Extracto
Antecedentes
miR-18a es una de las más miRNAs hasta reguladas en el cáncer colorrectal (CRC) en base a perfiles de miARN. En este estudio, hemos examinado la importancia funcional de miR-18a en el CCR.
Métodos
La expresión de miR-18a se investigó en 45 pacientes con CCR. Los posibles genes diana de miR-18a fueron predichas por
in silico
buscar y confirmados por el ensayo de actividad de la luciferasa y Western blot. daño en el ADN se midió por el ensayo de cometa. la función de genes se midió la viabilidad celular, la formación de colonias y ensayos de apoptosis.
Resultados
La sobre regulación de miR-18a se validó y se confirmó en 45 CRC tumores primarios en comparación con los tejidos normales adyacentes
(
p
& lt;
0,0001). A través de
in silico
búsqueda, el 3'UTR de
La ataxia telangiectasia mutada (ATM)
contiene un sitio de unión conservada miR-18a. La expresión de ATM se había reducido regulado en los tumores de CRC (p
& lt;
0,0001) e inversamente correlacionada con la expresión de miR-18a (r = -0.4562, p
& lt;
0,01). La sobreexpresión de miR-18a en células de cáncer de colon reducido significativamente la actividad de la luciferasa de la construcción con el tipo salvaje ATM 3'UTR pero no con el mutante ATM 3'UTR, inferir una interacción directa de miR-18a con cajero automático 3'UTR . Esto fue confirmado por la baja regulación de la proteína ATM por miR-18a. Como ATM es una enzima clave en la reparación del daño en el ADN, se evaluó el efecto de miR-18a en el ADN de doble filamento se rompe. La expresión ectópica de miR-18a inhibió significativamente la reparación del daño en el ADN inducido por etopósido (p
& lt;
0,001)., lo que lleva a la acumulación de daño en el ADN, aumento de la apoptosis celular y la supervivencia de los pobres clonogénico
Conclusión
miR-18a atenúa la reparación celular del ADN de doble filamento se rompe por la supresión directa cajero automático, una enzima clave en la reparación del daño en el ADN
Visto:. Wu CW, Dong YJ, Liang QY, él xQ, Ng SSM, Chan FKL, et al. (2013) microARN-18a atenúa la reparación del daño del ADN a través de suprimir la expresión de la ataxia telangiectasia mutada en el cáncer colorrectal. PLoS ONE 8 (2): e57036. doi: 10.1371 /journal.pone.0057036
Editor: Xin-Yuan Guan, la Universidad de Hong Kong, China
Recibido: 15 Noviembre 2012; Aceptado 16 de enero de 2013; Publicado: 21 Febrero 2013
Copyright: © 2013 Wu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este proyecto el apoyo de una Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (SNCF) (Proyecto de código 81101488), un programa de China 863 (2012AA02A506) y el fondo de la ITF Hong Kong (ITS /276/11). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
miRNAs son moléculas de ARN no codificantes de 18 a 25 nucleótidos que regulan la traducción del ARNm. Ellos ejercen los efectos apuntando el silenciamiento inducido por ARN complejo (RISC) a los sitios complementarios en la región no traducida 3 '(UTR) de sus genes diana [1]. La unión de un RISC-miARN cargado con una secuencia complementaria supondrá la creación de la represión de traducción o el decaimiento de la específica de ARNm [2]. A través de este, miRNAs regulan una variedad de procesos celulares incluyendo la apoptosis [3], [4], la diferenciación [5] y la proliferación celular [6]. La alteración de los perfiles de expresión de genes miARN se encontraron en la mayoría de los tipos de tumores, incluyendo el cáncer colorrectal (CCR) [7], [8], [9], [10]. La manipulación de miRNAs específicos se encontró que era capaz de modular el desarrollo de tumores en un modelo animal [6], [11], [12]. Anteriormente, a través de perfiles de la expresión de 667 miRNAs en tejidos de cáncer colorrectal humano, se identificaron miR-18a como uno de los miRNAs más regulados up-en CRC humana [13]. Un alto nivel de miR-18a se puede detectar en las heces de pacientes con CRC en comparación con los individuos con colonoscopia normal. Tras la eliminación del tumor, el nivel de las heces de miR-18a se redujo significativamente [13].
miR-18a pertenece a la agrupación de miR-17-92, que se encuentra en el cromosoma 13q31.1 región. El papel oncogénico de la agrupación miR-17-92 está bien documentada. La sobreexpresión de la agrupación se asocia con el crecimiento tumoral acelerado [6] y la proliferación celular [14]. el aumento de número de copias cromosómicas en la región de agrupamiento de miR-17-92 se asoció con la progresión neoplásica de adenoma a carcinoma [15]. Alta expresión de miR-18a se ha implicado en el cáncer de mama [16], cáncer de vejiga [17] y el cáncer de páncreas [18]. Sin embargo, el papel funcional de miR-18a en el CCR sigue siendo poco clara. En este estudio, que tuvo como objetivo identificar el gen diana y su papel crítico en el CCR.
Métodos y Materiales
Muestras de Tejido Humano
Los tejidos tumorales rectal y adyacentes no tumorales fueron obtenidos de 45 pacientes con cáncer de recto confirmado histológicamente cuando fueron sometidos a cirugía en el hospital Príncipe de Gales, Hong Kong durante 1999 a 2003. mucosa rectal normal se obtuvo de los controles sanos durante la colonoscopia en el Prince of Wales hospital durante el año 2009. Todos los sujetos dado su consentimiento informado por escrito antes de la toma de la muestra. El procedimiento de protocolo de estudio y el consentimiento fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad China de Hong Kong.
Cultivo celular, transfección de genes miARN precursores y
CRC líneas celulares HCT-116 y HT-29 eran adoptada por
in vitro
ensayos debido a que estas dos líneas celulares expresan ATM funcional en respuesta al ADN de doble filamento romper (DSB) [19], [20]. Ambas líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection y se cultivaron en medio 5A de McCoy (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) con 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, Carlsbad, CA) en 5% de CO
2 a 37 DO. El precursor de miR-18a (pre-miR-18a) y control negativo (pre-miR-ctrl) fueron adquiridos de Applied Biosystems (Foster City, CA). La transfección se realizó utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante.
Dual-luciferasa Ensayo Reportero
El sitio potencial de unión de miR-18a en la región untranslation ATM 3 '(3'UTR) fue predicho por TargetScan (www.targetscan.org) y Miranda (www.microRNA.org). Las secuencias con la de tipo salvaje o regiones de semillas mutantes fueron clonados en PMIR-INFORME vector de luciferasa (Applied Biosystems). La secuencia 3'UTR ATM mutante se preparó mediante la mutación de 5 nucleótidos en la región de la semilla. Los oligonucleótidos sintetizados se muestran a continuación:
De tipo salvaje sentido hebra:
5'-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTGCACCTTAATGAAATTATCGAGCT-3 '
De tipo salvaje antisentido línea de acción:.
5'-CGATAATTTCATTAAGGTGCAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 '
cadena sentido mutante:.
5'-CTAGTTGTGTCCCAATTTCAAGTATTTTAATTTCGTATCAATGAAATTATCGAGCT-3'
Mutant cadena antisentido:.
5'-CGATAATTTCATTGATACGAAATTAAAATACTTGAAATTGGGACACAA-3 '.
Las líneas celulares transfectadas de forma transitoria con pre-miR-18a o un control negativo pre-MIR (a 15 nM concentración final) en placas de 24 pocillos fueron co transfectadas con
Renilla luciferasa informe Gráficos vectoriales (195 ng /pocillo) y
Firefly Gráficos vectoriales luciferasa (5 ng /pocillo) utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células se recogieron 48 horas después de la transfección y actividades de luciferasa se analizaron mediante el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega, Madison, WI).
miARN cuantificación mediante transcripción inversa cuantitativa reacción de polimerasa en cadena
inversa cuantitativa la transcripción de reacción en cadena de la polimerasa (QRT-PCR) del individuo miARN se realizó utilizando el kit TaqMan miARN transcripción reversa (Applied Biosystems) y el ensayo miARN humana TaqMan (RNU6B: 001093; miR-18a: 002422; miR-16: 000391) basado en un protocolo modificado de Applied Biosystems [21]. nivel de expresión de los genes miARN se normalizó con el control interno. Los operadores del experimento tenían conocimiento de los datos clínicos en el momento de la cuantificación de los genes miARN se llevó a cabo.
QRT-PCR para ARNm
Para la cuantificación de ARNm de ATM, el ARN total fue transcrito inversa con cebadores aleatorios usando Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems), y PCR en tiempo real se estableció con Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). expresión ATM se normalizó a deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) Las secuencias de cebador son los siguientes: ATM: Delantero: 5'-GGAGAGCTGGAAAGCATTGG-3 '; Reverso: 5'-TGAGAAGCTGGGAGTGTTTCTG-3 '. GAPDH: Delantero: 5'-3-GAAGGTGAAGGTCGGAGT «inversa: 5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3 '
Análisis Western Blot
La proteína total se extrajo y la concentración de proteínas se midió por la proteína Bradford DC. ensayo (Bio-Rad, Hercules, CA). 20 a 40 l de proteína de cada muestra se separaron en 8% Bis /Tris gel de poliacrilamida-a través de electroforesis y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Las transferencias se inmunotiñeron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche y anticuerpo secundario a temperatura ambiente durante 1 hora. Anti-ATM anticuerpo (2C1) se adquirió de Genetex (Irvine, CA). Anti-fosfo-quinasa de control 2 de anticuerpos (Thr68) fue adquirido de Señalización Celular (Danvers, MA). Anti-GAPDH (SC-25778) de anticuerpos fue adquirido de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA).
Comet Assay
células HCT-116 se transfectaron transitoriamente con pre-miR-18a o control negativo pre-MIR (a 15 nM concentración final) en placas de 24 pocillos. Después de una hora de incubación con etopósido 2 M o DMSO, se recogieron las células, ya sea o cambiaron a medio sin etopósido durante 2 horas para permitir la reparación del daño de ADN. Al final del experimento, las células se recogieron para el ensayo cometa según la guía del fabricante (Trevigen, Gaithersburg, MD). Los momentos de la cola de los cometas de células se analizaron automáticamente usando un software de análisis de cometa, CometScore (Tri Tek Corp, Sumerduck, VA). Se determinaron los momentos de cola de 50 o más células por portaobjetos.
Formación de Colonias y la viabilidad celular Ensayo
Las células (1 × 10
5 por pocillo) se sembraron en una placa de 24 pocillos y transfectadas con pre-miR-18a o pre-miR-ctrl a 15 nM. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron con etopósido 2 M o DMSO durante 1 hora, recogieron y se sembraron (500 a 1000 /pocillo) en una placa de 24 pocillos fresca durante 9 días. Se contaron las colonias después de teñir con
hematoxilina de Harris
solución. La viabilidad celular se determinó por el 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) ensayo (Promega) de acuerdo con la guía del fabricante. Brevemente, se añadió solución de MTT a cada pocillo a una concentración final de 1 mg /ml por pocillo y las placas se incubaron a 37 ° C durante otras 3 h. Después de la incubación, se añadieron 200 l de DMSO a cada pocillo para disolver el formazan formado y la absorbancia se leyó a 570 nm usando un espectrofotómetro. Se triplicaron todos los experimentos.
Anexina V Apoptosis ensayo
Las células (1 × 10
5 por pocillo) se sembraron en una placa de 24 pocillos y se transfectaron con pre-miR-18a o pre-miR-ctrl a 15 nM. Veinticuatro horas después de la transfección, las células se incubaron con 2 etopósido M o DMSO durante 1 hora. La apoptosis se evaluó por citometría de flujo después de tinción con anexina V (conjugado con FITC) (BD Biosciences, Erembodegem, Bélgica) y 7-amino-actinomicina (7-AAD; BD Biosciences)
Estadísticas
Asociación entre miR-18a y expresión ATM se analizó mediante la prueba r de correlación de Spearman. Diferencia entre dos grupos en el ensayo indicador de luciferasa, ensayo y ensayo de formación de colonias cometa se determinó mediante test t de Student. Asociaciones de nivel de expresión de miR-18a con las características clínico-patológicas se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher. El análisis de regresión se analizó mediante SPSS (IBM, Nueva York, Estados Unidos). La diferencia en las curvas de crecimiento de células fue determinada por ANOVA de medidas repetidas. análisis de supervivencia libre de progresión fue realizada por el método de Kaplan-Meier y los resultados se analizaron mediante la prueba de log-rank. p & lt; 0,05 se tomó como la significación estadística. Todas las pruebas estadísticas excepto el análisis de regresión se realizaron mediante GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA).
Resultados
miR-18a está regulada-Up en tumor rectal
Entre los 45 pares de muestras de tejido de cáncer de recto, 44 pares tenían una mayor expresión de miR-18a en el tumor que en el tejido normal adyacente (p & lt; 0,0001; figura 1A), con una diferencia media de aumento de 11,46 veces (IQR 4.73- 26,00). Una alta expresión de miR-18a en el tumor se asoció con una mayor tasa de recurrencia, de los que 9 de cada 15 casos con tumor de alto miR-18a vuelto a aparecer en comparación con sólo 6 de los 29 casos con baja tumoral miR-18a presentó recidiva después de la resección quirúrgica (p & lt ; 0,05, tabla 1). El análisis multivariado confirmó además que la asociación entre el nivel de miR-18a y la recurrencia fue independiente de la edad, el sexo y el estadio del cáncer (Tabla 1). análisis de supervivencia libre de progresión mostró que los pacientes con niveles de miR-18a tumoral alta tienden a tener más rápida recurrencia después de la cirugía, en comparación con los pacientes con tumor de bajo nivel de miR-18a (p
=
0,005, Figura 2).
La expresión de (a) miR-18a, normalizado a miR-16a y (B) de ATM, normalizado a GAPDH en 45 pares de tumores rectales y tejidos normales adyacentes. valores p indican diferencias significativas entre muestras pareadas determinados por la prueba de pares de Wilcoxon. parcelas (C) de dispersión que muestra la asociación entre el nivel de miR-18a y expresión ATM. (D) Expresión de ATM normalizó a GAPDH en 8 líneas de células colorrectales y tres biopsias de colon normales (N1, N2 y N3).
Alta expresión de miR-18a en los tumores se definió con base en el más alto tercil. la expresión de miR-18a se normalizó a la de miR-16 y se hace referencia al nivel de miR-18a en el tejido normal adyacente. valor de p se determinó mediante la prueba de log-rank.
predicción in silico de la meta de miR-18a y validación por ensayo de luciferasa
El uso de algoritmos para la predicción de genes diana, TargetScan [ ,,,0],22] y Miranda [23], la enzima clave en la reparación del daño en el ADN, la ataxia telangiectasia mutada (ATM), fue identificado como uno de los posibles objetivos de miR-18a. El alineamiento de secuencias de miR-18a con diferentes especies de ATM 3'UTR también fue conservada (Figura 3A), lo que indica que la ATM es uno de los objetivos directos potenciales de miR-18a. La unión predicha de miR-18a con
Homo sapiens
ATM 3'UTR se ilustra en la Figura 3B. Para confirmar aún más que la ATM es el objetivo directo de miR-18a, un segmento de la 3'UTR del cajero automático que consiste en la región de semillas, con o sin mutaciones puntuales, fue sub-clonado aguas abajo del indicador de luciferasa de luciérnaga (Figura 3B). Las construcciones fueron co-transfectadas con pre-miR-18a o con control de pre-MIR para ensayos de actividad de luciferasa. La expresión ectópica de pre-miR-18a en las células HCT-116 se confirmó mediante qRT-PCR (p & lt; 0,0001, Figura 3C). La actividad luciferasa relativa del constructo de tipo salvaje de la ATM 3'UTR en HCT-116 se redujo significativamente en presencia de miR-18a (p & lt; 0,001; prueba de Mann-Whitney), mientras que un efecto supresor de miR-18a en actividad de la luciferasa no se observó en la presencia de mutante ATM 3'UTR (Figura 3D), lo que indica una interacción directa y específica de miR-18a en ATM 3'UTR. La interacción fue confirmado por la observación de que la sobre expresión de miR-18a fue capaz de reducir el nivel de proteína ATM y la fosforilación de la quinasa de control (CHK-2), un objetivo de la fosforilación directa de aguas abajo ATM
in vitro
(Figura 3E). Etopósido en tratamiento durante 1 hora, nivel PCHK-2 fue significativamente regulada hasta -independientemente de miR-18a sobre-expresión.
(A) El sitio de la alineación de miR-18a (subrayado) dentro de ATM 3'UTR de diferente especies se conserva. (B) secuencia de miR-18a humano maduro y la región de 3'-UTR de ATM humana que contiene el sitio de reconocimiento, que se clonó en un constructo con
Renilla
luciferasa. El mutante 3'-UTR contiene una región de semillas con 5 nucleótidos mutados (subrayados). (C) La expresión de miR-18a en las células HCT-116 transfectadas con el control de los precursores miARN (pre-MIR-ctrl) o miR-18a precursor (pre-miR-18a) a 15 nM. (D) La actividad de luciferasa en las células HCT-116 co-transfectadas con el
Renilla luciferasa
constructo (que contiene las semillas de tipo salvaje o región de miR-18a mutante),
Firefly
constructo de luciferasa y pre-miR ctrl o pre-miR-18a a 15 nm. Nivel de actividad se calculó por la normalización de
Renilla luciferasa
a
Firefly
luciferasa. NS indica significación estadística. valor de p se determinó mediante test t de Student. media y la desviación estándar (SD) se calculó a partir de tres experimentos independientes. (E) por inmunotransferencia de la expresión endógena en las células ATM HCT-116 48 horas después de la transfección de pre-miR-ctrl y pre-miR-18a. (F) por inmunotransferencia de la forma fosforilada de la proteína CHK-2, un objetivo corriente abajo directa de ATM, en las células HCT-116, después de la transfección de pre-miR-ctrl o pre-miR-18a bajo el tratamiento con etopósido DMSO o 2 M durante 1 hora.
ATM es el regulado en el tumor rectal y líneas celulares de CRC
ha expresión
ATM se evaluó en 45 pares de tumor rectal y los tejidos normales adyacentes. En contraste con miR-18a, la expresión de ATM fue significativamente menor en los tumores que en los tejidos no tumorales (p & lt; 0,0001; Figura 1B), con una diferencia media de 0.369 veces (IQR 0,127 a 0,575). La expresión de miR-18a y el de ATM se correlacionó inversamente con un Spearman r = -0,4562 (p & lt; 0,01; Figura 1C). El aberrante baja regulación de la ATM también se observó en líneas celulares de CRC en comparación con las biopsias de colon normal (p & lt; 0,05, Figura 1D).
miR-18a Regula la recuperación de daños de ADN de doble cadena
activación ATM representa un evento temprano e importante para la reparación del ADN en respuesta a los ADN DSBs [24]. A medida que el miR-18a es capaz de suprimir la expresión de ATM, que postula la expresión excesiva de miR-18a en las células podría inhibir el mecanismo de recuperación. El nivel de las DSB fue investigado por el ensayo cometa. Sin la inducción de daño en el ADN, HCT-116 células tenían un momento de la cola de línea de base de 7,75 ± 4,37 unidades. La exposición a etopósido 2 M durante 1 hora resultó en un momento de la cola significativamente mayor (15,46 ± 6,07 unidades, p & lt; 0,0001), lo que indica la inducción de ADN DSBs por etopósido. Cuando permitido durante 2 horas en medio normal suplementado con 10% de FBS para la recuperación, momento de la cola de las células tratadas con etopósido HCT-116 restaurados a nivel de línea de base (7,69 ± 5,14 unidades), mientras que momento de la cola de las células HCT116 sobre-expresión de miR-18a se mantuvo significativamente más alto que el nivel basal (p & lt; 0,001), lo que indica el miR-18a indujo un efecto de prohibir la reparación del ADN (Figura 4)
(a) la línea de tiempo del orden de tratamiento (B) las muestras de colas de los cometas de. cada grupo, de izquierda a derecha, las células transfectadas con precursor de control miRNA (pre-miR-ctrl) y sin tratamiento de drogas, las células transfectadas con pre-miR-ctrl y tratados con 2 M etopósido, las células transfectadas con pre-miR-ctrl y tratados con 2 etopósido mu M, y las células transfectadas con pre-miR-18a y se trataron con 2 etopósido mu M, se permitió que los dos últimos grupos de células durante dos horas en medio normal después del tratamiento de drogas. plot (C) Caja de momento de la cola de las células bajo tratamiento diferente basado en el análisis de 50 células de campos microscópicos al azar. El cuadro representa el rango intercuartil, la línea a través de la caja indica los valores de la mediana y los bigotes representan valores de los percentiles 5-95. Los valores de p se evaluaron mediante la prueba t no paramétrico.
miR-18a Aumenta la sensibilización de las células CRC a genotoxin
Sin respuesta rápida y la reparación, el daño del ADN se acumula y reduce el crecimiento celular y la viabilidad celular. Investigamos el efecto de miR-18a sobre el crecimiento celular CRC por ensayo de formación de colonia en dos líneas celulares de CRC (HT-29 y HCT116). Sin la inducción de daño en el ADN, la sobre expresión de miR-18a no tuvo efecto significativo en el crecimiento celular en comparación con las células transfectadas con el control de precursores tanto en HT-29 (Figura 5A) y en HCT-116 (Figura 5C). Expuestos a 2 M etopósido, las colonias formadas se redujeron significativamente en HT-29 (Figura 5A) y en HCT-116 (Figura 5C). la viabilidad celular En consonancia, la expresión ectópica de miR-18a suprimió significativamente en comparación con el precursor de control sobre-expresión de HT-29 (p & lt; 0,001; Figura 5B) y HCT-116 (p & lt; 0,05; Figura 5D).
El efecto de la expresión ectópica de miR-18a sobre el crecimiento celular de las células (a) HT-29 o (C) células HCT-116, con o sin tratamiento de 2 M etopósido. Media ± desviación estándar se calcula a partir de tres experimentos independientes. diferencia significativa se determinó mediante test t de Student. NS indica significación estadística. Efecto de miR-18a en (B) HT-29 y (D) HCT-116 de la viabilidad celular después del tratamiento con 2 M etopósido. Media ± desviación estándar se calcula a partir de tres experimentos independientes. diferencia significativa fue determinada por ANOVA de medidas repetidas.
miR-18a promueve la apoptosis inducida por genotoxin
Sin la inducción de daño en el ADN, la sobre expresión de miR-18a no indujo un efecto significativo en la apoptosis celular en el TC-29 y en HCT-116 (Figura 6). La exposición a etopósido 2 M indujo significativamente la cantidad de células apoptóticas en las células HT-29 y HCT-116 (ambos p & lt; 0,001; Figura 6A2 y 6B2). La sobreexpresión de miR-18a inducida aún más la apoptosis de forma sinérgica con etopósido en tanto HT-29 (p & lt; 0,0001) y HCT-116 (p & lt; 0,01). Las células
HT-29 células (A) o (B ) HCT-116 células, con o sin tratamiento de 2 M etopósido. Media ± desviación estándar se calcula a partir de tres experimentos independientes. diferencia significativa se determinó mediante test t de Student. NS indica significación estadística.
Discusión
En este estudio, se estableció una conexión clara entre el miR-18a y el cajero automático gen. ensayo de indicador de luciferasa y Western blot confirmó la interacción, que era a través de la unión de miR-18a a la región no traducida 3 'de ATM mRNA y posteriormente suprimida su traducción de la proteína y su actividad. Esta asociación fue más evidente a partir de la correlación inversa entre el miR-18a y ATM en los tejidos tumorales recto (p & lt; 0,01).
ATM es una proteína quinasa de alto peso molecular que juega un papel central y principios de promoción de la reparación de ADN DSBs, que son una forma de las lesiones del ADN más citotóxicos que surgen a través tanto endógenas (por ejemplo, estrés oxidativo) y exógenos (por ejemplo, radiación ionizante y agentes genotóxicos) fuentes. En la celda no estimulada, ATM existe principalmente como un homodímero inactiva o multímero, con el dominio quinasa de una proteína ATM unido al dominio interno de otra proteína ATM que contiene la serina del sitio 1981-fosforilación [24]. Esta estructura es esencial para mantener la proteína ATM inactivo y estable cuando no hay daño en el ADN. Por lo tanto, en ningún estímulo externo que conduce al daño del ADN, miR-18a sobre-expresión indujo ningún cambio significativo en fenotípica HT-29 y células HCT-116 como es evidente por la viabilidad celular, la proliferación y el análisis de la apoptosis en comparación con los grupos de control. Sin embargo, en respuesta al daño del ADN inducido por etopósido, un agente genotóxico que induce específicamente DSBs, se encontró que las células que sobre-expresan el miR-18a eran menos capaces de restaurar de daños en comparación con las células transfectadas con el precursor de control de miARN, lo que refleja un DSB de ADN comprometidas mecanismo de reparación. Bajo estímulo daño del ADN, el dominio quinasa de una proteína ATM fosforila la 1981-dominio de la proteína ATM interactuar, dando como resultado quinasa activa en forma monomérica [24]. Activado ATM se libera y puede fosforilar una amplia gama de objetivos de abajo que participan en eventos para reparar el daño del ADN [25]. La sobreexpresión de miR-18a reducida ATM cantidades de proteínas y por lo tanto la disponibilidad de ATM activado para la reparación del ADN. Por lo tanto, como daños en el ADN se acumulan sin que la pronta reparación, miR-18a sobre-expresión de las células eran más propensos a cometer la apoptosis, la reducción de la supervivencia clonogénico y tasa de proliferación, como es evidente tanto en las células HT-29 y HCT-116.
comprometida mecanismo de reparación del ADN debido a la pérdida de la función de ATM es una predisposición conocida a diversas enfermedades. El ejemplo más evidente es el autosómico heredado trastorno recesivo, Ataxia-telangiectasia (A-T), que resulta de la pérdida de expresión de la proteína ATM o producto de proteína funcional. La enfermedad se caracteriza por ataxia cerebelosa progresiva, neurodegeneración, radiosensibilidad, defectos de punto de control del ciclo celular, la inestabilidad del genoma, y una predisposición a diversas formas de cáncer [26], [27], [28]. ganancia cromosómica en la región 13q31.1, donde se encuentra el miR-17-92, es un evento temprano en la secuencia adenoma-carcinoma. Consistentemente, sobre regulación de miR-18a se encuentra desde la etapa precancerosa del CRC [13]. El mecanismo de reparación del ADN suprimido inducida por hasta reguladas miR-18a podría servir un papel catalizador en la formación de carcinoma.
Actualmente, el estadio del tumor es el indicador pronóstico más importante para los pacientes de CRC. Sin embargo, muchos pacientes desarrollaron recurrencia después de la resección quirúrgica independientemente del estadio o la prestación de la quimioterapia adyuvante. Se necesitan biomarcadores de pronóstico adicionales para proporcionar una mejor evaluación del riesgo de recurrencia que los pacientes puedan beneficiarse de un seguimiento estrecho. Encontramos alto nivel de miR-18a se asocia con una mayor tasa de recurrencia y la recurrencia rápida. Queda por dilucidar si este fenómeno está mediada a través de cajeros automáticos u otros genes diana de miR-18a. Sin embargo, el papel de ATM en la predicción de la resistencia /radio-quimioterapia en un entorno clínico no queda claramente establecida. Roossink et al. informó que la activación inducida ATM papel protector de la quimio /radioterapia en una cohorte de pacientes con cáncer de cuello del útero [29]. Jiang et al., Sin embargo, mostró que ATM podría sensibilizar y proteger contra la citotoxicidad inducida por la doxorrubicina, en función de la competencia de los otros genes de reparación del ADN, tales como p53 y CHK-2 [30]. Huehls et al. mostró que el agotamiento de ATM no sensibilizar a las células a 5-FU, que es el régimen principal utilizado en CRC [31]. Admansen et al. también mostró que a dosis clínicamente relevante de 5-FU, el cajero automático de la vía no se activa para la reparación del ADN en las células de CRC [32]. Por lo tanto, aunque nuestros
in vitro
datos demuestran claramente la supresión de la ATM por sensibilizado miR-18a células cancerosas a etopósido, el papel de la función de cajero automático en la quimio-resistencia puede variar de una manera específica y quimioterapéutico específico de tumor
in vivo
. Además, la recurrencia asociada-miR-18a también puede ser mediada a través de otros genes diana potenciales que inducen su carácter oncogénico
in vivo
. Esta hipótesis, sin embargo, requiere de mayor investigación y validación. El establecimiento de miR-18a como marcador de recurrencia también necesita ser validado en una cohorte de mayor tamaño de muestra.
En conclusión, hemos identificado cajero automático, una proteína crucial para la reparación del ADN, como el objetivo de miR-18a. En los tejidos de cáncer de recto, la expresión de miR-18a y ATM inversamente correlacionada. La expresión ectópica de miR-18a suprime la expresión ATM y atenúa la reparación de DSB de ADN. miR-18a, un miARN frecuencia regulada de manera ascendente en CRC, induce su efecto oncogénico al menos en parte, a través de la supresión de ATM. Por otra parte, el nivel del tumor miR-18a es un marcador potencial de recurrencia del cáncer de recto.