Extracto
microRNAs desregulados juegan un papel en el desarrollo y progresión del cáncer de colon, pero se sabe poco acerca de su distribución tisular y celular en el continuo de la mucosa normal a través del adenoma premaligno a adenocarcinoma invasivo. El objetivo de este estudio fue examinar el patrón de expresión de la agrupación de miR-17-92 (miR-17, miR-18, miR-19, miR-20 y miR-92), así como el miR-21, miR-31 , miR-135b, y miR-145 a principios clínicamente diagnosticados de cáncer de colon. Los microARN fueron analizados por cromogénico
In situ
hibridación en la secuencia adenoma-adenocarcinoma normal de nueve adenocarcinomas desarrollados en los pólipos de la mucosa del colon. Posteriormente, la expresión de microRNAs seleccionados se validó en 24 pólipos de la mucosa de cáncer de colon. La expresión de miR-17 se limitaba a las células epiteliales, y los niveles de expresión aumenta en la zona de transición de normal a tejido adenomatoso. Los miembros de la agrupación de miR-17-92, miR-19b, miR-20a y miR-92a, siguieron el mismo patrón de expresión, pero el miR-17 fue el más predominante. Un aumento de la expresión de miR-21 se encontró en el estroma asociado al tumor con el incremento más dramático de adenoma a adenocarcinoma, mientras que el número de 145 miR-células positivas similares a fibroblastos en la lámina propia normal (estroma) disminuyó de una manera escalonada a lo largo de la secuencia de adenoma-adenocarcinoma normal. Se llegó a la conclusión de que la expresión de miR-17, miR-21 y miR-145 cambios en las primeras etapas de la secuencia adenoma-adenocarcinoma normal. Por lo tanto, estos microRNAs pueden jugar un papel en el desarrollo del cáncer de colon
Visto:. Knudsen KN, Nielsen BS, Lindebjerg J, Hansen TF, Holst R, Sørensen FB (2015) microARN-17 es la más actualizada miembro -Regulated del Cluster de miR-17-92 durante la temprana evolución del cáncer de colon. PLoS ONE 10 (10): e0140503. doi: 10.1371 /journal.pone.0140503
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos |
Recibido: 11 Junio, 2015; Aceptado: September 24, 2015; Publicado: 14 Octubre 2015
Derechos de Autor © 2015 Knudsen et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. el estudio fue financiado por el Fondo de Región de Sur de Dinamarca doctorado (beca número 12/6786, http://www.regionsyddanmark.dk/wm325002), el Universidad del Sur de Dinamarca (www.sdu.dk), el Consejo de Investigación del hospital Lillebaelt (http://www.sygehuslillebaelt.dk/wm223295), la Fundación rey Christian X (http://kongehuset.dk/Menu/Fonde--legater/Kong-Christian-den-Tiendes-Fond/kong-christian-den-tiendesfond), La Fundación de la Familia Spogaard (http://www.cancer.dk/forskning/stoette-til-forskning/familien-spogaards-fond/), Aase y Fundación Danielsen Ejnar (número de concesión 10-000789, http: //www.danielsensfond .dk /Default.aspx), y miembro del Parlamento J. Christensen y esposa Fundación K. Christensen. Todas las subvenciones mencionadas anteriormente fueron dados a KNK. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. BSN es empleado de una empresa comercial (Bioneer A /S, Dinamarca). El donante prestado apoyo en forma de salario, pero no tuvo ningún papel adicional en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. BSN es empleado por una empresa comercial (Bioneer A /S, Dinamarca). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas en los datos y materiales de uso compartido.
Introducción
El cáncer colorrectal es uno de uno de los cánceres más comunes en todo el mundo [1]. Una fracción considerable de estos cánceres se cree que el desarrollo de una manera escalonada a partir de la mucosa colónica normal a través de un adenoma premaligno al adenocarcinoma invasivo como resultado de cambios genéticos y epigenéticos complejos [2-4]. MicroARNs (miRNAs) son una clase de ARN que media la regulación post-transcripcional que han sido implicados en la carcinogénesis colorrectal y la progresión del tumor, al actuar como oncogenes y supresores de tumor [5-7] no codificante. El miRNAs, que generalmente contienen ~ 22 nucleótidos, se dirigen a más del 60% de todos los genes codificantes de proteínas [8], y cada miARN puede reprimir potencialmente cientos de genes diana [9].
Los microARNs se expresan como transcripciones que contiene un único miARN como miR-21 o un número de miRNAs maduros (polycistrons), al igual que los de miR-143/145 y miR-17-92 racimos. El cúmulo de miR-17-92 contiene seis miRNAs diferentes: miR-17, miR-18a, miR-19a, 19b-MIR, MIR-20a, 92a y miR-, con una secuencia muy similar entre miR-19a y miR-19b y entre el miR-17 y miR-20a [10]. Todos los miembros de clúster se han encontrado elevada en tejido canceroso colorrectal en comparación con el tejido normal, aunque con diferentes expresión de cada componente individual [11-13]. Otros descritos con frecuencia miRNAs hasta reguladas en el cáncer colorrectal son miR-21 y miR-31 [14-16], mientras que el miR-145 es uno de los miRNAs más consistentemente-regulado [15-18]. Por otra parte, el miR-135b se ha informado a participar en la tumorogénesis precoz [19,20].
A pesar de la investigación en curso masivo en miARN en el cáncer colorrectal, sólo unos pocos estudios han investigado los cambios miARN a lo largo de toda la normal- adenoma-adenocarcinoma (NA-AC) secuencia [20-24]. Bartley
y col Hola, ha encontrado un total de 230 miRNAs expresados diferencialmente en el modelo evolutivo NA-AC incluyendo el miR-17, miR-19, miR-92a y miR-21, mientras que otros investigadores han informado [21] miR-31 y miR-135b para estar entre los miRNAs modifican con mayor frecuencia [20,22,25]. También se ha demostrado que miR-21 sobre regulación de adenoma a adenocarcinoma es el resultado de una mayor expresión en los fibroblastos del estroma asociadas con el cáncer en el tumor microambiente [26]. Sin embargo, la información sobre la distribución de células y tejidos de miRNAs en el continuo de la secuencia N-A-AC es todavía escasa. El conocimiento de la localización y la expresión de los genes miARN es de importancia fundamental en la comprensión de su papel exacto en la iniciación, desarrollo y progresión del cáncer de colon.
Los adenocarcinomas en desarrollo en los pólipos de la mucosa (ACP) proporcionar una oportunidad única para estudiar la temprana desarrollo secuencial de adenocarcinoma en el mismo paciente. El uso de la ACP del colon como un modelo de la secuencia de AN-CA, el objetivo de este estudio fue describir los patrones de expresión de los miembros de la agrupación de miR-17-92, así como el miR-21, miR-31, miR-135b , y miR-145 en el desarrollo del cáncer de colon con el foco en su prevalencia, distribución tisular y celular origen.
Materiales y Métodos
el tejido investigado en el presente estudio consistió en dos conjuntos independientes de , las muestras de diagnóstico clínico: un conjunto de prueba de nueve ACP fijado en formol e incluidos en parafina (FFPE) y un conjunto de validación de 24 FFPE ACP desde el colon. Todos los bloques de tejido se obtuvieron a partir del archivo patología de diagnóstico de Departamento de Patología Clínica, Hospital Vejle. Las muestras para el estudio de ensayo fueron diagnosticados inicialmente durante un estudio de viabilidad de cribado del cáncer de colon llevado a cabo desde 2005 hasta 2006 en el condado de Vejle, Dinamarca, mientras que el conjunto de validación se originó a partir de pacientes diagnosticados en el Hospital se refiere Vejle desde 2005 hasta 2009. Sólo los adenocarcinomas convencionales eran se excluyeron los pólipos incluidos y de las mucosas que contienen los adenomas serrados. La confirmación del diagnóstico y la reclasificación de los componentes de los pólipos adenomatosos en se llevaron a cabo por un patólogo experimentado gastrointestinal. Toda la información del paciente se muestra en la Tabla 1.
Al inicio del estudio, cada sección histológica contenía los tres componentes de los ACP,
i
.
e
. mucosa normal, tejido adenomatoso, y adenocarcinoma invasivo. Sin embargo, a medida que más secciones fueron cortadas de los bloques de tejido algunas áreas de interés que faltaban, y por lo tanto dos especímenes del equipo de prueba y hasta seis del conjunto de validación dejado de dar los datos completos de los tres compartimentos de la secuencia de AN-AC.
El estudio fue aprobado por los Comités de Ética Científico regional para Sur de Dinamarca (ID#S-20120075) y concedió una dispensa del consentimiento informado. El estudio se ha registrado en la Agencia Danesa de Protección de Datos, y el danés Registro de Utilización de Tejidos Humanos ha sido consultado antes se utilizaron las muestras de tejido.
En el análisis de hibridación in situ
In situ
hibridación (ISH) de miR-17, miR-21, miR-145, miR-126, miR-31, miR-125 ter, miR-135b, miR-200b, miR-18a, miR19b , miR-20a y miR-92a se realizó esencialmente como se describe anteriormente [27]. Las secuencias de la sonda miARN y detalles experimentales se presentan en la Tabla S1. En resumen, el análisis de ISH se realizó en 6 micras de grosor utilizando un instrumento Tecan Evo (Männedorf, Suiza). optimización de ensayo para determinar óptima concentraciones de sonda y las temperaturas de hibridación se llevó a cabo antes del análisis. Las secciones fueron pre-digeridos con proteinasa K (15 mg /ml) a 37 ° C durante 8 minutos, pre-hibridaron a 57 ° C durante 15 minutos, y se hibridaron con doble carboxifluoresceína (FAM) marcado de ácido nucleico cerrado (LNA) sondas (Exiqon A /S, Dinamarca). Después de lavados rigurosos en tampón citrato de solución salina de sodio, se detectaron las sondas con las ovejas conjugado con fosfatasa anti-FAM fragmentos Fab alcalinas seguido de incubación en sustrato que contiene tetrazolio nitroazul 4-y 5-bromo-4-cloro-3'-indolilfosfato (Roche , Dinamarca) dando como resultado una coloración azul oscuro, y finalmente a contratinción con rojo nuclear rápido (vector Laboratories, CA):
evaluación morfológica de expresión de miRNA y β-catenina
Todas las diapositivas se evaluaron subjetivamente y anotó semi-cuantitativamente de acuerdo con la intensidad de los genes miARN (0 = negativo, 1 = débil, 2 = fuerte) y la proporción de células teñidas (0 = & lt; 50%, 1 = & gt; 50%) a excepción de miR-21. La puntuación total se determina sumando las puntuaciones de intensidad y proporción y dichotomising la suma en "baja" (puntuación 0-1) o "alto" (puntuación 2-3) expresión. Debido a una amplia gama de miR-21 células positivas en las muestras, la proporción de miR-21 células teñidas se clasificó como 0 = & lt; 1%, 1 = 1% -50% y 2 = & gt; 50%, y el se empleó puntuación de intensidad como se ha descrito anteriormente. La puntuación total de miR-21 se divide en tres categorías: 0-1 = baja; 2-3 = moderado; 4 = alta expresión.
Expresión
β-catenina se evaluó para membranosa, citoplasmática y la tinción nuclear. Puesto que la reacción citoplasmática se distribuye homogéneamente en los compartimientos tumorales, se obtuvo solamente la intensidad (débil, moderada y fuerte). Debido a que la tinción citoplasmática oscureció la inmunorreacción membranosa en muchas áreas adenomatosos e invasoras, la tinción membranosa no se anotó en estos compartimentos. tinción nuclear se dividió en dos grupos: negativo = sin reacción nuclear visto y positivo = van desde unos pocos dispersos células positivas, la reacción focal o difuso de reacción
Imagen análisis
La evaluación morfológica documentado. un pronunciado sobre regulación de miR-17 en las células epiteliales, que requerían un análisis más detallado utilizando el siguiente enfoque objetivo: imágenes conjunto de diapositivas digitales se obtuvieron con un objetivo x20 utilizando un escáner de campo claro Axio Scan Z1 (Carl Zeiss, Alemania). El análisis de imágenes digitales de las diapositivas se realizó utilizando el software VisiomorphDP (Visiopharm, Dinamarca). En los 16 casos, las estimaciones cuantitativas de la señal de ISH de miR-17 se obtuvieron en regiones con mucosa normal del colon (N), adenoma de bajo grado (LGA), adenoma de alto grado (HGA), y el adenocarcinoma, cuando dichos componentes del tejido homogéneos eran evidentes . Las regiones fueron identificados por un patólogo experimentado gastrointestinal y rodearon como regiones de interés (ROI) en las diapositivas enteros digitales. Ocho casos se analizaron por duplicado y se combinaron los datos de los dos diapositivas. Las áreas evaluadas promedio (de los ROI) fueron los siguientes: N: 5,2 mm
2 (n = 24); LGA: 6,1 mm
2 (n = 9); HGA: 7.4 mm
2 (n = 21), y el adenocarcinoma: 8,2 mm
2 (n = 24), donde n es el número de regiones de interés representativo. Un clasificador de píxeles fue entrenado para discriminar la señal ISH azul del colorante de contraste de color rojo, el tejido sin teñir y débilmente manchado, y las zonas libres de tejido, y con una intensidad umbral discriminar azul medio de intenso azul. Se obtuvieron los siguientes parámetros durante el procesamiento de imagen de cada ROI: área de azul medio, área de azul intenso, y el área total del individuo ROIs. Las fracciones de área relativos, las áreas de color azul intenso dividida con el área total (unidad arbitraria) + medio, se consideraron representativas de los relativos miR-17 niveles de expresión.
La inmunohistoquímica (IHC)
IHC se llevó a cabo en 4 micras secciones de tejido de los mismos bloques utilizados para el análisis de ISH. EnVision + FLEX, ratón, pH alto, (Enlace) (Dako, Glostrup, Dinamarca código K8002) se utilizó para la recuperación del epítopo y tinción IHC.
En la fosfatasa y homólogo de tensina análisis (PTEN), los portaobjetos se incubaron con anticuerpo PTEN (1: 200, Dako, Dinamarca, código M3627) durante 30 minutos, amplificados con el anticuerpo de ratón enlace durante 20 minutos seguido por la detección con peroxidasa de rábano picante de polímero durante 30 minutos. La tinción de anticuerpos se realizó en un Dako Autostainer Plus (Dako, Dinamarca) con 3,3'-diaminobencidina como cromógeno y hematoxilina Mayers como colorante de contraste. IHC reacción negativa completa se consideró como la pérdida de PTEN.
Estado de la proteína de los genes de reparación había sido realizada de forma rutinaria mediante IHC en aproximadamente la mitad de las muestras durante el procedimiento de diagnóstico primario pato-anatómica. Los casos restantes se tiñeron con anticuerpos contra MLH1 (1: 100, Novocastra, Reino Unido, código NCL-L-MLH1), MSH2 (1: 100, Novocastra, Reino Unido, código NCL-MSH2), MSH6 (BD Transduction Laboratories, EE.UU., código 610919) y PMS2 (1: 500, BD Pharmingen, EE.UU., código 556415). Las células no neoplásicas dentro y alrededor del tumor sirvieron como control positivo interno, y para los controles negativos se omitió el anticuerpo primario
análisis de IHC para actina de músculo liso (1: 1000, Dako, Dinamarca, M0851)., desmina (1: 400, Dako, Dinamarca, M0760) y h-caldesmón (1: 200, Dako, Dinamarca, M3557) se realizaron sobre muestras del equipo de prueba, mientras que el análisis de β-catenina (1: 2000, BD Biosciences, EE.UU. , código 610153) se realizó en el conjunto de validación.
el análisis estadístico
continuos miR-17 los datos obtenidos a partir del análisis de las imágenes fueron log-transformados para producir una distribución normal de los residuales. Para el ajuste de la variabilidad intra-sujeto, un modelo de regresión de efectos mixtos lineal multivariado con efectos aleatorios para la identificación de muestras se utilizó para analizar la correlación entre log-miR-17 y las covariables fijas: tipo de tejido, edad, sexo, y la histología del adenoma. Posteriormente, se utilizaron combinaciones lineales de los estimadores para comparar el miR-17 niveles de expresión entre los grupos. Los valores de p inferior a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis se realizaron en STATA versión 13 (StataCorp, TX, EE.UU.)
Resultados
Los casos de prueba:. Evaluación morfológica
Sobre la base de una revisión de la literatura [5-7,21 , 22,28-30], hemos elegido para examinar la expresión de miR-17, miR-21, miR-31, miR-125 ter, miR-126, miR-135b, miR-145 y miR-200b en la prueba grupo de nueve ACP.
de los ocho miRNAs ensayadas, miR-17, miR-21 y miR-145 mostró expresión diferencial en la secuencia de AN-AC (figura 1A-1F). En siete de los nueve casos, un aumento de la expresión de miR-17 en las células epiteliales se ha visto en la zona de transición de normal a tejido adenomatoso. La expresión se mantuvo en las células epiteliales cancerosas. En todas las muestras, el miR-21 expresión se encuentra predominantemente en las células del estroma de tipo fibroblasto de las regiones displásicas e invasoras de los ACP con la única reacción escasa y focal en las células epiteliales cancerosas. El patrón de expresión pareció aumentar de manera escalonada a lo largo de la secuencia N-A-C. Todos los casos mostraron una fuerte expresión de miR-145 se ve en las células de músculo liso (SMC) y células de músculo liso vascular (CMLV), así como en células estromales similares a fibroblastos. Las últimas células fueron localizados en las proximidades de las criptas epiteliales y se aparecieron a disminuir en el tejido adenomatoso y canceroso en seis de los siete casos disponibles. IHC en las mismas muestras reveló una reacción positiva para el músculo y α-actina y desmina lisa, mientras que H-caldesmón fue negativo, lo que sugiere que estas células miR-145-positivos son de origen myofibroblastic
(A & amp;. B ) miR-17 en normal (N) y adenomatosa (a) de tejidos y en adenocarcinoma (AC); (C & amp; D) miR-21 expresión en el estroma de la adenoma comparación con el tejido normal y en las células del estroma asociadas con el cáncer (*). Un pequeño grupo de células epiteliales tumorales positivas también está presente (flecha blanca); (E) miR-145 se ve en las células de músculo liso (flecha) y células musculares lisas vasculares (punta de flecha); en el aumento (F) un número reducido de células similares a fibroblastos positivos miR-145 se encuentran en el adenoma (flecha) en comparación con el tejido normal (punta de flecha); de la señal (G) débil miR-125 ter se observó en la mucosa muscular (mm); (H) miR-200b se observó en las células epiteliales en la base de las criptas, pero en este caso también en las células de cáncer epitelial; (I) miR-126 se ve exclusivamente en las células endoteliales; (J) La sonda scramble mostró tinción de fondo solamente discreta.
Una señal positiva para el miR-125 ter, miR-126 y miR-200b estaba presente en las muestras, sin embargo, ninguna expresión diferencial para cualquier de estos tres miRs se observó cuando la comparación de los tres compartimentos (Fig 1G-1i). Una señal de miR-125 ter débil se observó en los fibroblastos en la mucosa normal y SMC en cinco de nueve casos. Todas las muestras mostraron células epiteliales positivas miR-200b, especialmente en la base de las criptas colónicas normales, así como una señal positiva en el epitelio adenomatosa y cancerosas. la expresión de miR-126 se limitaba a las células endoteliales y estuvo presente en los tres compartimentos.
No se detectó expresión de miR-31 y miR-135b en las muestras de ensayo nueve
Estudio de validación. : evaluación morfológica de expresión de miR-17, miR-21 y miR-145
a partir de los resultados obtenidos de la prueba de conjunto, los análisis de miR-17, miR-21 y miR-145 se volvieron a tratar en el conjunto de validación de 24 ACP. La señal de miR-17 se encuentra exclusivamente en las células epiteliales. Bajo la expresión se observó en las células epiteliales normales en la base de las criptas, mientras que se observó una alta expresión en la zona de transición de normal a tejido adenomatoso en 96% (23/24) de los casos (Tabla 2). La expresión se mantuvo en el adenocarcinoma en 96% (22/23) de los casos, mientras que la señal se redujo en un caso (4%). Sólo un espécimen mostraron un aumento de la expresión de adenoma a adenocarcinoma. Estos dos casos no presentaron diferencias clínicamente de los otros casos del conjunto de validación.
En correspondencia con los resultados en la prueba, el miR-21 expresión se encuentra predominantemente en las células del estroma que rodean la displásicas y cancerosos glándulas. Uno de los casos, sin embargo, mostró la expresión de miR-21 en las células epiteliales cancerosas, y en otras tres muestras también se observó expresión focal en las células tumorales epiteliales. No se documentaron diferencias histopatológicas o clínicas entre estos cuatro casos en comparación con los otros 20 casos. moderada expresión de miR-21 apareció en la zona de transición de normal a adenoma en las células del estroma en el 71% (17/24) de los casos. Los casos restantes mostraron un aumento de expresión de adenoma a adenocarcinoma (Tabla 2). En el 41% (9/22) de los casos, la sobre regulación se intensificó a lo largo de la secuencia de AN-CA con una expresión de miR-21 moderado en el adenoma y alta expresión en los focos invasivos
.
El análisis de miR-145 mostró células estromales similares a fibroblastos pericryptal positivos en la lámina propia normal, además de la SMC de las arterias y las capas musculares de la pared del colon. En la mitad de los casos, el número de pericryptal miR-145 positivas, células similares a fibroblastos disminuyó en la zona de transición de normal a tejido adenomatoso. Esta disminución fue aún más evidente cuando se comparan normal a tejido canceroso con una reducción observada en 86% (19/22) de los casos (Tabla 2). La señal positiva en el SMC y CMLV se mantuvo sin cambios a lo largo de los tres compartimentos.
Análisis de miR-135b se repitió en todas las 24 muestras de validación, pero no se encontró ninguna señal de ISH. El caso de la deficiencia de desajuste proteína de reparación no mostró un perfil de expresión de los genes miARN diferente de los casos con dominio, ni tampoco los tres casos con metástasis.
La expresión de β-catenina en la secuencia de AN-AC Hotel
distinto predominante tinción citoplasmática membranosa y débil para la β-catenina estaba presente en todos los 24 casos (100%) del epitelio no neoplásico, mientras que no se observó acumulación nuclear (S2 y Tabla a en la figura S1). En los componentes adenomatosos, expresión citoplásmica se incrementó en 95% (20/21) de los casos (S2 tabla). 62% (13/21) de los adenomas también muestra tinción nuclear positiva, mientras que esto se observó en 95% (20/21) de los adenocarcinomas, más a menudo en la parte delantera invasiva y /o en el tumor en ciernes células (B + C en Fig S1). Aumento de la reacción citoplasmática se observó en todos los adenocarcinomas 21 (100%) (S2 Tabla).
Análisis
Imagen de miR-17
Un subgrupo de 16 muestras elegidas al azar del conjunto de validación, se examinó mediante análisis de imagen para obtener cuantitativos de miR-17 estimaciones de expresión en las zonas con tejido normal, LGA, HGA y el adenocarcinoma. Las estimaciones de la expresión de miR-17 se obtuvieron como fracciones de área (
i
.
e
. Zona manchada dividida con la superficie total) y los análisis estadísticos se realizaron en los datos transformados logarítmicamente. Los resultados de la regresión lineal mixto multivariado se muestran en la Tabla 3. Log-miR-17 aumentó de tejido normal a tejido adenomatoso bajo y alto grado, y también a cáncer invasivo (p = 0,03, p & lt; 0,001 y p & lt; 0,001, respectivamente; intra- clase coeficiente de correlación = 0,19). Fig 2 muestra un incremento total del 10% (de la unidad arbitraria) a lo largo de la secuencia de NA-AC, y que la regulación se produjo de una manera escalonada comenzando con un aumento de 2,4% de normal a LGA (p = 0,03) y una incremento adicional del 6,9% a partir de bajo grado de HGA (p & lt; 0,001). No hay diferencia en el diario de miR-17 se observó expresión en la progresión de HGA al adenocarcinoma (p = 0,84). El tipo histológico del adenoma tubular, velloso o túbulo-velloso, no se asoció a log-miR-17 expresión, sin embargo, se observó una asociación con la edad de los pacientes varones (p & lt; 0,001). (Tabla 3)
el aumento de expresión de miR-17 en adenomas de bajo grado (LGA), adenoma de alto grado (HGA) y adenocarcinoma (AC) del colon en comparación con tejido normal
expresión de miR-17-92 miembros del clúster
miR-17 es uno de los seis miRNAs maduros codificados desde el clúster policistrónico miR-17-92. Por lo tanto, se seleccionaron seis casos del conjunto de validación con la expresión más fuerte subjetivamente miR-17 para su posterior análisis de ISH en relación con los miembros del clúster de miR-18a, 19b-MIR, MIR-20a, 92a y miR-. La sonda de miR-19b se consideró común para las dos isoformas de miR-19, miR-19a se diferencia de miR-19b haciendo solamente 100% la discriminación poco probable que ocurra en el ensayo de ISH un solo nucleótido. La secuencia de la sonda de miR-17 se diferencia de miR-20a por tres posiciones de nucleótidos (S1 Tabla). Las señales de miR-19b, miR-20a y miR-92a eran, al igual que el miR-17, confinado a las células epiteliales, pero la expresión fue más débil que la observada para el miR-17 (Figura 3A y 3C-3E). Se observó una regulación en la zona de transición de normal a tejido adenomatoso, y la expresión regulada hasta fue sostenido en el adenocarcinoma. Una señal de miR-18a muy débil en las células epiteliales se observó en cuatro de los seis casos en la zona de transición de normal a tejido precanceroso (figura 3B), mientras que la señal ISH más intenso se encuentra en un puñado pequeño, redondeado células de linfocitos similar en el estroma de la lámina propia
Expresión
(a) de miR-17.; (B) de miR-18a; (C) miR-19b; (D) de miR-20a; (E) de miR-92a y (F) Sonda de lucha en normal (N) y el tejido adenomatoso (A). Tenga en cuenta el aumento de la intensidad de la tinción en las criptas adenomatosos en comparación con la cripta normal.
expresión de PTEN no está relacionado con el miR-17 o miR-21 expresión
Todos los casos de ambos conjuntos de estudio se tiñeron de PTEN, un objetivo validado tanto para el miR-17 y miR-21 [31,32]. En el conjunto de validación, el 21% (5/24) de los ACP mostró una completa pérdida de PTEN, pero sólo de manera focal dentro en el epitelio de la adenomatosa y /o áreas invasivas. Sin embargo, no se observó una asociación inversa de PTEN y miR-17 expresión de miR-21 y la expresión. No hay pérdida de PTEN fue visto los casos de prueba nueve.
Discusión
En este estudio, hemos utilizado muestras clínicas, diagnóstico de lesiones de colon que contienen la secuencia de AN-CA para explorar la expresión de una serie de miRNAs conocidos a partir de [5-7,28] que se expresa durante el desarrollo de cáncer de colon la literatura; miR-17, miR-21, miR-31, miR-125 ter, miR-126, miR-135b, miR-145 y miR-200b. El empleo de ISH cromogénico, se encontró que la expresión de miR-17, miR-21 y miR-145 fue particularmente dinámico en las fases tempranas del desarrollo del cáncer de colon. Análisis de la imagen de los miR-17 lesiones manchadas indicó que este miARN se induce en la transición a principios de N a LGA y aún más drásticamente a HGA. Se encontró que la expresión de miR-17 que es de origen epitelial como fue también el caso de los otros miRNAs en el clúster de miR-17-92. miR-17 se encontró que era el más prevalente miARN de la agrupación de miR-17-92.
Nuestro estudio es el primero en mostrar que el miR-17
la expresión in situ
aumenta al comienzo de la normalidad mucosa a LGA y alcanza una meseta de expresión en el HGA que no está exagerado en adenocarcinoma manifiesto. Este hallazgo es consistente con los hallazgos de Bartley
et al
, que informaron de un miR-17 patrón de expresión similar usando QRT-PCR [21]. Otros estudios han encontrado que los niveles de miR-17 siguieron aumentando de adenoma a adenocarcinoma [11,33,34], pero a diferencia de nuestro estudio y los resultados obtenidos por Bartley
et al
, estos estudios no compararon tejido obtenido de los mismos individuos, y por lo tanto puede estar asociada con una mayor variación entre individuos.
sobre la base de comparación simple, morfológica de intensidad de la tinción de señales ISH, encontramos el miR-17 como la más hasta reguladas en el miembro de clúster tanto adenomatosa y el tejido canceroso, seguido de miR-92a, miR-20a, 19b-MIR, y miR-18a. Humphreys
et al
, utilizando la técnica de QRT-PCR, también encontró el miR-17 para ser el más alto de miR expresado en el cuadro de miR-17-92 en Dukes A y C cánceres colorrectales [13], mientras que QRT-PCR los resultados de otros estudios encontraron miR-92a para ser el miARN expresión más profundamente en adenomatosa y /o tejido canceroso colorrectal [11,12,33]. Todos estos tres estudios, sin embargo, corroboran nuestra conclusión de que el miR-18a es el miembro de clúster menos expresado, y que el miR-19a /b y la expresión de miR-20a son consistentemente más altos que el miR-18a [11-13,33]. No se puede excluir que la afinidad de unión (temperaturas de fusión) de las sondas empleadas LNA puede haber contribuido a las diferentes intensidades de tinción observados.
Nos encontramos la expresión de todos los miembros del clúster de miR-17-92 para ser estudiados confinada a las células epiteliales. Hallazgos similares de miR-17 y la expresión de miR-92a han sido reportados por otros investigadores [31,33-35], aunque un grupo también observó algunos de miR-17 células estromales positivos [35]. Curiosamente, se observó una señal de miR-18a intensa en algunas pequeñas, redondeadas células estromales de linfocitos-como en la lámina propia en cuatro de los seis especímenes. Sin embargo, ya se expresó ningún otro miembro de clúster, la señal es más probable que represente a hibridación cruzada con otra diana de ARN.
El papel de miR-17 en las células epiteliales del colon en el desarrollo del cáncer todavía no está claro. Una función posible podría ser la inhibición del factor de transcripción E2F 1,
E2F1
, un gen supresor de tumor putativo. El aumento de expresión de E2F1 se ha relacionado con disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis en el cáncer colorrectal [36,37]. Curiosamente, una relación inversa entre E2F1 y miR-17 se ha demostrado en el tejido de cáncer de colon [35,38]. Monzo
et al
demostró que la transfección de anti-miR-17 dio lugar a una mayor expresión de E2F1 y la disminución de la proliferación celular [35], y Kanaan
et al
demostró que la transfección de miR-17 en HT-29 células de adenocarcinoma colorrectal conducen a la disminución de la expresión de E2F1 [39]. En un estudio sobre la diferenciación de linaje neuronal de las células madre somáticas no restringidas, una interacción directa entre miR-17 y E2F1 se ha documentado [40]. Por lo tanto, el aumento de expresión de miR-17 en las células epiteliales de colon podrían contribuir a la tumorogénesis mediante la promoción de la proliferación celular. Estudios adicionales son de hecho necesarios para evaluar la relación entre el miR-17 y E2F1 en el cáncer colorrectal y requieren un examen cuidadoso de sus respectivos expresión en suficientes regiones morfológicamente característicos presentes en dichas muestras únicas. Los cuadernos de estudio empleadas en este estudio no permiten el análisis adicional ya que las regiones representativas ya no está disponible estaban en una fracción sustancial del material.
El putativo onco-MIR, MIR-21, se encuentran principalmente en las células del estroma que rodean a las células epiteliales displásicas, adenomatosos y cancerosas. La intensidad de la expresión de miR-21 aumentó durante la secuencia N-A-AC con la más alta expresión se ve en la estroma asociada a cáncer. Nuestros resultados confirman los hallazgos de Yamamichi
et al
[26]. A excepción de un caso de miR-21 epitelio tumoral positiva sólo, un predominantemente estroma de miR-21 expresión se muestra en las 23 + 9 muestras restantes. Teniendo en cuenta el pequeño tamaño de la muestra utilizada en el estudio de Yamamichi
et al
, así como este que nos ocupa, no se puede excluir totalmente que a principios de miR-21 expresión podría ser un fenómeno epitelial. Sin embargo, los grandes estudios sobre el miR-21 en los cánceres colorrectales más avanzados demuestran claramente el miR-21 que se localiza en el compartimiento del estroma [27,41,42].
Hemos observado que el número de miR-145 positiva, células similares a fibroblastos pericryptal se redujo gradualmente en la secuencia de AN-AC. Disminución de los niveles de miR-145 en el cáncer colorrectal en comparación con el colon normal, según lo medido por qPCR, se han encontrado en numerosos estudios, y miR-145 ha sido considerado como un posible supresor de tumores. Sin embargo, recientemente esta teoría fue desafiado [43]. Uso de ISH, Chivukula
et al
encontró que miR-145 se expresa sólo en las células mesenquimales y células no epiteliales de colon de ratón, mientras que miR-145 era casi indetectable por qRT-PCR en ratón purificado y el epitelio intestinal humano [ ,,,0],44]. Los autores concluyeron que el miR-145 funciona como era poco probable un supresor de tumores epiteliales, y que los resultados anteriores de la pérdida de miR-145 fue más probablemente relacionado con las diferencias en la composición celular de los tejidos normales y cancerosas [43,44].