Extracto
Recientemente miR-182 se ha informado de que sobre-expresan en el cáncer de próstata (PC) los tejidos, sin embargo se detalla el análisis funcional de miR-182-5p no se ha llevado a cabo. El propósito de este estudio fue: 1. Analizar la función de miR-182-5p en el cáncer de próstata, 2. evaluar su utilidad como marcador tumoral, 3. Identificar los genes diana de miR-182-5p en PC, 4. Investigar la potencial para el inhibidor de miR-182-5p para ser utilizado en el tratamiento PC. Inicialmente, se encontró que la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en tejidos de cáncer de próstata y líneas celulares en comparación con los tejidos y células normales de la próstata. Por otra parte alta expresión de miR-182-5p se asoció con una menor supervivencia global en pacientes con CP. Para estudiar el significado funcional de miR-182-5p, derribaron miR-182-5p con inhibidor de miR-182-5p. Abierto 182-5p MIR se redujeron knock-down, la proliferación de células de cáncer de próstata, la migración y la invasión. Se identificaron
foxf2
,
RECK
y
MTSS1
como posibles genes diana de miR-182-5p utilizando varios algoritmos que fue confirmado por el ensayo de luciferasa 3'UTR y análisis de Western . Knock-down de miR-182-5p también disminuyó significativamente
in vivo
de próstata el crecimiento del tumor. En conclusión, este es el primer informe que documenta que la sobre expresión de miR-182-5p se asocia con la progresión del cáncer de próstata y potencialmente útil como un biomarcador de pronóstico. También tumbar de miR-182-5p con el fin de aumentar la expresión de los genes supresores de tumores
foxf2
,
RECK
y
MTSS1
pueda ser de beneficio terapéutico en el tratamiento del cáncer de próstata .
Visto: Hirata H, K Ueno, Shahryari V, G Deng, Tanaka Y, Tabatabai ZL, et al. (2013) microARN-182-5p promueve la invasión celular y la proliferación mediante la regulación negativa de
foxf2
,
RECK y MTSS1
Los genes en el cáncer de próstata humano. PLoS ONE 8 (1): e55502. doi: 10.1371 /journal.pone.0055502
Editor: Soumitro Pal, el Hospital de Niños de Boston & amp; Escuela de Medicina de Harvard, Estados Unidos de América
Recibido: 9 Octubre, 2012; Aceptado: December 23, 2012; Publicado: 30 Enero, 2013
Este es un artículo de acceso abierto, libre de todos los derechos de autor, y puede ser reproducido libremente, distribuir, transmitir, modificar, construir, o de otra forma utilizado por cualquier persona para cualquier propósito legal. El trabajo está disponible bajo la advocación de dominio público Creative Commons CC0
Financiación:. Este estudio fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la Investigación de los Institutos Nacionales de Salud a través de la Subvención Número RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Mérito de la opinión subvenciones, proyecto de programa de VA y la Fundación de Ciencias Yamada. Los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (PC) es una de las enfermedades más comunes en los hombres estadounidenses [1]. La etiología de la PC es en gran parte desconocida, aunque varios factores de riesgo tales como la etnia, los antecedentes familiares y la edad están asociados con la enfermedad [2]. Además, varios componentes de la dieta se han vinculado con el riesgo de PC y la prevención [3], [4]. Como la detección del antígeno prostático específico (PSA) se ha extendido, el número de pacientes curables ha tendido a aumentar. Sin embargo, se identificó un número significativo de pacientes con metástasis en los ganglios linfáticos durante la prostatectomía radical, lo que hace más difícil el tratamiento [5].
Recientemente, un número de miRNAs se han identificado y notificado a ser importante en varios tipos de cáncer [6] . Los microARN (miRNA) son pequeños ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos de longitud que son capaces de regular la expresión génica, tanto a nivel de transcripción y traducción [7]. MiRNAs se unen a la región no traducida 3 '(UTR) del ARNm diana y reprime la traducción del ARNm a la proteína o inducen la escisión del ARNm, regulando de este modo la expresión de genes diana tales como supresor de tumores o oncogenes [8], [9]. Recientemente miR-182 se ha informado de que se sobre-expresado en el cáncer de próstata [10]. Sin embargo el análisis funcional de miR-182-5p no se ha llevado a cabo en el cáncer de próstata. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que el miR-182-5p puede funcionar como un oncogén y ser un nuevo biomarcador molecular en el cáncer de próstata. Para probar esta hipótesis, que inicialmente se encontró que la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en tejidos de cáncer de próstata en comparación con los tejidos normales de la próstata. Además, la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3, DU145), en comparación con las células epiteliales de próstata normales (RWPE-1). Para los estudios de análisis funcional, miR-182-5p fue derribado el uso de un inhibidor de miR-182-5p. También utilizamos varios algoritmos para buscar posibles genes supresores de tumores como la orientación de miR-182-5p. ensayo de luciferasa 3'UTR y análisis Western se realizaron para confirmar la interacción directa entre el miR-182-5p y estos genes diana. Finalmente establecimos estable bajo miR-182-5p líneas celulares que expresan y se realizó un
in vivo
estudios con el fin de observar los posibles efectos de supresión tumoral en un modelo de xenoinjerto de ratón desnudo.
Resultados
miRNA-182 expresión es significativamente mayor en los tejidos de cáncer de próstata y se correlaciona con la supervivencia global
miR-182-5p niveles de expresión en muestras clínicas (52 muestras) fueron confirmados por PCR en tiempo real. expresión miR-182-5p se muestra como la relación de tumor (T) /y normal (N) expresión (relación T /N) en cada muestra emparejada (Figura 1). Así, si la relación T /N es más de 1,0, la expresión de miR-182-5p se juzgó a ser mayor en los tejidos de cáncer de próstata en comparación con los que en el tejido normal adyacente emparejado. Como se muestra en la figura 1-A, en 5 pacientes (9,7%), la relación T /N fue de menos de 1,0, mientras que en los otros 47 pacientes (90,3%), la relación T /N fue de más de 1,0. Por lo tanto la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en tejidos de cáncer de próstata en comparación con los tejidos normales de la próstata emparejados. Dividimos a los pacientes con cáncer de próstata 52 en dos categorías en función de la media T /N (2.27) de la siguiente manera: 1) alta miR-182-5p grupo que expresa (relación T miR-182-5p /N superior a 2,27), 2 ) bajo expresando-182-5p MIR grupo (relación T miR-182-5p /N menor que 2.27). A continuación, investigaron la asociación de miR-182-5p y varios parámetros clínicos como se muestra en la figura 1-B. gráficos de Kaplan-Meier mostró que la supervivencia global fue significativamente menor en el alto de miR-182-5p expresar grupo (valor p = 0,0117, prueba de log-rank) (Figura 1-C).
A. la expresión de miR-182-5p relativo [cada tejido tumoral (T) /tejido prostático normal (N)] basado en la PCR en tiempo real los resultados, B. asociación entre la expresión y clínico-patológica parámetros de miR-182-5p (edad al momento del diagnóstico, pT , Gleason, el fracaso de PSA y la supervivencia global) en los tejidos de cáncer de próstata en base a los resultados q-PCR. C. de Kaplan-Meier parcelas de supervivencia sobre-todo después de la prostatectomía radical.
miARN-182-5p expresión es significativamente mayor en líneas celulares de cáncer de próstata
La expresión
miR-182-5p fue significativamente mayor en líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP, PC-3 y DU145) en comparación con la línea celular normal de la próstata (RWPE-1) (Figura 2).
a. La expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en líneas celulares de cáncer de próstata en comparación con los tres una línea de células normales de la próstata, B. Relativo la expresión de miR-182-5p (precursor (RWPE-1) miR-NC o miR-182-5p 1 células transfectadas RWPE), B. ensayo de viabilidad celular (MIR-MIR-NC o 182-5p precursor de células transfectadas RWPE-1), C. cicatrización de la herida de ensayo (MIR-MIR-NC o 182-5p RWPE-1 transfectadas precursor Células). Las barras de error representan ± S.D.. (Desviación estándar).
Efecto de microARN-182-5p sobre-expresión de la viabilidad celular y la migración en una línea de células de próstata normales
Para confirmar la función de miR-182- 5p, transfectadas precursor de miR-182-5p en una línea de células normales de la próstata (RWPE-1). A las 48 horas después de la transfección de miR-NC o precursor de miR-182-5p en células RWPE-1, el nivel de expresión de miR-182-5p se verificó mediante PCR en tiempo real (doble cambio; 526, figura 2-B.). Luego de viabilidad celular (ensayo MTS) y la cicatrización de heridas ensayos se realizaron con células RWPE-1 transfectadas transitoriamente con el precursor de miARN-182-5p. Se observó el aumento significativamente la proliferación celular (Fig. 2-C) y la migración (Fig. 2-D) en las células transfectadas miARN-182-5p comparación con las células transfectadas miR-NC.
Efecto de microARN-182- 5p tumbar sobre la viabilidad celular, la invasión y la migración en las líneas celulares PC
Se utilizó dos líneas celulares de cáncer de próstata (PC-3 y DU 145) con la expresión de miR-182-5p alta para experimentos adicionales desde el miR-182 expresión -5p fue significativamente mayor en estas líneas celulares. A las 48 horas después de la transfección de inhibidor-NC o miR-182-5p inhibidor en las células PC-3 y DU 145, el miR-182-5p knock-down fue verificado por el tiempo real de RT-PCR (0,003, 0,034, respectivamente) (figura . 3-A). La viabilidad celular (ensayo de MTS), ensayos de migración y la invasión se llevaron a cabo (Fig. 3-B, 3-C, 3-D) y se observó una disminución significativa en la proliferación celular (Fig. 3-B), la invasión (Fig. 3 -C) y la migración (Fig. 3-D) en células PC-3 y DU-145 desmontables miRNA-182-5p en comparación con los inhibidores de la NC células transfectadas.
dos líneas celulares de cáncer de próstata (PC-3 y DU145) se transfectaron transitoriamente, ya sea con inhibidor de miR-182-5p o control de miR-negativo (miR-NC-inhibidor). A. expresión de miR-182-5p relativa (inhibidor de miR-NC o células PC transfectadas inhibidor de miR-182-5p), B. ensayo de viabilidad celular (inhibidor de miR-NC o células PC miR-182-5p inhibidores de la transfectadas), C. ensayo de invasión, D. cicatrización de heridas de ensayo (24 horas). Las barras de error representan ± S.D.. (Desviación estándar).
miR-182-5p directamente regula foxf2, RECK y MTSS1
Hemos identificado tres genes supresores de tumores (
foxf2
,
RECK, MTSS1
) como posibles genes diana de miR-182-5p en base a tres algoritmos (miRDB, TargetScan, microRNA.org).
foxf2 ARNm tiene dos posibles sitios de unión de miR-182-5p dentro de su 3 'UTR (Fig. 4-A). La actividad de luciferasa relativa se muestra como una proporción de la actividad luciferasa de luciérnaga y renilla para cada muestra. Entre los dos sitios, la actividad de luciferasa relativa se redujo significativamente en la posición 670 en las células precursoras transfectadas miR-182-5p (Fig. 4-b). RECK ARNm tiene un sitio potencial de unión (posición 812) para MIR-182-5p dentro de su extremo 3 'UTR (Fig. 4-A). La actividad de luciferasa relativa se redujo significativamente cuando se utilizó el constructo posición 812 en las células precursoras de miR-182-5p transfectadas (Fig. 4-b). MTSS1 mRNA tiene cuatro sitios de unión potenciales para miR-182-5p dentro de su 3'UTR y la actividad de luciferasa relativa se redujo significativamente en la posición 1909 en las células precursoras transfectadas miR-182-5p (Fig. 4-b). Con los plásmidos mutados (que se muestran como "M"), no hubo diferencia significativa en la actividad de luciferasa entre los controles y miR-182-5p precursor transfectantes (Fig. 4-B). Dado que la expresión proteína del gen diana es baja en PC-3 y DU145, se realizó un análisis de Western para observar cualquier cambio en la expresión de proteínas con inhibidor de miR-182-5p. Como se muestra en la Figura 4-C, la expresión de proteínas de los genes diana se incrementó significativamente después de la transfección inhibidor de miR-182-5p (Fig. 4-C). Este resultado sugiere que los ARNm foxf2, RECK y MTSS1 son blancos directos de miR-182-5p.
A. Foxf2, RECK y MTSS1 3'UTR posición y secuencia de miR-182-5p complementaria. B. 3'UTR de ensayo de luciferasa (miR-NC y precursor de miR-182-5p), barras de error representan ± S.D.. (Desviación estándar). C. Expresión de proteínas de foxf2, RECK, MTSS1, MMP-2 y beta-tubulina de inhibidor de miR-NC o inhibidores de la transfectadas las células del cáncer de próstata miR-182-5p (PC-3, DU145).
también confirmó expresión de la proteína MMP-2 activa ya que es un efector aguas abajo de RECK. Como se muestra en la Figura 4-C, se escindió MMP-2 (tipo activo) expresión de la proteína disminuyó significativamente en-182-5p miR células transfectadas inhibidor.
efecto inhibidor de miR-182-5p sobre el crecimiento tumoral en un en vivo modelo de ratón desnudo
con el fin de observar el miR-182-5p inhibidor efectos sobre el crecimiento tumoral en ratones desnudos, se utilizó un sistema basado lentiviral y establecimos estable bajo miR-182-5p expresan PC-3 células y los controles (Fig. 5-A). Utilizamos 8 ratones (4 ratones; estable bajo miR-182-5p, 4 ratones de control); y observamos que estable bajo miR-182-5p líneas celulares que expresan había reducido significativamente el volumen del tumor en ratones desnudos en comparación con los controles (Fig 5-. SEGUNDO). Dado que no hemos podido detectar tumores en uno de los grupos de expresión de miR-182-5p bajas, no fue incluido en el experimento. Que mide los niveles de microARN en xenoinjertos de tumores (miR-182-5p-inhibidor y el inhibidor-NC), y encontró que la expresión de miR-182-5p fue significativamente menor en el miR-182 xenoinjertos de inhibidor en comparación con la de inhibidor-NC xenoinjertos (fig. 5-B). imágenes aspecto macroscópico típicos de los tumores se muestran en la Fig. 5-C. Como se muestra en la Figura 5-D, la expresión de proteínas de los tres genes diana (foxf2, RECK, MTSS1) fue significativamente mayor en el establo bajo el miR-182-5p expresando tejidos tumorales de xenoinjertos.
A. registro de tiempo del tamaño del tumor en el miR-NC y xenoinjertos de inhibidor de miR-182-5p. B. expresión de miR-182-5p relativa a la inyección de las células y la cosecha de xenoinjertos. Las barras de error representan ± S.D.. (Desviación estándar). MIR-182-5p expresión fue significativamente menor en el grupo inhibidor de miR-182-5p. C. aspecto macroscópico típico de los tumores de ratones desnudos en grupos de inhibidor de control y miR-182-5p. D. Expresión de la proteína foxf2 RECK y MTSS1 en xenoinjertos tumorales.
Efecto de la sobre-expresión de RECK y MTSS1 en las células de cáncer de próstata (PC-3 y DU 145)
función
Para examinar la función de RECK y MTSS1, overexpressed RECK y MTSS1 en células de cáncer de próstata que fueron confirmadas mediante la medición de mRNA (Fig. 6-a) y los niveles de expresión de proteínas (Fig. 6-B). A continuación, se realizó varios análisis funcionales. Como se muestra en la Figura 6, la viabilidad celular (Fig. 6-C), la invasión (Fig. 6-D) y la migración (Fig. 6-E) se inhibió significativamente en RECK y MTSS1 transfectaron células de cáncer de próstata.
A las 24 horas después de la transfección de cualquiera pCMV6 vacío, pCMV6-RECK o pCMV6-MTSS1 en células de cáncer de próstata (PC-3 y DU 145), RECK y MTSS1 los niveles de expresión fueron verificados por el tiempo real de RT-PCR (A) y Western (B) análisis de ensayo C. La viabilidad celular, ensayo de invasión D., E. heridas ensayo de curación, barras de error representan ± SD (Desviación estándar).
Efecto de foxf2 siRNA desmontables sobre la proliferación celular, la invasión y la migración de las células del cáncer de próstata
Después de foxf2 siRNA tumbar (Fig. 7-A), hay hubo diferencias en la proliferación de células entre si-NC y si-foxf2 células PC transfectadas (Fig. 7-B). Sin embargo la invasión celular y la cicatrización de heridas se incrementaron significativamente en si-foxf2 transfectaron células PC (Fig. 7-C, Fig. 7-D).
A. foxf2 expresión de proteínas (si-NC o células PC transfectadas si-foxf2). Ensayo B. La viabilidad celular (si-NC o células PC transfectadas si-foxf2). C. ensayo de invasión, D. cicatrización de heridas de ensayo (8 horas), barras de error representan ± S.D.. (Desviación estándar).
Discusión
Varios microRNAs se han identificado como oncogénica en el cáncer de próstata en base a su mayor expresión en tejidos de cáncer de próstata o líneas celulares de cáncer de próstata [10], [ ,,,0],11] - [14]. Análisis funcional se han realizado con algunos de estos microRNAs oncogénicos. Por ejemplo, el miR-21 se ha informado a promover la invasión y la resistencia a la apoptosis en células de cáncer de próstata [15], [16] y miR-125 ter promovido el crecimiento de tumores de xenoinjertos de cáncer de próstata mediante la orientación pro-apoptóticos genes [14]. MiR-373 y miR-520c también se han reportado para promover la invasión tumoral y la metástasis en el cáncer de próstata [12].
En un informe se ha demostrado que el miR-182 es un supresor de tumores en una línea celular de cáncer de pulmón [17 ], mientras que miR-182-5p se ha informado de que un oncogén en varios tipos de cáncer [18] - [23]. Segura et al informaron de que la expresión de miR-182-5p aberrante promueve la metástasis de melanoma [18]. Liu et al encontró que la sobreexpresión de miR-182-5p aumentó la transformación tumoral y la invasión tumoral
in vitro Opiniones y mejorado la metástasis
in vivo
en las células de cáncer de ovario [21]. Por lo tanto sólo dos informes han demostrado que el miR-182-5p es un oncogén basado en el análisis funcional en el melanoma y el cáncer de ovario [18], [21].
Al igual que en nuestros resultados, otros dos estudios encontraron miR-182 -5p expresión sea significativamente mayor en los tejidos de cáncer de próstata en comparación con los tejidos normales de la próstata [10], [22], sin embargo, no se han realizado análisis funcional. En nuestro estudio, se observó que la expresión de miR-182-5p fue significativamente mayor en los tejidos de cáncer de próstata y líneas celulares de cáncer de próstata en comparación con los tejidos normales de la próstata y líneas celulares. Curiosamente, se encontró que una alta expresión de miR-182-5p se correlacionó con la supervivencia general más corta después de la prostatectomía radical en pacientes con cáncer de próstata. Por lo tanto nuestro siguiente objetivo fue determinar si las funciones de miR-182-5p como un oncogén en el cáncer de próstata. Para abordar esta cuestión, que inicialmente transfectadas miR-182-5p en una línea de células normales de la próstata (RWPE-1) y observamos que el miR-182 aumentó la proliferación celular y la herida capacidad de curación. También se realizó
in vitro
análisis funcionales utilizando un inhibidor de miR-182-5p en células de cáncer de próstata. Dado que la expresión de miR-182-5p fue superior en todas las líneas celulares de cáncer de próstata tres (LNCaP, PC-3, DU145) en comparación con las células epiteliales normales de la próstata, que utiliza las dos líneas celulares que expresan el miR-182-5p más altos (PC-3 y DU145) para knockdown funcional analiza. Como era de esperar, desmontables miR-182-5p disminución de la proliferación celular, la migración y la invasión en estas líneas celulares. Ya que ha sido previamente informado de que la sobreexpresión de miR-182-5p promueve la metástasis de melanoma y fue oncogénico en la naturaleza, nuestros resultados también indican que el miR-182-5p puede ser un oncogén en líneas celulares de cáncer de próstata.
Nuestra siguiente objetivo fue identificar los genes diana de miR-182-5p desde microRNAs ejercen sus efectos mediante la regulación de la expresión de otros genes diana. Utilizamos varios algoritmos (miRDB, microRNA.org, TargetScan) e identificado tres genes diana potenciales (foxf2, RECK, MTSS1). Como se muestra con ensayo de luciferasa 3'UTR y analiza occidental, los tres genes diana potenciales (foxf2, RECK, MTSS1) expresión estaba regulada por el miR-182-5p.
De los tres genes diana (RECK, MTSS1, foxf2), se informó RECK sobreexpresión para disminuir la invasión de células por MMP inhiben incluyendo MMP-2 [24]. expresión RECK se ha informado que ser regulada en varios tipos de cáncer incluyendo el cáncer de próstata [24]. En nuestro estudio, se observó que el inhibidor de miR-182 disminución de la expresión activa-MMP-2 en líneas celulares de cáncer de próstata, así como la regulación de la proteína RECK. Adicionalmente se investigó la función RECK en más de expresar en líneas celulares de cáncer de próstata (PC-3 y DU 145). Como se muestra, RECK inhibe la migración celular y la invasión en las células de cáncer de próstata. Rabien et al demostraron que la sobreexpresión RECK disminuyó el potencial invasivo de las células DU 145 [25] y sus resultados son similares a los nuestros. Sin embargo se observó que RECK inhibió la proliferación celular en dos líneas celulares de cáncer de próstata (PC-3 y DU 145), mientras que Rabien et al no encontró ningún efecto de RECK sobre la proliferación celular en DU 145 células. Sin embargo RECK ha informado para disminuir la proliferación celular en otros tipos de cáncer [26], [27]. Por lo tanto se requieren experimentos adicionales para aclarar estas diferencias. En lo que va de miR-21 y miR-222 se han encontrado para orientar RECK en el cáncer de próstata y cáncer gástrico [28], [29] pero no ha habido informes sobre el miR-182-5p y RECK. Sin embargo, nuestros resultados muestran que el miR-182-5p regula directamente la expresión RECK en líneas celulares de cáncer de próstata.
MTSS1 (supresor de la metástasis tumoral-1) fue inicialmente identificado como un gen supresor tumoral en el cáncer de vejiga [30]. Recientemente se examinó la función de MTSS1 en líneas celulares de cáncer de próstata y se encontró que suprimir significativamente la migración celular y la proliferación [31]. Además de miR-182 se ha informado a regular a la baja MTSS1 y promover la metástasis del carcinoma hepatocelular [32], España
foxf2 se ha reportado un resultado muy similar a la nuestra. Para regular hacia abajo MMP-1 y un máximo de regular TIMP3, un conocido inhibidor de MMPs [33]. Además foxf2 disminuye Wnt5a [34], que actúa a través de la no canónica vías de señalización de Wnt para promover la angiogénesis y la supervivencia celular. Wnt5a expresión en tejidos de cáncer de próstata se ha correlacionado con altas puntuaciones de Gleason y la recaída bioquímica del cáncer de próstata [35]. actividad invasión desmontables y sobreexpresión de Wnt5a en líneas celulares de cáncer de próstata humana reducida y estimulado, respectivamente, [35]. Además Wnt5a indujo la expresión de la metaloproteinasa-1 (MMP-1) en el cáncer de próstata [34], [35]. En nuestro estudio, foxf2 tumbar aumento de la invasión y migración celular en líneas celulares de cáncer de próstata. Así, nuestros resultados sugieren que onco-miR-182-5p puede estar implicada en la regulación de estos genes supresores de invasión y metástasis. Recientemente miR-301 se definió como un oncogén y se informó para mediar la proliferación a través de la regulación de foxf2 en el cáncer de mama [36]. A excepción de miR-301, ningún estudio ha demostrado la regulación directa de foxf2 por un miARN.
También investigó el posible uso de un inhibidor de miR-182-5p como un tratamiento potencial PC. Para lograr esto, se utilizó un
in vivo
modelo de xenoinjerto de ratón desnudo con baja estable miR-182-5p que expresan las células de cáncer de próstata para este estudio. El volumen del tumor en ratones desnudos se redujo significativamente en bajo miR-182-5p células que expresan en comparación con las células control. Además, los niveles de foxf2, RECK y MTSS1 fueron significativamente mayores en los tejidos de xenoinjerto de baja miR-182-5p que expresan las células de cáncer de próstata. Estos resultados indican que desmontables de miR-182-5p aumento de la expresión de estos genes diana supresor de tumores
in vitro
y
in vivo
. Como nos centramos en tres genes diana (
RECK
,
MTSS1
y
foxf2
) y sólo investigaron 52 muestras clínicas, serán necesarios estudios adicionales para dilucidar el papel de MIR -182-5p en cáncer de próstata y su uso en aplicaciones clínicas.
en conclusión, este es el primer informe que documenta que la sobre expresión de miR-182-5p se asocia con la progresión del cáncer de próstata y potencialmente útil como pronóstico biomarcador. Además derribando de miR-182-5p con inhibidor puede ser de beneficio terapéutico para potenciar la expresión de los genes supresores de tumores foxf2, RECK y MTSS1 en células de cáncer de próstata.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
fijados con formalina, las muestras de cáncer (FFPE) de próstata incluidas en parafina se obtienen a partir de los Asuntos de Veteranos de San Francisco (VA) Medical Center. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la UCSF (Número de autorización: H9058-35751-01).
Animales
Todo el cuidado de los animales estaba de acuerdo con las directrices del Centro Médico de Veteranos de San Francisco y el estudio fue aprobado por el San Francisco VA IACUC (número de protocolo: 08-003-01). usuarios en animales han completado programas de capacitación para manejar y trabajar con los ratones a través de AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) antes de los experimentos con animales. Un total de 8 ratones desnudos (cepa BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) se utilizaron y inicialmente las células de cáncer de próstata se inyecta por vía subcutánea y el tamaño del tumor se monitorizó como se ha mencionado en la página 7. Después del crecimiento del tumor , los ratones fueron sacrificados con una sobredosis de isoflurano mediante inhalación. A continuación se retiró el tejido de xenoinjerto.
Las muestras clínicas
Un total de 52 pacientes con cáncer de próstata confirmado patológicamente se inscribieron en este estudio (Veterans Affairs Medical Center en San Francisco). Las muestras se obtuvieron de los pacientes después de consentimiento informado por escrito. Toda la información del paciente se muestra en la Tabla 1.
Cultivo de células
células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1; ATCC número CRL-11609-) y líneas celulares de cáncer de próstata (LNCaP; ATCC número CRL-1740, PC-3; ATCC número CRL-1435, DU145; ATCC número HTB-81) se adquirieron de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las líneas celulares de cáncer de próstata se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal inactivado por calor 10%. células RWPE-1 se cultivaron en queratinocitos-SFM (GIBCO /Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.). Cuando se compra, se prepararon colección permanente de las células y se almacenaron todas las células a -80 grados hasta su uso. Las células se utilizaron para los experimentos dentro de los 6 meses.
Total RNA y proteínas de extracción
ARN (microARN y el ARN total) fue extraído a partir fijado en formol (FFPE) cáncer de próstata humano embebido en parafina ( n = 52) y emparejados no cancerosas tejidos adyacentes normales de próstata (n = 43) o la hiperplasia benigna de próstata (BPH) (n = 9) utilizando un kit miRNeasy FFPE (Qiagen) después de la captura con láser micro-disección basa en una revisión patólogo. ARN (microARN y el ARN total) también se extrajo de líneas de células humanas utilizando un kit miRNeasy mini (QIAGEN) y se extrajo a partir de tejidos de xenoinjerto se homogeneizaron en 1 ml de reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) a continuación, se purificó con columnas RNeasy (Qiagen). Para digerir el ADN, se utilizó un kit Qiagen DNasa libre de RNasa. Las células se lisaron con tampón RIPA (Pierce, Brebieres, Francia) que contiene inhibidores de la proteasa (Sigma, St. Louis, MO). La proteína se extrajo a partir de tejidos de xenoinjerto utilizando la proteína del tejido reactivo de extracción (T-PER) (Thermo Scientific, Rockford, IL). La cuantificación de proteínas se realizó utilizando un kit de ensayo de proteína BCA (Pierce, Brebieres, Francia).
microARN y el inhibidor de microARN transfección
Anti-MIR ™ miARN inhibidor [control negativo (inhibidor de miR-NC) o un inhibidor de miR-182-5p (inhibidor de miR-182-5p), Ambion] se transfectaron transitoriamente en células de cáncer con SIPORT agente de transfección NeoFX (Ambion) según las instrucciones del fabricante. Pre-miR ™ miARN precursores [control negativo (miR-NC) o HSA-mir-182-5p (miR-182-5p), Ambion] se transfectaron en células con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
la viabilidad celular, la invasión celular y la cicatrización de heridas ensayo
la viabilidad celular se midió 3 días después de la transfección (inhibidor de miR-NC /miR-182-5p inhibidor transfectante) con MTS (CellTiter 96 acuoso Móvil One Solution Ensayo de proliferación, Promega). Los datos son la media ± S. D. de 3 experimentos independientes. ensayos de la invasión de células se realizaron con el 24 pocillos kit de ensayo de invasión de células CytoSelect (Cell BioLab, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas (inhibidor de miR-NC /miR-182-5p inhibidor transfectante-48 horas) se resuspendieron en medio de cultivo sin FBS y se coloca en la cámara superior por triplicado. Después de 48 horas de incubación a 37 ° C (5% de CO2), se tiñeron células que migran a través de la membrana. Los resultados se expresaron como células invadidas cuantificados a una DO de 560 nm. ensayo de cicatrización de la herida se realizó con el CytoSelect 24 pocillos cicatrización de la herida kit de ensayo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para generar un campo de la herida, las células transfectadas (inhibidor de miR-NC o miR-182-5p inhibidor transfectante-48 horas de la transfección) se cultivaron hasta que formaron una monocapa alrededor del inserto. Después de retirar la pieza de inserción, un campo herida abierta 0,9 mm se generó y se dejó que las células a migrar desde ambos lados de la brecha. Cierre de la herida se controló y se midió el cierre por ciento. [Porcentaje tasa de cierre (%) = área de superficie de las células migraron /x100 total de superficie)].
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR
Cuantitativa en tiempo real RT-PCR se realizó por triplicado con un Applied Biosystems Prism 7500 secuencia sistema de detección rápida utilizando TaqMan PCR Universal master mix de acuerdo con el protocolo del fabricante (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EE.UU.). Las sondas TaqMan y los cebadores se compraron de Applied Biosystems. RNU48 se utilizó como control endógeno. Los niveles de expresión de ARN se determinaron utilizando el sistema 7500 Fast SDS software versión 1.3.1 (Applied Biosystems).
Se utilizó el análisis Western
proteína celular total (15 a 20 g) para el Western Blot . Las muestras fueron resueltas en 4-20% geles de proteínas precisas (Pierce, Brebières, Francia) y se transfirieron a membranas de PVDF (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Las membranas se sumergieron en 0,3% de leche desnatada en TBS que contiene 0,1% de Tween 20 durante 1 hora y se sondaron con anticuerpo policlonal primario y anticuerpo monoclonal contra foxf2 (# ab23306, Abcam, Cambridge, MA), RECK (# 3433, Cell Signaling Technology), MTSS1 (# 4385, Cell Signaling Technology), la MMP-2 (# 4022, Cell Signaling Technology) y beta-tubulina (# 2128, Cell tecnología de señalización) durante la noche a 4 ° C. Las transferencias se lavaron en TBS que contiene 0,1% de Tween 20 y se marcaron con peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con (Tecnología de Señalización Celular, Beverly, MA) anti-ratón o anticuerpo secundario anti-conejo. Las proteínas fueron reforzadas por quimioluminiscencia (Amersham ECL plus Western Blot sistema de detección, Fairfield, CT) para la visualización. Los niveles de expresión de proteínas se expresaron en relación a los niveles de beta-tubulina.
Plásmido construcción y ensayo de 3'UTR-Luciferase
Hemos construido plásmidos individuales para cada sitio de unión en el 3'UTR de ARNm a partir de los posibles genes diana, según la información microRNA.org. Luego confirmamos miR-182-5p unión a la 3'UTR del ARNm del gen diana mediante el ensayo de luciferasa con el precursor de miR-182-5p. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión se utilizó para realizar análisis de luciferasa 3'UTR (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Las secuencias de los cebadores usados para las inserciones de plásmido se muestran en la Tabla 2. En un volumen total de 20 l, 5 l de cada uno de cebador directo 100 M y cebador inverso, 2 l de 10x tampón de hibridación (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM de EDTA) y agua 8 l se añadieron a un tubo de PCR 200 l y se incubaron a 95 ° C durante 5 minutos y luego colocados a temperatura ambiente durante 1 hr. Los oligonucleótidos se ligaron en el
I- Pme
Xba I
sitio de pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target vector de expresión. Directa de la colonia PCR se realizó para el reconocimiento de inserción utilizando RedTaq (Sigma, St. Louis, MO, EE.UU.). Los cebadores utilizados para la PCR fueron las siguientes: cebador directo, 5'-cgtgctggaacacggtaaaa-3 '; cebador inverso, 5 'gcagccaactcagcttcctt-3'. parámetros de PCR para los ciclos eran las siguientes: 94 ° C durante 3 minutos, 30 ciclos de PCR a 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos y 72 ° C durante 30 segundos, 72 ° C durante 10 minutos y 4 ° C durante 10 minutos. El producto de PCR fue digerido con NotI (Takara /Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Los tamaños de los vectores que contienen insertos eran aproximadamente 200 pb y 100 pb por electroforesis ya que la secuencia de reconocimiento de NotI se incorporó a los cebadores.
Para la transfección precursor de miR-182-5p, las células de cáncer de próstata fueron co transfectadas con el miR-NC y pmirGLO o miR-182-5p y pmirGLO Dual-Luciferase miARN objetivo Vectores de expresión utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen).