Extracto
microARN (miARN o MIR) inhibición de las vías oncogénicas relacionados ha demostrado ser un enfoque terapéutico prometedor para el cáncer. Aberrante el metabolismo de los lípidos y el colesterol está implicado en el desarrollo del cáncer de próstata y la progresión a la etapa terminal de la enfermedad. Recientemente hemos demostrado que un factor de transcripción clave para la lipogénesis, esterol regulador elemento de unión a la proteína-1 (SREBP-1), inducida por ácidos grasos y la acumulación de lípidos y del receptor de andrógenos (AR) la actividad transcripcional, y también promovió el crecimiento celular del cáncer de próstata y la resistencia a la castración . SREBP-1 se sobreexpresa en cáncer de próstata humano y las muestras de pacientes resistentes a la castración. Estos resultados experimentales y clínicos indican que SREBP-1 es un factor de transcripción potencial oncogénico en el cáncer de próstata. En este estudio, hemos identificado dos miRNAs, miR-185 y 342, que controlan la lipogénesis y colesterogénesis en células de cáncer de próstata mediante la inhibición de la expresión de SREBP-1 y 2 y la regulación negativa de sus genes diana, incluyendo la sintasa de ácidos grasos (FASN) y 3- hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGCR). Ambos modelos 342 tumorigenicidad inhibido, el crecimiento celular, la migración y la invasión en cultivos de células de cáncer de próstata y de xenoinjertos de miR-185 y coincidente con el bloqueo de la lipogénesis y colesterogénesis. Intrínseca de miR-185 y 342 expresión se redujo significativamente en células de cáncer de próstata en comparación con las células epiteliales no cancerosas. Restauración de miR-185 y 342 llevó a la muerte por apoptosis dependiente de caspasas en células de cáncer de próstata. El miRNAs recientemente identificados, miR-185 y 342, representan un nuevo mecanismo para la terapia del cáncer de próstata focalización
Visto:. Li X, Chen Y-T, Josson S, Mukhopadhyay NK, Kim J, Freeman MR, et al. (2013) microARN-185 y 342 de inhibición de tumorigenicidad e inducir la apoptosis a través del bloqueo de la SREBP metabólico ruta en células del cáncer de próstata. PLoS ONE 8 (8): e70987. doi: 10.1371 /journal.pone.0070987
Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 18 de febrero, 2013; Aceptado: 25 Junio 2013; Publicado: 9 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo el apoyo de una subvención del Departamento de Defensa (W81XWH-08-1- 0321) y las Cedars-Sinai Premios Garber para la Ciencia cáncer (HBB). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microARN (miARN o MIR) es un corto (media de 22 nt), solo varado y presentes de forma endógena ARN no codificante que regula la expresión de genes post-transcripcional por apareamiento de bases complementarias a las 3 'no traducidas (UTR) de objetivo mRNAs [1], [2]. Mirna controla la expresión de un estimado de un tercio de los genes codificantes de proteínas humanas implicadas en los procesos celulares fundamentales, incluyendo el metabolismo, diferenciación, crecimiento y la apoptosis [2] - [5]. MIRNA También se ha demostrado que desempeñan papeles clave en la enfermedad, en particular el cáncer [6] - [8]. Ciertas especies miARN, como miR-20a, 23b, 34a, 126, 145, 146a, 221 y 222, se expresan de forma aberrante en el cáncer de próstata [9], [10]. Un número de miRNAs se han demostrado para contribuir a la iniciación del tumor, el crecimiento y la progresión letal [11] - [15]. Estos descubrimientos proporcionan un fundamento para considerar la eficacia de las terapias de reemplazo basados en miARN, con el objetivo de inhibir oncogenes y sus rutas relativas, o la restauración de los genes supresores de tumores.
esterol regulador elemento vinculante proteína (SREBP) es una hélice-bucle-hélice factor básico de cremallera de leucina de transcripción con importantes funciones metabólicas en la lipogénesis y colesterogénesis [16], [17]. Tres principales isoformas SREBP han sido identificados, SREBP-1a, SREBP-1c y SREBP-2 [18]. SREBP-1 controla los genes implicados en ácidos grasos, lípidos y colesterol biosíntesis [16], [17], mientras que SREBP-2 regula más específicamente el metabolismo del colesterol y la homeostasis [19]. La desregulación de SREBPs y sus genes diana aguas abajo asociados con la lipogénesis y colesterogénesis se ha implicado en el cáncer. Los ejemplos incluyen ácido graso sintasa (FASN), un oncogén metabólica [20], [21], y 3-hidroxi-3-metilglutaril CoA reductasa (HMGCR), la tasa de limitación de paso en la biosíntesis de colesterol; se ha informado de ambas proteínas estar involucrado en el desarrollo y progresión del cáncer de próstata [20], [22] - [24]. La sobreexpresión de SREBP-1 se observó en muestras de cáncer de próstata humano en comparación con tejidos de la próstata benignas /normales [22], y esto podría ser mecánica relacionada con la progresión a la enfermedad de andrógenos refractario /resistente a la castración [22], [25]. Orientación de la vía SREBP-lipogénesis-colesterogénesis aberrante puede conducir a nuevos enfoques para el tratamiento del cáncer de próstata
.
El papel de los miRNAs en SREBP-lipogénesis-colesterogénesis en el cáncer de próstata sigue siendo poco clara. En el presente estudio, hemos identificado y caracterizado dos miRNAs cruciales, miR-185 y 342, como reguladores de SREBP-lipogénesis-colesterogénesis en células de cáncer de próstata. Tanto miR-185 y 342 inhibieron la expresión de SREBP-1 y SREBP-2 y sus genes aguas abajo, FASN y HMGCR y, además, se redujeron los niveles de ácidos grasos y el colesterol en las células de cáncer de próstata. Además, ambos miRNAs reducción de expresión de receptor de andrógenos (AR), un conocido factor de crecimiento y la supervivencia. Por otra parte, miR-185 y 342 suprime la tumorigenicidad y el crecimiento celular y la apoptosis inducida por la activación de una caspasa /vía apoptótica PARP mediada en células de cáncer de próstata y los ratones portadores de tumores de próstata humanos de xenoinjerto. Los niveles más bajos de miR-185 y 342 se encuentran en las células de cáncer de próstata en comparación con las células normales /no cancerosas epiteliales de próstata. Tomados en conjunto, hemos demostrado por primera vez que el miR-185 y 342 desempeñan un papel supresor de tumores mediante el bloqueo de un mecanismo central lipogénesis-colesterogénesis.
Materiales y Métodos
líneas celulares de cáncer de próstata, Cultivo celular y reactivos
líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP (dependiente de andrógenos) y C4-2B, un LNCaP linaje derivado independiente de andrógenos sublínea [26], se cultivaron en medio T-(Life Technologies, Grand Island, NY) suplementado con 5% de suero bovino fetal (FBS), 100 UI /ml de penicilina y 100 mg /ml de estreptomicina. Una línea no canceroso humano de próstata epitelial celular, RWPE-1 (ATCC, Manassas, VA), se mantuvo en medio de queratinocitos que contiene extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico recombinante humano (Life Technologies). Todas las células se mantuvieron en 5% de CO
2 a 37 ° C. precursores miARN humanos, inhibidores de miRNA, ensayo TaqMan miARN, kit de aislamiento de mirVana ™ miARN y Lipofectamine 2000 se adquirieron de Life Technologies. Las construcciones de reportero de ADN 3 'UTR de luciferasa de SREBP-1 (HmiT017704-MT05) y SREBP-2 (HmiT017705-MT05) fueron adquiridos de GeneCopoeia (Rockville, MD). Una solución CellTiter 96® acuosa Ensayo de proliferación celular (ensayo de MTS mitocondrial) y la caspasa-GLO® 3/7 sistemas de ensayo se obtuvieron de Promega (Madison, WI).
Mirna Transfección
La transfección transitoria de los genes miARN precursores o inhibidores se llevó a cabo utilizando Lipofectamine 2000 de acuerdo con el protocolo del fabricante. Humana de miR-185 (PM12486) y 342 precursores (PM13066), anti-miR-185 (AM12486) y 342 (AM13066), y el control negativo (miR-NC; AM17110) se utilizaron para los ensayos de
cuantitativa. en tiempo real de reacción en cadena de transcripción inversa de la polimerasa (QRT-PCR)
se preparó ARN total a partir de células utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) y se sometió a transcripción inversa por Superscript® III transcriptasa inversa ( Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los cebadores utilizados para el análisis de PCR se listan en la Tabla S1. Un arranque en caliente a 95 ° C durante 5 minutos fue seguido por 40 ciclos a una desnaturalización a 95 ° C durante 15 s, hibridación de los cebadores a 60 ° C durante 30 s y elongación a 72 ° C durante 30 s utilizando ABI 7500 Fast real -Tiempo PCR System (Life Technologies). Los datos se normalizaron a 18S rRNA o GAPDH y representados como la media de tres veces duplicados independientes. Para determinar intrínseca de miR-185 y 342 expresión, miARN se preparó a partir de células utilizando el kit de aislamiento de mirVana ™ miARN (Life Technologies). miARN maduro se cuantificó por el miARN ensayo TaqMan (Life Technologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los datos se normalizaron por RNU6B.
Análisis Western Blot
Se prepararon lisados celulares a partir de miR-185, 342, NC (control de miR-negativo) transfectadas o células de cáncer de próstata no transfectadas utilizando un tampón de lisis [Tris 50 mM (pH 8), NaCl 150 mM, 0,02% NaN
3, 0,1% de SDS, 1% NP-40 y 0,5% de desoxicolato de sodio] que contiene 1 mM de fluoruro de fenilmetilsulfonilo y proteasa cóctel inhibidor (Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN). La concentración de proteína se determinó mediante el ensayo de Bradford utilizando el reactivo Coomassie Plus Protein (Thermo Scientific, Rockford, IL). Western blot se realizó utilizando el sistema Novex (Life Technologies) como se describe anteriormente [27], [28]. Los anticuerpos primarios anti-SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR y β2-microglobulina (β2M) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), y anticuerpos secundarios que se conjuga con peroxidasa de rábano picante (GE Healthcare, Piscataway, se han usado NJ). La detección de bandas de proteínas se realizó mediante un aumento de quimioluminiscencia Western Blot Detección Reactivos (GE Healthcare).
Proliferación Celular, clonogenicidad, migración y la invasión ensayos
LNCaP o células C4-2B (6.000 células /pocillo ) se sembraron en placas de 96 pocillos y se transfectaron con miR-185, 342 o NC. La proliferación celular se midió 3 d después de la transfección mediante un ensayo MTS (Promega) según las instrucciones del fabricante. Para el ensayo de clonogenicidad, LNCaP o células transfectadas con C4-2B miR-185, 342 o NC se sembraron en placas de 6 pocillos (500 células /pocillo). Las células se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO
2 por 14 días. Las colonias se fijaron con formalina y se tiñeron con cristal violeta [27]. El número de colonias desarrolladas se contaron y se analizaron para diferencias significativas.
In vitro
se determinó la migración de células o invasión en cámaras de Boyden pre-recubiertos con colágeno I (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; para la migración de ensayo) o matriz Matrigel factor de crecimiento agotado (BD Bioscience, San Jose, CA; para ensayo de invasión). Las células (1,5 × 10
5 células /pocillo) transfectadas con miR-185, 342 o NC fueron sembradas en el interior de las cámaras superiores de pre-revestido. Después de incubación a 37 ° C con 5% de CO
2 durante 48 h, el número de células migradas o invasores se midieron por un método de tinción con cristal violeta [27].
de ácidos grasos y colesterol Cuantificación
las cantidades de ácidos grasos de cadena larga y colesteroles se determinaron utilizando el Kit de ácidos grasos libres y colesterol Cuantificación /colesterilo kit de detección de Ester (Abcam, Cambridge, MA) en células transfectadas con el miR-185, 342 o NC. Las cantidades de ácidos grasos y colesteroles se normalizaron por el número de células totales. El ácido graso o colesterol relativa (%) se asignó como el 100% en las células NC.
Apoptosis ensayos
Para la tinción con anexina V, se hizo un análisis de clasificación de células de cáncer de próstata activadas por fluorescencia 72 h después de la transfección de miRNAs utilizando el Anexina V-FITC Kit de Detección de apoptosis I (BD Bioscience) y un citómetro de flujo FACScan con el software CellQuest (Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ). Para el ensayo de la actividad de caspasa, se midieron las células transfectadas con miRNAs durante 24 h para la caspasa 3/7 actividades enzimáticas por caspasa-Glo Sistemas de 3/7 de ensayo (Promega). Los datos se normalizaron por las proteínas totales. Para el análisis de transferencia Western de la caspasa-, se prepararon lisados de células enteras de células transfectadas con miRNAs durante 72 h y se sometieron a transferencia de Western. Se utilizaron anti-caspasa 9, 3 y PARP anticuerpos primarios (Cell Signaling Technology, Beverly, MA).
Ética Declaración
Todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y uso de Animales de laboratorio de los Institutos nacionales de Salud. El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional del Cedars-Sinai Medical Center (protocolo de IACUC#004252) y fue seguido por los estudios del ratón.
in vivo
Experimentos con Animales
Para examinar la eficacia antitumoral de miR-185 y 342
in vivo
, de seis semanas de edad por vía subcutánea ratones desnudos atímicos (Harlan Laboratories, Placentia, CA) se inocularon macho con 2 × 10 células
6 C4-2B por ratón. La carga tumoral se controló por el volumen del tumor (usando la fórmula V = 4 /3π × (d /2)
2 × D /2, donde D es el eje tumorales menores y D es el eje mayor del tumor). Después de seis semanas de la inoculación, 100 pmoles de miARN complejo con 3 l de Lipofetamine 2000 en 50 l de PBS fue entregado por vía intratumoral cada 3 d para un tratamiento de 21 días. La dosis y el horario de la inyección miARN fueron modificados por un informe anterior [29]. A la terminación del estudio en animales, los tejidos tumorales se recogieron de los ratones sacrificados y se fijaron en formalina al 10%, se deshidrataron en etanol, se incluyeron en parafina y se seccionaron para diapositivas. Las diapositivas de tejido blanco se sometieron a tinción inmunohistoquímica (IHC) [30] utilizando anti-SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR, PSA, Ki67 y anticuerpos primarios escindidos de PARP. Para la cuantificación de Ki67 (proliferación celular) y la expresión de PARP escindida (apoptosis), se contaron 100 células tumorales en 5 zonas seleccionadas al azar y positivamente se registraron células de la tinción. Además, se recogieron tejidos tumorales frescos parciales para determinar la expresión de miR-185 o 342 de QRT-PCR. miARN se preparó a partir de tejidos tumorales utilizando el kit de aislamiento de mirVana ™ miARN.
Análisis estadístico se realizó
El análisis estadístico se describió anteriormente [31]. Estudiante de
t-test
y distribución de dos colas se aplicaron para el análisis de significación estadística.
Resultados
miR-185 y 342 inhibir la expresión de SREBPs y sus genes abajo en las células del cáncer de próstata
para investigar si los miRNAs regulan la ruta de SREBP-lipogénesis-colesterogénesis metabólica en las células del cáncer de próstata, que utilizó por primera TargetScanHuman 6.2 software en línea (http://www.targetscan.org/) para predecir si uno o más miRNAs se dirigen tanto SREBP-1 y SREBP-2, dos principales factores de transcripción que regulan los ácidos grasos, lípidos y la biosíntesis del colesterol y la homeostasis. Dos miRNAs, miR-185 y 342, fueron recuperados que potencialmente co-dirigidos 3 'UTRs de SREBP-1 y SREBP-2 ARNm (Fig. S1A). A fin de verificar si el miR-185 y 342 se unen directamente con los 3 'UTRs de SREBP-1 y SREBP-2, se realizó 3' UTR ensayo indicador de luciferasa y se encontró que los relativos 3 'UTR de actividades de luciferasa tanto SREBP-1 y SREBP 2 se redujo significativamente en el miR-185 y 342 transfectadas las células de cáncer de próstata (Fig. S1B). Los resultados confirman que los ARNm SREBP-1 y SREBP-2 son blancos directos de miR-185 y 342. Para validar si estos dos miRNAs controlan la vía SREBP-lipogénesis-colesterogénesis en células de cáncer de próstata, se realizó qRT-PCR, Western blot, y ácido graso y cuantificación de colesterol análisis. Tanto miR-185 y 342 inhibieron la expresión de ARNm (Fig. 1A), así como precursor (125 kDa) y maduro (68 kDa), las proteínas (Fig. 1B) de SREBP-1 y SREBP-2 en LNCaP y C4-2B las células del cáncer de próstata. La expresión de FASN [32] y HMGCR [33], [34], que son SREBP genes aguas abajo regulados, se redujo en miR-185 y 342 (Fig. 1A y 1B). MiR-185 y 342 también redujeron AR ARNm y la expresión de proteínas en células de cáncer de próstata (Fig. 1A y 1B). Debido a FASN y HMGCR son enzimas importantes para
de novo
síntesis de ácidos grasos y el colesterol de forma individual, que posteriormente examinamos los niveles de ácido graso y colesterol en las células. Como se muestra en la Tabla 1, las cantidades de ácidos grasos y colesterol intracelular se redujo significativamente en miR-185 y 342 transfectadas con LNCaP y células C4-2B en comparación con los grupos control. A fin de probar la especificidad de miR-185 y 342 de SREBP-lipogénesis-colesterogénesis, se utilizaron los oligonucleótidos antisentido contra el miR-185 y miR-342 como 185 y 342 inhibidores. Al bloquear endógeno de miR-185 y 342 en las células de cáncer de próstata, tanto el miR-185 y 342 se incrementaron inhibidores de SREBP-1, SREBP-2 y su expresión génica aguas abajo (Fig. 1C). Estos resultados sugieren que miR-185 y 342 SREBP inhibe la señalización a través de la reducción de SREBP mRNA y de la proteína y la disminución de los niveles de ácido graso y colesterol en las células de cáncer de próstata.
A, Tanto miR-185 y 342 la expresión de ARNm inhibe de SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR y AR en LNCaP y células de cáncer de próstata C4-2B determinados por QRT-PCR. -: No transfectadas; NC: control de miR-negativo. La expresión de mRNA relativo (veces) fue asignado como 1.0 en las células no transfectadas. Los datos se normalizaron a 18S rRNA y representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes por duplicado. **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de NC. B, miR-185 y 342 precursor inhibido (125 kDa) y maduros (68 kDa) formas de SREBP-1 y SREBP-2, FASN, HMGCR y AR expresión en las células LNCaP y C4-2B ensayadas por Western blot. β2-microglobulina (β2M) se utilizó como control de carga. C, miR-185 y 342 (inhibidores de oligonucleótidos antisentido contra el miR-185 y 342) se incrementaron SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR y AR expresión en las células LNCaP y C4-2B determinados por QRT-PCR. La expresión de mRNA relativo (veces) fue asignado como 1.0 en las células no transfectadas. Los datos se normalizaron a 18S rRNA y representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes por duplicado. **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de NC. D, la expresión de miR-185 intrínseca y 342 en las células C4-2B RWPE-1, LNCaP y. QRT-PCR resultados mostraron que la expresión relativa de miR-185 y 342 se redujo significativamente en células de cáncer de próstata en comparación con RWPE-1 /no cancerosa normal. Bajo la expresión de ambos miRNAs se observó en C4-2B agresiva en comparación con las células LNCaP. La expresión de los genes miARN relativa (fold) fue asignado como 1,0 en células RWPE-1. **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de RWPE-1. Los datos se normalizaron a RNU6B control y representan la media ± desviación estándar de tres experimentos independientes realizados por cuadruplicado.
A continuación, se determinó la expresión de miR-185 intrínseca y 342 en diversas líneas celulares con relevancia clínica, incluyendo una línea celular de humano normal /no cancerosas epiteliales de la próstata, RWPE-1, y LNCaP (dependiente de andrógenos) y C4-2B células de cáncer de próstata independientes de andrógenos (). MIRNA se preparó a partir de estas células. expresión relativa de ambos miR-185 y 342 se redujo significativamente en células de cáncer en comparación con los no canceroso RWPE-1 (Fig. 1D) como se ensayó mediante qRT-PCR. Además, baje el miR-185 y 342 se observó expresión en la línea C4-2B más agresivo en comparación con LNCaP. Además, se analizó la expresión de SREBPs, FASN y HMGCR intrínseca que se correlaciona con el miR-185 y 342 en estas líneas celulares. Expresión relativa de SREBP-1, SREBP-2, FASN y HMGCR fue mayor en LNCaP y C4-2B que en RWPE-1 en las células (Fig. S2). Estos datos indican que el miR-185 y 342 son reguladores negativos de la señalización de SREBP en células de cáncer de próstata.
miR-185 y 342 de proliferación celular reprimir, clonogenicidad, migración e invasión en células de cáncer de próstata
para evaluar el potencial de consecuencias biológicas producidas por el miR-185 y 342, que re-expresados de miR-185 y 342 en las células LNCaP y C4-2B y llevamos a cabo una serie de ensayos funcionales pertinentes para tumorigenicidad y la progresión del cáncer. Cuando las células LNCaP y C4-2B fueron transfectadas con miR-185 y 342, la proliferación de ambos tipos de células fue inhibida en comparación con miR-NC y las células no transfectadas (Fig. 2A). Tanto miR-185 y 342 también disminuyeron clonogenicidad en comparación con los grupos de control (Fig. 2B). Una de las características de las células metastásicas progresistas y es su capacidad para invadir los tejidos circundantes y migrar de manera eficiente [35]. MiR-185 y 342, inhibió
in vitro
la migración (Fig. 2C) y la invasión (Fig. 2D) en las células LNCaP y C4-2B. Por el contrario, mediante el bloqueo de miR-185 y 342 en las células de cáncer de próstata, el miR-185 y 342 inhibidores aumentaron la proliferación celular, la formación de colonias, la migración y la invasión (Fig. S3). Estos datos sugieren que tanto el miR-185 y 342 vías a suprimir la tumorigenicidad y relevantes para la progresión del cáncer
A, miR-185 y 342 inhibe la proliferación celular en las células LNCaP y C4-2B en comparación con no transfectadas. (-) y el control de miR-negativo (CN) células transfectadas 3 d después de miARN transfección. La proliferación celular relativa (%) fue asignado como el 100% en no transfectadas (-) de las células. **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de NC. Los datos representan la media ± DE de dos experimentos independientes por cuadruplicado. B, miR-185 y 342 de formación de colonias suprimida en las células LNCaP y C4-2B en comparación con los grupos de control después de 14 d miARN transfección. *,
P Hotel & lt; 0,05 y **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de NC. Los datos representan la media ± DE de dos experimentos independientes por triplicado. C, la migración celular y D, la invasión se redujo significativamente por miR-185 y 342 en las células LNCaP y C4-2B en comparación con los grupos control. **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de NC. Los datos representan la media ± DE de dos experimentos independientes por cuadruplicado.
miR-185 y 342 Inducen dependiente de caspasas apoptótica de la muerte en las células del cáncer de próstata
Para determinar si el miR-185 y 342 inducir la apoptosis en células de cáncer de próstata, se llevó a cabo de Anexina V-FITC /yoduro de propidio (PI) tinción de medición, ensayo de actividad de caspasa y Western blot de la caspasa y PARP expresión. Los resultados de Anexina V-FITC /PI tinción y análisis de citometría de flujo reveló que el miR-185 y 342 se incrementaron las fracciones de células apoptóticas (ambas fracciones de células apoptóticas tempranas y tardías,
P Hotel & lt; 0,005) en LNCaP y C4 células 2b en comparación con los grupos de control (Fig. 3A). Caspasa 3/7 actividades también fueron significativamente inducida por el miR-185 y 342 en las células LNCaP y C4-2B (Fig. 3B). Además, los resultados de Western blot mostraron que la procaspasa 9 y 3 se redujeron por el miR-185 y 342 (Fig. 3C). se detectaron también, exfoliados caspasa-3 y PARP, un factor de aguas abajo de las caspasas, en miR-185 y 342 células transfectadas (Fig. 3C). Estos resultados sugieren que miR-185 y 342 inducen la muerte celular de cáncer de próstata a través de la activación de un mecanismo apoptótico dependiente de caspasa.
A, un Anexina V-FITC /PI tinción ensayo de apoptosis y citometría de flujo se realizaron en LNCaP y C4-2B células transfectadas con miRNAs. Tanto el miR-185 y 342 se incrementaron las fracciones de células apoptóticas (ambas fracciones de células apoptóticas tempranas y tardías;
P Hotel & lt; 0,005) en comparación con los grupos de control. B, caspasa 3/7 actividades se incrementaron de manera significativa por el miR-185 y 342 en las células LNCaP y C4-2B. Caspasa 3/7 actividades (sofá) fueron asignados como 1,0 en no transfectadas las células (-). **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas de NC. Los datos representan la media ± DE de dos experimentos independientes por triplicado. C, miR-185 y 342 disminuye pro-caspasa 9, 3 y PARP, y la caspasa 3 escindida y la PARP expresión activado en las células LNCaP tal como se ensayó por transferencia de Western. β2M se utilizó como control de carga. C:. Escindido
intratumoral de entrega de miR-185 y 342 potenciales a la regresión de tumores de próstata en un modelo de xenoinjerto de ratón
Debido a que los
in vitro
datos demostraron papeles anti-tumorigénicos y apoptóticos de miR-185 y 342 en las células de cáncer de próstata, que posteriormente examinaron el potencial terapéutico de miR-185 y 342 usando una próstata subcutáneo modelo de xenoinjerto de tumor de ratón. Después de un tratamiento de 21-d por entrega intratumoral cada 3 d, tanto miR-185 y 342 redujo significativamente la carga tumoral C4-2B subcutánea en comparación con el grupo control (Fig. 4A). Para correlacionar la respuesta terapéutica con la entrega de los genes miARN, miARN fue aislado de tumores C4-2B frescas y los niveles de miR-185 y 342 fueron evaluados por QRT-PCR. Los tumores inyectados con miR-185 o 342 contenían aproximadamente 116 ± 30 veces (el miR-185,
P Hotel & lt; 0,05) o 278 ± 59 veces (el miR-342,
P & lt
; 0,05) mayor que los tumores de control (Fig 4B).. Estos hallazgos sugieren que la inhibición del crecimiento C4-2B subcutánea se debió a miR-185 o 342 de tratamiento. En consonancia con los anteriores
in vitro
resultados de Western blot (Fig. 1B), los datos IHC mostraron que los grupos tratados miR-185 o 342 habían disminuido SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR y PSA, que es un gen diana aguas abajo AR, la expresión en comparación con los tumores de control (Fig. 4C). Por otra parte, para determinar los efectos de miR-185 y 342 sobre la proliferación celular y la apoptosis
in vivo
, se realizó el biomarcador Ki67 y se escindió tinción de PARP en los tumores C4-2. Como se muestra en la Fig. 5A y 5B, notablemente disminución de la proliferación celular (Ki67) y el aumento de la muerte apoptótica (escindido PARP) de los tumores se observaron tanto en C4-2B miR-185 y 342 muestras de tumor tratados en comparación con el grupo control. El
in vivo
resultados indican que la aplicación directa de miR-185 y 342 a los tumores prostáticos pueden proporcionar un beneficio terapéutico en un sistema modelo de cáncer de próstata.
A, el crecimiento del tumor subcutáneo fue C4-2B ensayada por el volumen del tumor después de la entrega intratumoral de miR-185, 342 o NC cada 3 d para un tratamiento de 21 días en ratones. Tanto miR-185 y 342 inhibieron significativamente el crecimiento de tumores C4-2B comparación con los tumores tratados con NC. *,
P Hotel & lt; 0,05; **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas respecto a los tumores tratados con NC (N = 5 para cada grupo). B, La expresión relativa de miR-185 o 342 en los tumores C4-2B. QRT-PCR resultados mostraron que los relativos miR-185 o 342 niveles se incrementaron en gran medida en los tumores subcutáneos C4-2B inyectadas con miR-185 o 342 en comparación con los tumores de control. La expresión de los genes miARN relativa (fold) fue asignado como 1,0 en Carolina del Norte. *,
P Hotel & lt; 0.05 diferencias significativas de NC. Los datos se normalizaron a RNU6B y representan la media ± desviación estándar. C, los resultados de IHC mostró que la baja regulación de SREBP-1, SREBP-2, FASN, HMGCR, AR y PSA se observó en el miR-185 y 342-tratan los tumores subcutáneos C4-2B en comparación con los tumores tratados con Carolina del Norte. Las barras de escala = 25 micras
La cuantificación de A, Ki67 (proliferación celular) y B, PARP escindida (C-PARP; apoptosis). células positivas en muestras de tumores subcutáneos C4-2B recogidas del miR Carolina del Norte, 185 y 342 grupos tratados. Un centenar de células en 5 áreas seleccionadas al azar fueron contados y se registraron las células con tinción positiva. **,
P Hotel & lt; 0,005 diferencias significativas con el grupo NC control. Los datos representan la media ± SD. Las puntas de flecha indican las células C-PARP positivos. Las barras de escala = 100 m.
Discusión
aberrante de lípidos y colesterol anabolismo están íntimamente relacionadas con el cáncer de próstata [36], [37]. Sobre regulación de la lipogénesis y colesterogénesis en células de cáncer se asocia con mayor necesidad de componentes de la membrana celular y la activación de la transducción de la señalización intercelular relacionadas con la balsa de lípidos durante la proliferación celular incontrolada y división, así como el desarrollo y progresión del cáncer [24], [38] - [41]. El bloqueo de la lipogénesis anormal y colesterogénesis proporciona un enfoque terapéutico prometedor para la prevención o el tratamiento de neoplasia maligna de próstata. Mirna se ha informado que regulan múltiples procesos biológicos importantes, incluyendo el metabolismo de [3], [5] y es de uso potencial en la terapia del cáncer [42] - [44]. Sin embargo, ¿cómo miARN media metabolismo de las grasas y la homeostasis aberrante en las células de cáncer de próstata sigue siendo poco clara. En este estudio, identificamos dos miRNAs que juegan un papel importante en la regulación de la lipogénesis y colesterogénesis en células de cáncer de próstata. MiR-185 y 342 inhibieron de ácidos grasos y la biosíntesis de colesterol a través de la baja regulación de factores de transcripción lipogénesis y cholesterogenic clave, SREBP-1 y SREBP-2, y sus genes regulados aguas abajo incluyendo FASN y HMGCR. SREBP-1 y FASN han demostrado ser un factor potencialmente oncogénico transcripción [22] y un oncogén metabólica [20], [21], respectivamente. MiR-185 y 342 reducen la proliferación celular, clonogenicidad, la migración y la invasión, y la apoptosis inducida por la caspasa-dependiente en las células de cáncer de próstata. Estos datos sugieren que miR-185 y 342 desempeñan un papel-tumor supresor mediante la inhibición de la expresión de SREBP-1 y SREBP-2, y de ese modo la reprogramación de la lipogénesis y colesterogénesis.
Se han identificado un número de miRNAs estar vinculado a el desarrollo del cáncer de próstata y la progresión a la enfermedad letal. MiR-20a se informó para regular la proliferación celular y la progresión a través de la inhibición de la brecha de la salida proteína connexin 43 expresión en el cáncer de próstata [45]. expresión disminuida de miR-143 y 145 se han encontrado en pacientes con cáncer de próstata con metástasis ósea [46]. Además, tanto el miR-143 y 145 mediadas transición epitelio-mesenquimal (EMT) y suprimen la capacidad metastásica de las células de cáncer de próstata PC3
in vitro
y
in vivo
[46]. MiR-203 el regulado una cohorte de genes relacionados con la metástasis y la metástasis ósea prevenido en el cáncer de próstata [47]. Mediante el bloqueo de la expresión de CD44, miR-34a inhibe la migración y la invasión de las células madre del cáncer de próstata [48]. MIR-let-7c disminución de la expresión de AR y la actividad en las células de cáncer de próstata por la orientación de un factor de transcripción oncogénico, c-Myc [49]. Análisis de muestras de tumores clínicos recogidos de la castración ósea metastásica del cáncer de próstata resistente (CRPC) de los pacientes reveló que la expresión /27b miR-23b aberrante podría estar implicado en la progresión de la resistencia a la castración [50]. Además, miR-221 y 222 se han demostrado para controlar el desarrollo de CRPC [12]. En el presente estudio, hemos descubierto dos nuevos anabolismo regulado miRNAs de lípidos y colesterol, miR-185 y 342, que bloquearon la SREBP-lipogénesis-colesterogénesis, disminución de la expresión del RA, tumorigenicidad inhibida y la muerte por apoptosis inducida en células de cáncer de próstata. Una combinación de miR-185 y 342 no mostró el efecto significativamente aditivo o sinérgico sobre la expresión génica, el crecimiento, la migración y la invasión en comparación con solo miARN en las células de cáncer de próstata (datos no mostrados). Por otra parte, la expresión de miR-185 intrínseca o 342 fue significativamente más baja en las células de cáncer de próstata en comparación con las células normales /no cancerosas epiteliales. debe ampliarse la investigación de los perfiles de expresión de miR-185 y 342 en muestras de tumores de próstata humanos.