
ZBTB2
es un gen diana de miR-149. Introducción de miR-149 resulta en alteraciones en la expresión de p53, p21, ARF, y HDM2, miembros de la vía ARF-HDM2-p53-p21 que está regulada por ZBTB2. En resumen, estos resultados confirman que el miR-149 está regulado por disminución en las células de GC y muestras clínicas y sugieren que el miR-149 funciona como un supresor del crecimiento de células de cáncer gástrico mediante la inhibición de la proliferación y la progresión del ciclo celular.
la expresión de miR-149 es downregulated en líneas celulares de GC y muestras clínicas
para evaluar el papel de miR-149 en la carcinogénesis de GC, que utilizó por primera vez RT-PCR cuantitativa para medir la expresión de miR-149 en las líneas celulares GC humanos (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, y MKN28) y se encontró que el miR-149 se downregulated en líneas celulares de GC en comparación con una línea celular epitelial gástrica normal, GES-1 (fig. 1A). En particular, el nivel de expresión de miR-149 se correlacionó positivamente con el grado de diferenciación de las células de GC. Es decir, el nivel de expresión de las líneas celulares en pobremente diferenciados, tales como MKN45, GC9811, y AGS miR-149, es significativamente menor que en líneas celulares bien diferenciados moderadamente y. La expresión de miR-149 en células moderadamente diferenciados, SGC7901, es menor que en la línea celular bien diferenciado, MKN28 (fig. 1A).
A. expresión de miR149 en 5 líneas celulares de cáncer gástrico humano en relación con la línea celular humana normal gástrica epitelial, GES-1, se midió mediante RT-PCR cuantitativa (Los valores indican la media ± SEM, n = 3, t-test, *, p & lt; 0,05; *** p & lt; 0,001). B. Expresión de miR149 en 44 muestras clínicas de cáncer gástrico humano en relación con sus muestras normales apareadas se midió mediante RT-PCR cuantitativa (Los valores indican la media ± SEM, n = 3, t-test, ** p & lt; 0,01). C. comparación de la expresión relativa de miR149 en muestras clínicas de cáncer gástrico humano pobremente, moderadamente diferenciados y altamente. (Los valores indican la media ± SEM, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA, F = 65,391, *** p & lt; 0,001).
Con el fin de determinar si los niveles de miR-149 también se correlacionan con el grado de diferenciación de los tumores se analizó la expresión de miR-149 en 44 muestras clínicas GC humanos, incluyendo 13 pobremente, moderadamente 16, y 15 muestras bien diferenciadas. Hemos encontrado que la expresión de miR-149 en tumores gástricos es notablemente menor que en los tejidos adyacentes normales de la misma (Fig. 1B). Por otra parte, la expresión de miR-149 en los tumores más diferenciados fue mayor que en los tumores menos diferenciados (Fig 1C, F = 65,391,
p
. & Lt; 0,001). Además, disminuyó la expresión de miR-149 se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos (*
p = 0,046
) y el estadio TNM (**
p = 0,0011
) (Tabla 1).
la expresión ectópica de miR-149 inhibe la proliferación e induce la detención G0 /G1 en AGS y SGC7901 células
Para investigar el papel de miR-149 en células GC, GC que utilizan mal y moderadamente diferenciado líneas celulares, AGS y SGC7901, respectivamente. AGS y SGC7901 células fueron transfectadas transitoriamente con eithermature miR-149 imita, inhibidor, falsamente transfectadas, o miR-NC. Como se muestra en la figura 2A, 2D, cuantitativos RT-PCR resultados muestran que la expresión de miR-149 imita o inhibidores upregulate significativamente o regular a la baja la expresión de miR-149, respectivamente, en AGS y SGC7901 células de la primera-quinta después de la transfección día (Fig . 2A, F = 8,429,
p = 0,003
; Fig. 2D, F = 8,595,
p
= 0,003) en comparación con NC y controles simulados
a & amp.; RE. El nivel de miR149 se midió por PCR cuantitativa en tiempo designado (análisis ANOVA de una vía, los valores indican la media ± SEM, la figura 2A, F = 8,429, p = 0,003;. La Fig. 2D, F = 8,595, p = 0,003 ). B & amp; E. células GC transfectadas con miR-149 imita e inhibidor sometidos a ensayo de MTT al día durante 6 días (análisis ANOVA de dos vías, la figura 2B, F = 27.47, P & lt;. 0.001; Fig 2E, F = 44,061, p & lt;. 0.001). C & amp; F. Células Células GC transfectadas con el miR-149 imita y el inhibidor se recogieron para el análisis FACS después de 72 h (Los valores indican la media ± SEM, n = 3, ANOVA de una vía, la figura 2C, F = 134.177, p. & lt; 0,001; Fig . F, F = 58,792, p = 0,003).
AGS y SGC7901 células transfectadas con el miR-149 imita e inhibidores mostraron niveles más altos de la proliferación celular significativamente menor y, respectivamente, que la NC o simulacro grupos tal como se determina mediante el ensayo de MTT (Fig 2B, F = 27,47, p & lt;. 0.001; Fig. 2E, F = 44,061, p & lt; 0,001). La transfección de células AGS y SGC7901 con miR-149 imita los resultados en la fase de detención G1 significativa en comparación con NC y controles falsos (
p Hotel & lt; 0,05). Por otra parte, el tratamiento con inhibidores de miR-149 dio lugar a un menor número de AGS y SGC7901 células en G1 detención respecto al CN y controles simulados (
p Hotel & lt; 0,05) (Fig. 2C, F = 134.177,
p
& lt; 0,001;. la Fig. 2F, F = 58,792,
p = 0,003
)
ZBTB2
es un objetivo de miR-149
los datos anteriores sugieren que miR-149 podría ser un supresor del crecimiento celular por la orientación GC genes que controlan la proliferación y la progresión del ciclo celular (33 a 34) (38). Por lo tanto, se realizaron búsquedas de posibles objetivos adicionales de miR-149 de la base de datos TargetScanHuman. Se identificaron numerosos genes diana potenciales miR-149, incluyendo
ZBTB2
, un factor de transcripción de la familia POK y potente represor de la vía de ARF-HDM2-p53-p21 (41).
ZBTB2
se encontró que tenía supuestos sitios de unión de miR-149 se encuentren en su 3'UTR (Fig. 3A). Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa para verificar si
ZBTB2
es un objetivo directo de miR-149 utilizando AGS y SGC7901 células. Nos co-transfectadas AGS y SGC7901 células, respectivamente, con un vector psiCHECK-2 que contiene ya sea 3'UTR de ZBTB2 o mutado 3'UTR de ZBTB2, e imita de miR-149 o inhibidores de miR-149. De tipo salvaje y mutante ZBTB2-3'UTR que contiene el supuesto sitio de unión de miR-149 se clonaron en psiCHECK-2 vector aguas abajo del gen de la luciferasa (Fig. S1). Introducción de miR-149 redujo significativamente la actividad de la luciferasa a partir del vector reportero ZBTB2 3'UTR (Fig 3B-3C,
p
. & Lt; 0,001), pero no afectó a la actividad de la luciferasa de la ZBTB2-3 mutante 'UTR vector indicador. Estos datos sugieren que el miR-149 regula directamente
ZBTB2
niveles de expresión. Además, no hay una disminución significativa en la actividad luciferasa relativa en las células co-transfectadas con miR-149 inhibidor o 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vector (Fig. 3B-3C). Es tal vez debido a la falta de interacción entre 3'UTR de ZBTB2 y endógeno miR-149, por lo tanto, la disminución de la expresión de miR-149 no aumentó la actividad de luciferasa a partir del vector reportero ZBTB2-3'UTR. Estos resultados confirman además que el miR-149 suprime la expresión ZBTB2 apuntando a la 3'-UTR de
ZBTB2
ARNm.
A. El diagrama esquemático muestra el constructo de Luc-ZBTB2 3'UTR y Luc-ZBTB2 3'Mut UTR.Both Luc-ZBTB2 3'UTR y Luc-ZBTB2 3'Mut UTR fueron clonados en un plásmido pmirGLO aguas abajo de la región codificante de la luciferasa de luciérnaga entre los sitios de PmeI y XbaI. B & amp; C. células AGS (B) o células SGC7901 (C) fueron co-transfectadas con los psiCHECK-2 construcciones que contienen ya sea ZBTB2 3'UTR o ZBTB2 3'Mut UTR y, o bien el inhibidor de miR-149 o el miR-149 imita durante 48 h. Los valores indican la actividad relativa de luciferasa después de la normalización de la actividad de luciferasa de Renilla (Los valores indican la media ± SEM, n = 3, Una forma de análisis de ANOVA, ** p & lt; 0,01).
miR-149 y la expresión ZBTB2 se correlaciona negativamente en las células de GC y muestras clínicas
Para investigar más a fondo la relación entre el miR-149 y ZBTB2, se analizó la expresión de ZBTB2 en las células de GC utilizando el Western Blot y en los tejidos de GC mediante inmunohistoquímica. Se encontró que las células GC tienen significativamente más alto nivel de expresión de ZBTB2 que la célula epitelial gástrica normal, GES-1 (Fig 4A a-b F = 167.843,
p
. & Lt; 0,001). expresión ZBTB2 negativamente correlacionada con el grado de diferenciación de las células de GC; pobremente diferenciados tejidos GC mostraron un nivel de expresión ZBTB2 significativamente mayor que los tejidos GC bien diferenciadas y emparejaron los tejidos gástricos normales (Figura S2A-B, F = 117.280,
p
. & lt; 0,001).
ZBTB2
los niveles de expresión de ARNm son coincidentes con los niveles de proteína (Fig 4B a, F = 283.355,
p
. & Lt; 0,001). Por otra parte, la expresión de miR-149 y ZBTB2 se correlaciona inversamente (Fig. 4B b,
p = 0,033
, R = -0,908). A continuación, medir los niveles de expresión de miR-149 y
ZBTB2
mediante RT-PCR cuantitativa en 5 líneas de células GC (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, y MKN28) (Fig. 4C a) y 18 GC clínica muestras (6 pobremente, moderadamente 6, y 6 muestras bien diferenciadas) (Fig. 4C b). Los resultados confirman que el nivel de mRNA de
ZBTB2
se correlaciona negativamente con la expresión de miR-149 (Figura 4C un
p = 0,033
, R = -0,847;. La Fig. 4C b,
p Hotel & lt; 0,001, R = -0,908). Por otra parte, AGS (Fig. 4D) y SGC7901 células (Fig. 4E) transfectadas con miR-149 imita haber disminuido significativamente la expresión de ZBTB2 en los niveles de proteína (paneles A-B) y los niveles de mRNA (panel c) en comparación con mock o NC células (
p Hotel & lt; 0,001). Nuestros hallazgos indican que el miR-149 se puede regular directamente la expresión de
ZBTB2
.
A. La expresión de ZBTB2 en las células de GC y la célula epitelial gástrica normal fueron examinados por Western Blot (a), y se muestra como media ± SEM (b, normalizado a la actina, el análisis ANOVA de una vía, M = 167,843, *** p & lt; 0,001) . B. Expresión de ZBTB2 y la expresión de miR-149 en células gástricas (a, los valores indican la media ± SEM, análisis de ANOVA de un factor, F = 283.355, p & lt; 0,001) y muestras clínicas (b) analizó por PCR cuantitativa ( t-test, los valores indican la media ± SEM, *, p & lt; 0,05; ** p & lt; 0,01; *** p & lt; 0,001). parcelas C. de dispersión que muestra la correlación lineal negativa entre la expresión mRNA de ZBTB2 y la de miR-149 en células gástricas: MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 y MKN28 (a) y en 18 muestras clínicas gástricos (b) (P: mal diferenciada; M: moderadamente diferenciado; W: bien diferenciado). D. Expresión de ZBTB2 examinado por Western Blot (a, b: los valores indican la media ± SEM, normalizado a la actina, One Way-análisis de ANOVA, F = 682.839, *** p & lt; 0,001) y la PCR cuantitativa (c, el los valores indican la media ± SEM, F = 1420.125, *** p & lt; 0,001) después de haber sido tratado con miR-149 imita en células AGS. E. Expresión de ZBTB2 examinado por Western Blot (a, b: los valores indican la media ± SEM, normalizado a la actina, One Way-análisis de ANOVA, F = 2459.400, *** p & lt; 0,001) y la PCR cuantitativa (c, el los valores indican la media ± SEM, análisis de ANOVA de un factor, F = 925.875, *** p & lt;. 0.001) después de haber sido tratado con miR-149 imita en SGC7901 células
miR-149 suprime GC proliferación celular y la progresión del ciclo celular por la orientación
ZBTB2
a continuación se confirmó que miR-149 mediada por la inhibición de la proliferación y la inducción de la detención del ciclo celular en las células GC requiere la orientación de
ZBTB2
.
ZBTB2
expresión fue derribado el uso de siRNAs en AGS y SGC7901 células. Western Blot (Fig. 5A, a-c) y análisis de PCR cuantitativo mostraron que el agotamiento de
ZBTB2
por siRNA transfección podrían ser compensados de manera significativa por el inhibidor de miR-149 y un aumento marcado de ZBTB2 se observó en las células transfectadas con inhibidores de miR-149 (figura 5B,
p
. & lt; 0,001). MTT ensayo muestra que la proliferación de las células transfectadas con siRNA-ZBTB2 fue suprimido y la proliferación de las células transfectadas con inhibidores de miR-149 aumentó significativamente en comparación con las células transfectadas con siRNA-NC (control) y siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Fig. 5C ). Por otra parte, la inhibición de
ZBTB2
expresión promueve G0 detención /G1 y suprime la detención del ciclo celular G0 /G1 inducida por el miR-149 en tratamiento con inhibidores de AGS y SGC7901 células en comparación con las células control NC (Fig. 5D-5E,
p Hotel & lt; 0,001). Nuestros hallazgos sugieren que el miR-149 inhibe la proliferación de células de GC y la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de
ZBTB2
expresión.
A. La expresión de ZBTB2 examinado por Western Blot (a-c, normalizado a la actina, los valores indican la media ± SEM, análisis de ANOVA de un factor, por AGS, F = 3163.690,
p Hotel & lt; 0,001; para SGC7901 , F = 3979.861,
p Hotel & lt; 0,001). B. Expresión de ZBTB2 examinado por PCR cuantitativa (los valores indican la media ± SEM, análisis de ANOVA de un factor, por AGS, F = 3785.817,
p Hotel & lt; 0,001; para SGC7901, F = 7392.941,
p Hotel & lt; 0,001). C. GC células tratadas con siRNA-NC, siRNA-ZBTB2, miR-149 + inhibidor de siRNA-ZBTB2, o miR-149 inhibidor sometido a ensayo MTT al día durante 6 días (los valores indican la media ± SEM, de dos vías de análisis de ANOVA , por AGS, F = 18,553,
p Hotel & lt; 0,001; para SGC7901, F = 24,857,
p Hotel & lt; 0,001). D. GC células transfectadas las células tratadas con siRNA-NC, siRNA-ZBTB2, miR-149 + inhibidor de siRNA-ZBTB2, o miR-149 inhibidor se recogieron para el análisis FACS después de 72 h (los valores indican la media ± SEM, n = 3 , *,
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01; ***
p
. & lt; 0,001) guía empresas
Introducción de miR-149 altera la expresión de proteínas y ZBTB2
ZBTB2 se ha informado que es un potente represor de la vía de la FRA-HDM2-p53-p21, que es importante en el ciclo celular del ciclo celular relacionadas con el regulación (41). Para investigar la regulación de estas proteínas por el miR-149 en células GC, transfectadas las células AGS y SGC7901 con miR-149 imita o miR-NC y realizó RT-PCR y análisis de Western blot para ZBTB2 genes diana. Como se muestra en la Figura 6A-6B, la expresión ectópica de miR-149 regula a la baja la expresión de ZBTB y HDM2, y regula al alza la expresión de ARF, p53, y p21 (
p
& lt; 0,001). Estos datos son consistentes con la función de ZBTB2 en la represión de la transcripción de ARF, p53, y p21 y la activación de la expresión de HDM2 (41). Por otra parte, la expresión ectópica de ZBTB2 por transfección invierte la reducción mediada por miR-149 en la expresión de HDM2 y el aumento de ARF, p53, p21 y la expresión en AGS y SGC7901 células (Fig. 6A-B). . ZBTB2 expresión ectópica se confirmó en AGS transfectadas y SGC7901 células (Figura S3, SGC7901 células, F = 806.365,
p Hotel & lt; 0,001; células AGS, F = 1436.300,
p Hotel & lt; 0,001). ARF, p53 y p21 promover la progresión del ciclo celular, por lo tanto, su regulación a la baja de la expresión de miR-149 imita explica la detención en la fase G0 /G1 en AGS y SGC7901 células.
A, Expresión de ZBTB2 (F = 629.069,
p Hotel & lt; 0,001), HDM2 (F = 869.909,
p Hotel & lt; 0,001), ARF (F = 1425.913,
p Hotel & lt; 0,001), p53 (F = 6608.889,
p Hotel & lt; 0,001) y p21 (F = 1818.737,
p Hotel & lt; 0,001) en la celda SGC7901 fueron examinados por Western Blot (a), y se muestra como media ± SEM ( b, normalizado a la actina, una vía de análisis de ANOVA, n = 3, ***
p Hotel & lt; 0,001). B, Expresión de ZBTB2 (F = 527.382,
p Hotel & lt; 0,001), HDM2 (F = 631.259,
p Hotel & lt; 0,001), ARF (F = 1517.081,
p Hotel & lt; 0,001), p53 (F = 1753.000,
p Hotel & lt; 0,001) y p21 (F = 2751.400,
p Hotel & lt; 0,001) en células AGS fueron examinados por el oeste Blot (a), y se muestra como media ± SEM (b, normalizado a la actina, el análisis ANOVA de una vía, n = 3, ***
p Hotel & lt; 0,001).
Discusión
la evidencia creciente sugiere que los miRNAs juegan un papel crítico en la carcinogénesis y la progresión del cáncer [21]. La alteración de los niveles de expresión de genes miARN han sido implicados en el inicio y desarrollo de tumores; modulación de miRNAs que funcionan como reguladores negativos de oncogenes o supresores tumorales resultados en la promoción de la proliferación de células de cáncer y el crecimiento [28] - [32]. Estudios anteriores han demostrado que el papel de miR-149 en la progresión de diversos tipos de tumores es controvertido [33] - [36], [38]. El patrón de expresión y los objetivos de miR-149 varían en los diferentes tipos de tumores. expresión de miR-149 es downregulated en algunos tumores, que funciona como un supresor de tumores por la orientación oncogenes en algunos tipos de cáncer. Por ejemplo, en el carcinoma renal de células claras de miR-149 es downregulated y sus posibles objetivos fueron identificados como KCNMA1 y LOX (35). Además, miR-149 también es downregulated en células de glioblastoma y se ha propuesto para actuar como un supresor de tumores por la orientación Rap1b, CD47, CCN1, y NXF1 [36]. Por el contrario, miR-149 también puede funcionar como un supresor de tumores por la orientación ciertos oncogenes. La detección de los perfiles de expresión de genes miARN en diferentes etapas clínicas de carcinoma nasofaríngeo (NPC) y NPC metástasis en ganglios linfáticos muestra que la expresión de miR-149 está regulada positivamente en la APN y la expresión de su gen diana,
Smad2
, se reduce con el la progresión de la NPC [38]. Un papel oncogénico similar para el miR-149 también se observó en el melanoma en los que la regulación al alza de miR-149 provoca regulación a la baja de GSK3-α y la regulación al alza de MCL-1, lo que resulta en resistencia a la apoptosis [34]. Hasta el momento, se sabe poco sobre el papel de miR-149 en el cáncer gástrico. En este caso, nos informan de que la expresión de miR-149 se reduce notablemente en varias líneas celulares de cáncer gástrico y muestras clínicas en comparación con el normal de las células del epitelio gástrico y los tejidos normales adyacentes coincidentes, respectivamente. Es importante destacar que, el nivel de expresión de miR-149 se asocia con el grado de diferenciación de las células de GC y las muestras; pobremente diferenciadas o células GC muestras tienen una menor expresión de miR-149 en comparación con muestras bien diferenciadas. La expresión ectópica de miR-149 inhibe la proliferación de células y la progresión del ciclo celular mediante la orientación
ZBTB2 Hoteles en AGS y SGC7901 células. miR-149 y expresión ZBTB2 están correlacionados negativamente en las células de GC y muestras clínicas, y la sobreexpresión de miR-149 hace que la regulación por disminución de
ZBTB2
. El agotamiento de ZBTB2 como resultado la inhibición de AGS y células SGC7901 proliferación y la progresión del ciclo celular. En conjunto, estos resultados demuestran, por primera vez, que ZBTB2 puede funcionar como un oncogén en la tumorigénesis del cáncer gástrico.
Nuestros datos muestran que la introducción de miR-149 en células GC induce la detención del ciclo celular, lo que sugiere que objetivos de miR-149 pueden estar implicados en la regulación del ciclo celular. ZBTB2 es un factor de transcripción de la familia POK que puede suprimir la vía ARF-HDM2-p53-p21 [41]. ARF, un supresor de tumor [42], puede ser inducida por la estimulación mitogénica sostenido y juega un papel clave en la activación de p53 de forma independiente y el control de la estabilidad de p53 a través de la interacción con HDM2 [43], un regulador importante de p53. El supresor de tumores p53 desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis celular a través de la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis cuando las células se someten a factores de estrés, tales como la hipoxia, el daño del ADN, y la disfunción de los telómeros [44]. p21, un gen diana p53, media la fase de detención G1 del ciclo celular a través de la unión y la inhibición de la actividad de los complejos de CDK1 [45] ciclina-CDK2 o. ZBTB2 puede reprimir la transcripción de ARF, p53, y p21, e inducir la expresión HDM2 [41]. Para validar si los efectos del ciclo celular inducida por la expresión de miR-149 es mediada por la pérdida ZBTB2, se analizó la expresión de HDM2, ARF, p53 y p21 de AGS y SGC7901 células transfectadas con el miR-149 imita. Se encontró que la expresión ectópica de miR-149 resulta en una mayor expresión de ARF, p53, y p21 y la disminución de la expresión de HDM2 y ZBTB2. Estos resultados apoyan la idea de que miR-149 ejerce su función de inhibición de la proliferación de células de GC y la progresión del ciclo celular por la orientación
ZBTB2
modulando con ello la expresión de los reguladores aguas abajo de la progresión del ciclo celular.
En resumen , nuestros datos indican que miR-149 puede funcionar como un supresor de tumores en células de cáncer gástrico y desempeña un papel importante en la inhibición de
ZBTB2
. Por lo tanto, la regulación negativa de miR-149 promueve la proliferación celular GC y la progresión del ciclo celular. Además, nuestros resultados muestran que ZBTB2 puede funcionar como un oncogén en el desarrollo de cáncer gástrico. Sin embargo, dado el hecho de que cada miARN puede regular muchos genes diana que pueden afectar a la carcinogénesis de diferentes maneras, se necesitan más estudios para investigar otros miR-149 objetivos que pueden tener un papel crítico en la tumorigénesis GC. El presente estudio también proporciona nuevos penetración en el papel de miR-149 en la progresión del cáncer gástrico humano e indica que el miR-149 puede servir como una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer gástrico.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Para obtener muestras de tejido, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los pacientes. Los procedimientos utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Cuarta Universidad Médica Militar y se ajustaban a la Declaración de Helsinki, y con la legislación local.
Líneas celulares y condiciones de cultivo
gástrico líneas de cáncer de AGS, MKN28, MKN45 fueron comprados de AGCC y, líneas celulares y GC9811 SGC7901 se obtuvieron del Instituto de Oncología de Beijing. Todas las líneas celulares se mantuvieron en nuestro instituto de acuerdo con los protocolos recomendados. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C en un 5% de CO
2 incubadora .
muestras de seres humanos
Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Cuarta Universidad médica Militar. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los especímenes de cáncer gástrico paciente samples.Human (n = 44) y las muestras no tumorales adyacentes emparejados fueron obtenidos de pacientes en el Hospital Xijing de Enfermedades Digestivas, la Cuarta Universidad Médica Militar, con el consentimiento informado de cada paciente.
purificación de ARN, síntesis de ADNc y la PCR cuantitativa (QRT-PCR) en tiempo real
El ARN total de las células cultivadas se extrajo con reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con protocolo y los ARN del fabricante fueron almacenadas a -80 ° C antes de QRT-PCR análisis. expresión maduro miR-149 se detectó usando un qRT-PCR Kit mirVana TM miRNA detección (Ambion Inc. Austin, Texas), con U6 como control interno. expresión ZBTB2 se detectó con los cebadores F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ', y GAPDH se utilizó como control interno. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa 1,5% teñido con bromuro de etidio y se visualizaron con UV.
Transfección de células
El humano miR-149 duplex imitan y el inhibidor de control (miR-149) y negativo mímica oligonucleótido dúplex (miR-NC) se han diseñado y realizado por Ribobio (Guangzhou, Guangdong, china). El ARN pequeño de interferencia (siRNA) para ZBTB2 y el ARN control negativo (siRNA-NC) fueron sintetizados y purificados por Genepharma (Shanghai, China). miRNAs, siRNAs y ZBTB2 plásmido de ADNc (FulenGen Co. China) fueron transfectadas por el reactivo LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ZBTB2 siRNA secuencia: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; La secuencia de siRNA NC: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'
miARN objetivo de predicción
Para encontrar posibles genes miARN, TargetScanHuman sitio web (. http://www.targetscan.org/) se utilizó, la energía libre de unión se calculó y sitios Biding se analizaron mediante http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid sitio web.
Vector construcciones y ensayo indicador de luciferasa
Para construir el plásmido ZBTB2-3'UTR, una de tipo salvaje fragmento de ARNm ZBTB2 humana 3'-UTR (1238-1244 nt, GenBank adhesión no NM_020861.1.) que contiene el putativo miR-7 secuencia de unión se amplificó por RT-PCR y se clonó en el sitio entre Xho I y Not I aguas abajo del gen indicador de luciferasa del vector psiCHECK ™ (Promega, EE.UU.). Un mutante del único sitio de unión de miR-7 (5'-GAGCCAG-3 'a 5' ACCGCGC-3 ') en el fue incluido por mutagénesis dirigida Kit (SBS Genetech, Beijing, China 3'-UTR de ZBTB2 ). Salvaje y mutantes tipos de vectores pmirGLO-ZBTB2-UTR se validaron mediante secuenciación de ADN
Las secuencias de nucleótidos de cebadores para ZBTB2-3'UTR (MT) clon: mutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5'.