Extracto
Fondo
microARN (miARN) es una subclase emergente de pequeños ARN no codificantes que regula la expresión génica y tiene un papel fundamental para muchos procesos fisiológicos, incluyendo el desarrollo del cáncer. Informes recientes revelan el papel de miRNAs como biomarcadores y dianas terapéuticas ideales debido a su naturaleza tejido o específica de la enfermedad. cáncer de cabeza y cuello (CCC) es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionada con el cáncer, y el cáncer de laringe tiene la incidencia más alta en el mismo. Sin embargo, los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo del cáncer de laringe aún no se han conocido y biomarcadores sensibles y altamente prometedora terapia novedosa es necesario.
Metodología /Principales conclusiones
Para explorar miRNAs específicos de cáncer de laringe, el ARN a partir de 5 muestras quirúrgicas laríngeos incluyendo el cáncer y sin cáncer tejidos se hibridó con microarrays de llevar a 723 miRNAs humanos. Las resultantes miRNAs expresados diferencialmente se ensayaron adicionalmente mediante el uso de PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR) en muestras de tejido 43 laríngeos incluyendo los cánceres, las contrapartes no cancerosas, enfermedades benignas y displasias precancerosas. expressional diferencias significativas entre las dos muestras se recogieron en el miR-133b, miR-455-5p, y miR-196a, entre los cuales es el biomarcador de cáncer más prometedor como validado por QRT-PCR miR-196a análisis de muestras adicionales de tejido 84. análisis de secuenciación profunda reveló desviación cuantitativa y cualitativa de la expresión de miR-196a isomiR en el cáncer de laringe. La hibridación in situ confirmó la expresión específica del cáncer laríngeo de miR-196a tanto en las células cancerosas y estroma del cáncer. Por último, la inhibición de miR-196a contrarrestado proliferación de células cancerosas, tanto en las células cancerosas y derivados de xenoinjerto en ratones de laringe modelo.
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio proporciona las posibilidades de que el miR-196a podría ser muy útil en el diagnóstico y tratamiento del cáncer de laringe
Visto:. Saito K, K Inagaki, Kamimoto T, Ito y, Sugita T, Nakajo S, et al. (2013) microARN-196a es un biomarcador de diagnóstico putativo y blanco terapéutico para el cáncer de laringe. PLoS ONE 8 (8): e71480. doi: 10.1371 /journal.pone.0071480
Editor: Valerie W. Hu, The George Washington University, Estados Unidos de América
Recibido: 8 Febrero 2013; Aceptado: June 28, 2013; Publicado: 14 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Saito et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Una parte de este trabajo fue apoyado por una beca de Investigación de Tecnología Industrial de la Nueva Energía y Tecnología Industrial Development Organization (NEDO; http://www.nedo.go.jp/english/index.html). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito. Sin financiación externa adicional fue recibida para este estudio
Conflicto de intereses:. A pesar de que algunos de los autores son empleados de empresas comerciales (Y. Ito, T. Sugita, y S. Nakajo por SRL, Inc., T. Ishikura, H. Hanaoka, y T. Onozaki por Life Technologies Japón), que tienen intereses en competencia con respecto a este trabajo. Estos empleos no alteran la adherencia de los autores a todas las políticas de PLoS ONE sobre los datos y compartir materiales.
Introducción
En 2004, 28,260 nuevos casos de cáncer de cavidad oral y faringe y 20.260 nuevos casos del cáncer de laringe fueron diagnosticados en los Estados Unidos, lo que resulta en 7.230 y 3.830 muertes, respectivamente [1], [2]. A pesar de los importantes avances en la cirugía y la radioterapia en las últimas décadas, las tasas de supervivencia a 5 años de los pacientes con carcinoma de células escamosas del cuello (CECC) cabeza y se han mejorado sólo de forma moderada, en parte, debido a la relativamente alta tasa de recidiva local. En la actualidad, HNC locorregional se trata con una combinación de cirugía y radioterapia con o sin quimioterapia, mientras que cada opción de tratamiento da lugar a consecuencias devastadoras en el habla y la función de deglución. Además, los procedimientos quirúrgicos en la cabeza y el cuello y la región cavidad oral resultan comúnmente en deformidades cosméticas significativas. Incluso con el tratamiento combinado enfoques mencionados, los pacientes con HNC avanzada son, pues, en la necesidad de nuevos y menos invasivos tratamientos para su enfermedad de alta morbilidad. En este estudio, pensando en una considerable heterogeneidad de los tumores HNSCC, nos hemos centrado en una única localización anatómica, laringe bien definido. Mientras que el cáncer de laringe es altamente curable, ya sea mediante la eliminación quirúrgica o irradiación cuando se detecta y trata en una etapa temprana, el cáncer avanzado permanece mucho menos curable, lo que resulta en una mejora significativa de las tasas de supervivencia global a partir de 1975 [3]. De este modo, los biomarcadores altamente sensible para detectar el cáncer de laringe, incluso en la etapa inicial, sin síntomas clínicos, y nuevos agentes terapéuticos significativamente eficaces son necesarias para mejorar aún más los resultados de los pacientes de cáncer de laringe. Además, los enfoques actuales para predecir el resultado de los pacientes HNSCC incluye el examen usando parámetros clínico como el tumor primario, los ganglios linfáticos regionales, metástasis a distancia (TNM) - etapa, profundidad de la invasión, y el grado de diferenciación. Sin embargo, estos parámetros no reflejan con exactitud el pronóstico de los pacientes y los predictores y biomarcadores adicionales podrían ser útiles para el tratamiento del paciente. Por lo tanto, la biología molecular y celular es un prometedor campo de estudio que puede conducir al descubrimiento de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas novedosas.
microARN (miARN), que codifica un pequeño ARN no codificante de $ ~ $ 22 nucleótidos, se reconoce ahora como una gran familia de genes se expresa en plantas, animales, y virus, así como en las algas unicelulares [4]. La mayoría de los animales miRNAs son conservadas evolutivamente y se encuentra a menudo en racimos [5]. miRNAs primaria (pri-miRNAs) que forman estructuras de tallo-bucle son predominantemente transcritos por la ARN polimerasa II y se procesan sucesivamente por dos enzimas RNasa III-como, Drosha en el núcleo celular y Dicer en el citoplasma de la célula, para generar miRNAs maduros [6] , [7]. miRNAs regulan negativamente la expresión génica a nivel post-transcripcional por escisión y /o la represión de traducción de mRNA de sus objetivos a través de la interacción mediante el apareamiento de bases perfecto en el extremo 5 'de los genes miARN maduro, también denominada la región de semillas [8]. Los análisis de la bioinformática reciente informó que más del 60% de los genes codificantes de proteínas tiene potencial para emparejar y para ser controlado por miRNAs [9]. Otras investigaciones han demostrado que miRNAs juegan un papel extremadamente importante en casi todos los aspectos de la biología, incluyendo el metabolismo, la proliferación celular, la apoptosis, el desarrollo y la diferenciación [10], [11].
En los últimos años, ha habido una un interés considerable en la comprensión del papel de miRNAs en los procesos de enfermedad y su desregulación se cree para promover el comportamiento maligno de los tumores [12]. Los vínculos entre la expresión aberrante de miRNAs y la patogénesis de varios tipos de cáncer [12] - [14] están documentados
También se ha informado de que miRNAs podría ser un biomarcadores ideales para la detección del cáncer debido a que:. (I ) miARN expresión se desregula con frecuencia en el cáncer [15], [16], (ii) los patrones de expresión de miRNAs en el cáncer humano parecen ser específica de tejido [17], y (iii) miRNAs tienen inusualmente alta estabilidad incluso en fijado en formol tejidos [18]. Por otra parte, la reciente investigación extensa miARN también ha revelado que los miRNAs son prometedoras dianas terapéuticas en el cáncer como el de colon, de mama, gástrico y hepatocelular tumores malignos [19] - [26]
Todas estas cuestiones son importantes para proporcionar una comprensión más profunda. comprensión de las funciones de miRNAs en la patogénesis CECC y como posibles marcadores de pronóstico y diagnóstico, así como dianas terapéuticas en CECC. En este estudio, hemos perfilado de la expresión de 723 miRNAs humanos únicos en 3 cánceres de laringe, 2 homólogos laríngeos no cancerosas utilizando microarrays de oligonucleótidos con una estructura de horquilla incorporado en el extremo 5 'de la sonda [27] fabrican mediante un sintetizador de oligonucleótidos de chorro de tinta [28] (Agilent Humanos miARN V2, Agilent Technologies) y se identificaron varios miRNAs que podrían servir como posibles marcadores de la enfermedad de diagnóstico. Además, confirmó la expresión de miRNAs seleccionados mediante QRT-PCR (TaqMan ensayos de miARN, Applied Biosystems) en 5 contrapartes no cancerosas, 14 pólipos o nódulos, 12 displasias y 17 cánceres de laringe para proporcionar datos que sugieren que las alteraciones en los niveles de expresión de miRNAs tienen un diseño funcional consecuencia de cáncer de laringe.
In situ
hibridación (ISH) demostró aún más la notable expresión diferencial de miRNAs en la lesión de cáncer en comparación con el epitelio escamoso normal.
Se evaluó además el impacto de la inhibición de miR-196a
In
in vitro
y
en
in vivo
sobre el crecimiento de los CECC para evaluar el potencial de los genes miARN como una nueva diana terapéutica para el HNC.
materiales y Métodos
Ética Declaración
el protocolo de investigación de este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Escuela de la Universidad de Keio de Medicina y hospital general de Kousei Sano. Se tomaron todas las muestras de tejido para el propósito de la biopsia de diagnóstico o tratamientos de los pacientes que se sometieron a cirugía después de la aprobación del estudio por el comité de revisión institucional de la Escuela Universitaria de Medicina de Keio y Sano Hospital de Kousei general. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes
Los animales fueron atendidos y utiliza de acuerdo con los protocolos aprobados por el Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Keio Escuela de Medicina (Número de permiso para este estudio:. 10243- (0 )). Toda la cirugía se realizó bajo anestesia tribromoetanol, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento.
Pacientes y muestras
Una parte de la muestra se procesó para fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) procedimiento, seguido por análisis de rutina patológica, mientras que el tejido residual se saturó en el ARN
después
® (Ambion, Foster City, CA) y se almacenó a -80 ° C hasta su procesamiento. Todas las muestras FFPE fueron examinados por patólogos experimentados para confirmar los diagnósticos. Características de los pacientes y la estadificación patológica se resumen en la Tabla 1.
Reactivos
A menos que se indique lo contrario, los materiales químicos de rutina se obtienen ya sea de Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) o Wako ( Osaka, Japón). miR-196a inhibidor (HSA-miR-196a miRIDIAN horquilla inhibidor, IH-300529-06) y el inhibidor de control negativo (control, control miRIDIAN microARN inhibidor negativo no. 1, EN-001005-01) utilizado en este estudio se obtuvieron de Dharmacon (Lafayette, CO). miRIDIAN horquilla inhibidor fue diseñado para inhibir la función RISC de los genes miARN objetivo con su región de doble cadena [29]. Para
In situ
hibridación (ISH) de miR-196a, se utilizó la sonda nucleico bloqueado marcada con DIG-3'-ácido incorporado miARN (Sonda miRCURY LNA ™ microRNA detección, Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) en este estudio.
Extracción de ARN y análisis de microarrays de miRNA
ARN total incluyendo ARN de bajo peso molecular a partir de muestras de tejidos y líneas celulares de cáncer se aisló utilizando el kit de aislamiento mirVana ™ miARN (Ambion) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. La calidad de las muestras de ARN se evaluó utilizando un Agilent 2100 Bioanalyzer, y sólo las muestras que satisfacen los criterios de 28S /18S & gt; se utilizaron 1 y RNA Integrity Number (RIN) ≥ 7,5 para todos los análisis
Para. el análisis de microarrays, hemos utilizado el miARN humano microarray Kit V2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), que contiene 20-40 funciones de orientación de cada uno de 723 miRNAs humanos (Agilent design ID 019118) [30] como anotada en el Sanger miRBase, la liberación 10,1 [31]. El etiquetado y la hibridación de muestras de ARN total se realizaron según el protocolo del fabricante. El cien ng de ARN total fue utilizado como insumo en la reacción de marcaje, y toda la reacción se hibrida con cada conjunto durante 20 horas a 55 ° C. Los resultados fueron analizados utilizando Agilent GeneSpring GX7.3. controles normales y muestras de cáncer se compararon mediante la prueba t de Welch (p & lt; 0,05) y miRNAs expresados diferencialmente con al menos se considera un cambio de 2 veces en la expresión de ser potenciales biomarcadores. Todos los datos internos de análisis de microarrays de miRNAs fueron depositados en la Expresión Génica Omnibus (GEO) con un número de acceso de GSE47610.
TaqMan cuantitativa en tiempo real PCR Ensayo de miRNAs
La los niveles de expresión de cada uno de los genes miARN se confirmaron con TaqMan cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) usando cebadores específicos individuales y sondas de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Brevemente, 10 ng de ARN total se transcribió de forma inversa con cebadores de tallo-bucle-miARN específico (Applied Biosystems), y la PCR se ejecuta con el ADNc de ARN específico generado en solución de ensayo de PCR específico de gen TaqMan® miARN en tiempo real sobre una StepOnePlus sistema de PCR en tiempo real (Applied Biosystems). La reacción se realizó a 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s, y 60 ° C durante 60 s. Todas las muestras se midieron por triplicado, incluyendo no controles de plantilla. La normalización se realizó con el pequeño U6 ARN nuclear (RNU6B; Applied Biosystems), y la expresión relativa se calculó utilizando el método comparativo Ct (umbral ciclo). Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t pareada para comparar los niveles de expresión en pares coincidentes y prueba de Tukey-Kramer para comparar los niveles de expresión entre múltiples enfermedades y otros análisis se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney por parejas. El nivel de significación se fijó en p. & Lt; 0,05
Siguiente Generación de Secuenciación de miRNAs
análisis de secuenciación de nueva generación
se llevó a cabo mediante el uso de Applied Biosystems sistema ™ y sólidas del pequeño kit de ARN Expresión ™ según Sistema 3 Guía del usuario SóLIdAS ™ (Applied Biosystems). El porcentaje de pequeños ARN por masa total de ARN se calculó por Agilent 2100 Bioanalyzer. El pequeño contenido de ARN se enriqueció mediante fraccionamiento flashPAGE ™ (Ambion) si es necesario. Las especies pequeñas de ARN (10-40 nt) fueron entonces convertidos en bibliotecas de ADNc usando Kit pequeño SóLIdAS ™ RNA Expresión (Applied Biosystems), seguido de la limpieza y selección de tamaño por PAGE alrededor ~105-150 pb. la amplificación clonal en perlas con PCR en emulsión se realizó utilizando el kit ™ ePCR sólido. perlas preparadas fueron sometidas a control de calidad de ejecución y luego se secuenciaron en SóLIdAS ™ 3 Analizador. Total de 11,6 a 35900000 secuencia de lecturas se obtuvieron de cada biblioteca, y el análisis de aguas abajo se llevó a cabo mediante el uso de la tubería del sistema SóLIdAS ™ Herramienta de pequeños ARN Análisis Pipeline (corona RNA2MAP versión 0.50). Todas las lecturas fueron asignadas de forma secuencial contra (1) ARN ribosomal y ARN de transferencia, (2) las secuencias de referencia conocidos de miRNAs en Sanger miRBase Release 18, (3) Conjunto de referencia del genoma humano hg19 (genoma de referencia Consorcio GRCh37), así como el genoma mitocondrial humano ( NC_001807.4). La suma del número de corto lee que la asignada a cada región de interés se normalizó a la referencia asignada a corto-lee en cada muestra de la biblioteca, y se utiliza como expresión de los valores en bruto de la región correspondiente total. Conservación y repetir la información se obtuvo mediante el explorador de tablas de la Universidad de California en Santa Cruz. Las muestras analizadas incluyen 2 cánceres de laringe (T416, de 66 años de sexo masculino, T3N0; T506, 74 años de sexo masculino, T3N2c) como muestras de cáncer avanzado y 3 papilomas laríngeos (T421, 33 años de sexo masculino, aparición en el adulto; T484, 33 años de sexo masculino, del inicio del adulto; T502, 38 años masculino, adulto inicio) como muestras no cancerosas. Todos los datos internos de la secuenciación de próxima generación de miRNAs fueron depositados en el Archivo de secuencia de lectura DDBJ (SRA) con un número de acceso de PRJDB994.
In situ La hibridación
de miR-196a
El
la detección in situ
se llevó a cabo en secciones de parafina de 4 micras de serie incluyendo la mucosa normal y material de cáncer de laringe de un yo 74 paciente de sexo masculino que fueron sometidos a una laringectomía total para la eliminación completa del tumor T3 avanzada. Las secciones se desparafinaron y posteriormente digeridos con proteinasa K (10 mg /ml) durante 5 min a 37 ° C. Después de digestión con proteinasa K, las secciones fueron fijadas en paraformaldehído al 4%, y los portaobjetos se hibridan después con 4 pmol de Exiqon miRCURY LNA sonda de detección complementaria de miR-196a en tampón de hibridación (50% formamida, 5 x SSC, 0,1% de Tween, 9,2 ácido cítrico mM (pH 6), 50 mg /ml de heparina, y 500 mg /ml de ARN de levadura) durante la noche a 50 ° C. A y una sonda RNU6B revueltos (Exiqon) también se utilizaron como controles negativos y positivos, respectivamente. Entonces, después de la incubación con fragmentos de anti-DIG-AP Fab conjugado con fosfatasa alcalina diluido 1:50 en solución (Roche, Basilea, Suiza) durante 3 horas a temperatura ambiente de bloqueo, las sondas hibridadas se detectaron mediante la aplicación de nitroazul de tetrazolio cloruro /5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato sustrato de color (Roche) a los portaobjetos. Las láminas fueron counterstained con rojo rápido nuclear y se analizaron usando un microscopio Nikon Eclipse 55i.
líneas celulares Cultivo de células y transfección
Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (CECC), derivados de la lengua (HSC- 2, HSC-3, HSC-4), encía (SAS), la cavidad oral (Ca9-22), laringe (JHU-011) y de la faringe (FaDu), fueron mantenidas en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de calor -inactivated de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C en 5% de CO
2.
Para los ensayos de transfección, las células fueron transfectadas con cualquiera de inhibidor de miR-196a o el inhibidor de control negativo usando Lipofectamine ™ 2000 reactivo (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. El control negativo inhibidor se basa en C. elegans miARN y corresponde al Cel-miR-239b. El control ha sido analizado por BLAST contra todas las secuencias genómicas humanas, de ratón y rata y secuencias de genes miARN en la base de datos de secuencia miRBase. Esta molécula tiene diseño y modificaciones como inhibidores miRIDIAN microARN que son conocidos para apuntar mRNA idénticos. Cada experimento se realizó por triplicado e independientemente al menos 3 veces.
viabilidad celular y la citotoxicidad
p>
4 células /pocillo y se sembraron durante 24 horas. Entonces, se transfectaron las células como se describe anteriormente y la proliferación celular se determinó por recuento directo de células a los 0, 3 y 5 días después de la transfección. Brevemente, las células se tripsinizaron y se tiñeron con 0,4% de azul de tripano para medir el grado de muerte celular usando condesa ™ (Invitrogen). A la contratinción nuclear con Hoechst 33258 también se realizó para visualizar las células viables a los 3 días después de la transfección.
Además, la viabilidad celular y la citotoxicidad fueron evaluados por la actividad de la proteasa diferenciales utilizando MultiTox-Fluor Multiplex Ensayo de citotoxicidad (Promega, Fitchburg, WI) según las instrucciones del fabricante. Brevemente, las células se sembraron a una concentración de 5 x 10
3 células /pocillo en una placa de procedimientos y de transfección de 96 pocillos se llevaron a cabo 24 horas después de la siembra. A continuación, se midió la actividad la actividad de proteasa de células vivas y la proteasa de células muertas a los 3 días después de la transfección mediante la adición de glicil-fenilalanil-aminofluorocoumarin (GF-AFC) o bis-alanil-alanil-pnenylalanyl-rodamina 110 (bis-AAF-R110) como sustratos peptídicos, respectivamente. Las células se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C y se midió la fluorescencia resultante (fluorescencia de células vivas 400
Ex /505
Em; fluorescencia de células muertas 485
Ex /520
Em) para obtener las unidades de fluorescencia relativa (RFU).
Modelos de xenoinjertos cáncer de laringe
los experimentos se realizaron en 6 semanas de edad, macho BALB desnuda ratones /c nu /nu. Los animales fueron atendidos y utilizarse de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Keio (Tokio, Japón). Diez ratones se dividieron aleatoriamente en 2 grupos de 5 ratones. La eficacia del tratamiento en ambos tumores y sus metástasis en ganglios linfáticos locorregional se examinó en cada uno de los 2 grupos siguientes: Grupo 1, inhibidor de miR-196a; Grupo 2, el inhibidor de control negativo (control). Los ratones fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de 5-7 mg tribromoetanol. tumores de xenoinjertos ortotópico se establecieron alrededor del cuello a nivel de la laringe mediante inyección subcutánea de 5 x 10
6 JHU-011 células con una aguja de calibre 25. Después de una semana, se midieron los tumores en tres dimensiones utilizando calibradores, y luego se inyectaron o bien inhibidor de miR-196a o el control combinado con AteloGene ™ (KOKEN, Tokyo, Japón) (1 nmol /200 l) en los espacios subcutáneos alrededor de los tumores. Los tratamientos adicionales se realizaron en 13 y 19 días después de la inoculación de las células tumorales y medición periódica del tumor se realizó hasta 12 semanas después de la inyección. Los ratones fueron sacrificados y se recogieron las masas tumorales, luego se corta en 2 piezas. La mitad de cada tumor fue fijado en formalina al 10% tamponada neutra durante la noche, se deshidrataron con etanol paso a paso, y embebidos en parafina. la mitad restante del tumor estaba saturada de ARN
después
® (Ambion) y se almacenó a -80 ° C. Se cosecharon bilaterales ganglios linfáticos cervicales, se congelaron y embebidos en parafina. tinción de hematoxilina-eosina se realizó en muestras incluidas en parafina para análisis histológicos. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando la prueba t para comparar el efecto terapéutico del inhibidor de miR-196a contra el cáncer de laringe
en
in vitro
y
en
in vivo
. El nivel de significación se fijó en p. & Lt; 0,05
Resultados
Proyección de microarrays de genes miARN expresión alterada en cáncer de la laringe
Para identificar miRNAs disregulados en los cánceres de laringe, lo primero que examinó el perfiles de expresión de 723 miRNAs humanos maduros en los tejidos de la laringe (5 3 2 cánceres de laringe y homólogos de la laringe no cancerosas adyacentes) utilizando microarrays. Los resultados mostraron que 5 miRNAs (miR-130b-5p (designado anteriormente como miR-130b *), miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, y miR-801) o 2 miRNAs (miR-133b y miR-145) fueron significativamente regulada arriba o hacia abajo-regulada, respectivamente, en los cánceres de laringe (Figura 1A). Curiosamente, los niveles de expresión de dejar que sea 7-familia, miR-15, miR-16, miR-17-92 o clúster, se sabe están asociados con varios otros tipos de cáncer, obviamente no eran diferentes entre los tejidos de cáncer de laringe y otros tejidos no cancerosos (figura 1B).
los conjuntos de datos se comparan entre los cánceres y las contrapartes no cancerosas adyacentes, el trazado de la abundancia de una determinada miARN en un conjunto de datos en contra de su valor correspondiente en otro conjunto de datos tanto en una escala logarítmica. 723 miRNAs humanos se incluyeron en el microarray de Agilent. (A) Comparación entre los controles normales y muestras de cáncer demostró la regulación al alza de 5 miRNAs (miR-130b-5p, miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, y miR-801) y la descendente regulación de miRNAs (2 miR-133b y miR-145). (B) Los niveles de expresión de let-7 de la familia, el miR-15, miR-16, miR-17-92 o agrupación, conocida por estar involucrada en varios otros tipos de cáncer, no fueron significativamente diferentes entre los controles y los cánceres normales (
superior
panel de la derecha y los paneles
inferiores). Los niveles de expresión de 723 miRNAs humanos también se muestran (
superior izquierda del panel
).
cuantitativa en tiempo real PCR validación de los genes miARN expresión en cáncer de la laringe
A continuación, para confirmar y validar los resultados obtenidos en nuestro análisis de microarrays, se realizó un análisis cuantitativo de PCR en tiempo real (QRT-PCR) (TaqMan® microARN ensayos, Applied Biosystems) utilizando 5 pares de los cánceres de laringe primaria y sus tejidos no cancerosos emparejados. Aunque el análisis de microarrays reveló la sobre regulación de 5 miRNAs y baja regulación de miRNAs 2, miR-801 se considera ahora como un fragmento de ARN U11 spliceosomal y se retira del miRBase [31]. miR-145 también se excluyó de las más estudios, ya que se ha informado de que se frecuencia abajo-regulada en los cánceres en múltiples órganos, incluyendo el cáncer de próstata [32], cáncer de mama [33], cáncer de vejiga [34], cáncer de colon [35 ], [36], cáncer de ovario [37], cáncer de esófago [38], cáncer de pulmón [39], [40], cáncer de la nasofaringe [41], cáncer gástrico [42], así como neoplasias malignas de células B [43] y se considera que no es un biomarcador adecuado para el cáncer de laringe.
miR-455-5p en lugar de miR-455-3p se utilizó en estudios posteriores, porque miRNAs 3p y 5p se genera a partir de cualquiera de los lados de la misma precursora madre tener secuencias similares y informe reciente sugiere la posible participación de miR-455-5p en la progresión del cáncer [44]. Por lo tanto, el análisis de QRT-PCR se realizó en 4 miRNAs residuales (es decir, el miR-130b-5p, miR-196a, miR-455-5p, y miR-133b). Los niveles de expresión de estos miRNAs se compararon entre 5 tejidos de cáncer y sus tejidos no cancerosos adyacentes. Los resultados fueron consistentes con los obtenidos a partir de análisis de microarrays, especialmente cuando diferentes muestras fueron comparados en los mismos pacientes (Figuras 2A y B). Se observaron altos niveles de expresión de miR-130b-5p en tejidos de cáncer en comparación con los controles vecinos en 4 de 5 pares. Por otra parte, los niveles de expresión de miR-196a y miR-455-5p fueron significativamente mayores en los tejidos de cáncer en comparación con los controles vecinos (miR-196a, p = 0,0460; miR-455-5p, p = 0,0286) (Figura 2A), mientras nivel de expresión de miR-133b fue significativamente menor en las muestras de cáncer en comparación con los controles (p = 0,0274) (Figura 2B).
Las expresiones relativas de miRNAs asociados con el cáncer de laringe en 5 pares de muestras se midieron por QRT-TaqMan® El análisis por PCR y se muestra en la
izquierda paneles
. Los niveles de expresión de homólogos no cancerosas adyacentes (CN) en cada par se fijan para ser 1 en
paneles de la derecha Opiniones de visualización clara de la diferencia significativa en cada pliegue miARN. Los datos se expresan como valores medios con desviaciones estándar. (A) Sobre regulación de miRNAs (2 miR-196a y miR-455-5p) se confirmó en los cánceres cuando 5 tipos de cáncer se compararon con sus comunicaciones nacionales. *,
p Hotel & lt; 0,05. (B) miR-133b se había reducido regulado en los cánceres en los 5 pares emparejados. No se observaron diferencias estadísticamente significativas de los niveles de expresión de miR-196a, miR-455-5p, y miR-133b entre pares emparejados. *,
p
. & Lt; 0,05
Por lo tanto, de estos miRNAs 4, 3 miRNAs (es decir, el miR-196a, miR-455-5p y miR-133b) mostraron significativamente diferentes niveles de expresión en tejidos de cáncer en comparación con sus tejidos de control emparejados y la cuantificación adicional de miRNAs se realizó utilizando 48 muestras de laringe. Estas muestras incluyen 5 contrapartes no cancerosas, 14 lesiones benignas (pólipos, nódulos, polipoide, o hiperqueratosis), 12 displasias, y 17 cánceres de laringe. Cuando se estudiaron 48 muestras, el nivel de expresión de miR-455-5p fue significativamente mayor en los cánceres en comparación con sus homólogos no cancerosos y tejidos adyacentes de la laringe benignos (p = 0,0113). Además, el nivel de expresión de miR-196a fue claramente superior en tejidos de cáncer en comparación con otros tejidos no cancerosos (homólogos no cancerosos y tejidos adyacentes de la laringe benignos, p = 0,0003; displasias, p = 0,0040) (Figura 3A). Aunque miR-133b mostró significativamente más bajos niveles de expresión cuando las muestras de cáncer se compararon con los tejidos de la laringe no cancerosos emparejados (Figura 2B), el nivel de expresión de este miRNA no fue significativamente menor en las muestras de cáncer en comparación con otros tejidos no cancerosos (homólogos no cancerosos y tejidos laríngeos benignos, p = 0,8353; displasias, p = 0,2185) en el estudio el uso de múltiples muestras (Figura 3B)
(a) los niveles de expresión de miR-455-5p y miR-196a se midieron por TaqMan® QRT-PCR. utilizando 48 muestras de tejido. tejidos cancerosos adyacentes (contrapartes no cancerosas, CN) se muestran como patios abiertos. Importantes sobre regulación de miR-455-5p se observó en los cánceres en comparación con los CN y muestras benignas. Los niveles de expresión de miR-196a fueron significativamente mayores en los tejidos de cáncer en comparación con cualquiera de los CN y muestras benignas o muestras de displasia precancerosas. Las barras indican el valor medio de cada grupo. *,
p Hotel & lt; 0,05. También se examinaron los niveles de (B) la expresión de miR-133b en múltiples muestras. Aunque se observó relativamente menor expresión en los cánceres, las diferencias no fueron estadísticamente significativas cuando se compara con otros grupos. Las barras indican el valor medio de cada grupo. *,
p
. & Lt; 0,05
Por lo tanto, para explorar aún más la importancia de miR-196a como un biomarcador prometedor para el cáncer de laringe, QRT-PCR análisis de miR-196a era realizado en 84 muestras histológicamente verificados (15 contrapartes no cancerosas, enfermedades benignas 24, 18, 27 displasias los cánceres de laringe) y 7 líneas celulares CECC. El estudio mostró que se observó una tendencia creciente del nivel de expresión de miR-196a cuando las muestras de cáncer fueron comparados con sus homólogos no cancerosos, tejidos benignos, o displasias (Figura 4A). La expresión de miR-196a en los cánceres fue significativamente mayor que sus pares de muestras emparejadas (p = 0,005) y también fue evidente en la línea celular de cáncer de laringe células JHU-011 (datos no mostrados). Por otra parte, encontramos la expresión de miR-196a fue significativamente mayor en el cáncer avanzado de cáncer temprano (p = 0,0045; Figura 4B,
panel izquierdo
), y también en el cáncer temprano de displasia precancerosa (p = 0,0263; Figura 4B,
Panel derecho
). Junto con estos resultados, el miR-196a podría ser un marcador favorable para el cáncer de laringe.
(A) La importancia de miR-196a como un biomarcador prometedor para el cáncer de laringe fue confirmada por TaqMan® QRT-PCR utilizando el tejido 84 muestras. El ensayo también incluyó 7 líneas celulares CECC. homólogos no cancerosos (CN) se muestran como patios abiertos. Las barras indican el valor medio de cada grupo. (B) El nivel de expresión de miR-196a fue mayor en el cáncer avanzado (T3 y T4) en comparación con los cánceres tempranos (T1 y T2) (
panel izquierdo
). Por otra parte, se observó significativamente más alto nivel de expresión de miR-196a en las primeras muestras de cáncer de T1a comparación con las muestras de displasia precancerosas (
panel de la derecha
). Las barras indican el valor medio de cada grupo. *,
p
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diferencia cualitativa de isomiRs miR-196a revelado por secuenciación profunda
El reciente advenimiento de la tecnología de secuenciación profunda reveló que hay por lo general las variaciones en las secuencias de los genes miARN maduros como acuñaron el término "isomiR" [45]. Tales variaciones son causadas principalmente por un cambio de sitios de corte cuando madura miRNAs son procesados por Drosha y Dicer, sino que también se introducen mediante adiciones de nucleótidos terminales o la edición de ARN interno. Aunque significados fisiológicos para la diversidad de isomiR siendo difícil de alcanzar, las evidencias sugieren que la acumulación existen preferencias del desarrollo /específico de tejido en el espectro de isomiRs.
Por lo tanto, para explorar la posible heterogeneidad en los perfiles de expresión de miR-196a isomiRs entre el cáncer de laringe y de tejidos no cancerosos, análisis de secuenciación profunda de pequeños ARN se llevó a cabo mediante el uso de sólido sistema Applied Biosystems (Kamimoto T et al., manuscrito presentado). Hay dos genes distintos para miR-196a, es decir,
MIR-196a-1
en Chr17 y
MIR-196a-2
en chr12 y su transcritos miRNAs maduros comparten el mismo 'brazo 5 *,
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