cervical
Extracto
La baja regulación de microARN-196b (miR-196b) se ha informado, pero su contribución a la progresión del cáncer de cuello de útero que queda por investigar. En este estudio, hemos demostrado que la primera miR-196b baja regulación se asoció significativamente con una peor supervivencia libre de enfermedad (DFS) para pacientes con cáncer de cuello uterino tratados con quimio-radioterapia combinada. En segundo lugar, el uso de un enfoque tri-modal para la identificación de objetivos, se determinó que homeobox-B7 (HOXB7) fue un
de buena fe
objetivo de miR-196b, ya su vez, el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) fue una transcripción aguas abajo regulado por HOXB7. La reconstitución de la expresión de miR-196b por transfección transitoria resultó en el crecimiento celular reducida, clonogenicidad, la migración y la invasión
in vitro
, la reducción de la angiogénesis del tumor y el tumor, así como la proliferación de células
in vivo
. Concordantemente, siRNA desmontables de HOXB7 o VEGF phenocopied los efectos biológicos de miR-196b sobre-expresión. Nuestros resultados han demostrado que la vía VEGF HOXB7 miR-196b //juega un papel importante en la progresión del cáncer cervical; por lo tanto, la orientación de esta vía podría ser una estrategia terapéutica prometedora para el futuro manejo de esta enfermedad
Visto:. ¿Cómo C, Hui DBY, Alajez NM, Shi W, Boutros PC, Clarke BA, et al. (2013) microARN-196b Regula el Homeobox B7-vascular factor de crecimiento endotelial Eje en cáncer de cuello uterino. PLoS ONE 8 (7): e67846. doi: 10.1371 /journal.pone.0067846
Editor: Rolf Müller, Universidad Philipps, Alemania |
Recibido: 11 Enero, 2013; Aceptado: 21 de mayo de 2013; Publicado: 4 Julio 2013
Derechos de Autor © 2013 ¿Cómo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Instituto de Ontario para la Investigación del cáncer (número de concesión: 10NOV-399). Christine ¿Cómo es un compañero de entrenamiento CIHR estratégica en la excelencia en la investigación de la radiación por el Programa Siglo 21 (EIRR21), y con el apoyo del Fondo de Becas Lawrence, Ila y William Gifford. También se presta apoyo del Instituto de la familia de Campbell para la Investigación del Cáncer y el Ministerio de Salud y la planificación a largo plazo. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
a nivel mundial, el cáncer cervical es el tercer tumor maligno más frecuentemente diagnosticado y la cuarta causa de mortalidad por cáncer en las mujeres, con un estimado de 530.000 nuevos casos y 275.000 muertes cada año [1]. A pesar de que las tasas de incidencia y mortalidad por cáncer de cuello uterino han disminuido en los últimos treinta años en los Estados Unidos [2], la tasa de supervivencia a 5 años se ha mantenido por debajo del 40% de los pacientes diagnosticados con enfermedad en estadio III o IV [3]. Se requieren nuevos conocimientos para comprender mejor los mecanismos que contribuyen a la progresión de la enfermedad, con el fin de diseñar mejores terapias para los pacientes con cáncer de cuello uterino localmente avanzado
.
micro-ARN (miARN) son cortos ARN no codificantes, que regulan la expresión del gen post-transcriptionally [4], [5], y la expresión de los genes miARN aberrantes ha demostrado ser importante en muchos tumores malignos humanos [6]. objetivos de genes que contribuyen a la progresión del tumor se han descrito para varios miRNAs [7], [8], [9]; sin embargo, la función biológica de la mayoría de los miRNAs sigue siendo desconocido. Uno de los principales desafíos para identificar los genes miARN objetivo es la capacidad de miRNAs para enlazar con objetivos de mRNA complementariedad imperfecta; por lo tanto, una sola miARN puede regular potencialmente varios cientos o miles de genes [10]. Por desgracia, el actualmente disponible
in silico
miARN algoritmos de predicción de destino tienen alta de falsos descubrimiento y tasas de falsos negativos [11], [12]; ordenando con ello la validación experimental de los genes miARN objetivos.
El descenso de regulación de miR-196b en el cáncer de cuello uterino se ha informado anteriormente [13], pero su papel en la progresión tumoral en esta enfermedad no se ha investigado previamente. Aquí, se presenta la baja regulación de miR-196b en tejidos de cáncer de cuello uterino humanos primarios y líneas celulares. Por otra parte, hemos identificado el factor de transcripción HOXB7 como una novela, blanco directo y específico de miR-196b, que a su vez, regula el VEGF en el cáncer de cuello uterino. Lo más importante, el miR-196b baja regulación se asoció con peores DFS en los pacientes tratados con quimio-radiación, poniendo de relieve la importancia biológica de miR-196b en la progresión del cáncer de cuello uterino.
Materiales y Métodos
Declaración de ética
escrito el consentimiento informado se obtuvo de los pacientes, de acuerdo con un protocolo aprobado para este estudio por el Consejo de ética de Investigación Red de Salud de la Universidad. Los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta conformidad con el protocolo aprobado por el Comité de Cuidado de Animales (ACC) del Instituto de Cáncer de Ontario, la Red de Salud de la Universidad (Protocolo de Uso de Animales: 342.18).
Líneas celulares y transfecciones
líneas celulares de cáncer cervical humano (ME-180, SiHa, y HT-3) se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATTC), y se cultivaron en α-MEM suplementado con 10% FBS a 37 ° C, 5% CO
2. Todas las células se autentican cada seis meses en el Centro de Genómica Aplicada (Hospital para Niños Enfermos, Toronto, Canadá) usando el kit de AmpF /STR Identificador Amplificación por PCR (Applied Biosystems), y se determinó que están libres de
Mycoplasma
la contaminación utilizando el kit de detección de Mycoplasma MycoAlert (Lonza). células ME-180 y SiHa se transfectaron usando el 2000 (Invitrogen) protocolo de transfección LipofectAMINE hacia adelante, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Pre-MIR Control Negativo#1 (NC), pre-miR-196b (Ambion), todas las estrellas del control negativo (SINEG), siHOXB7 y siVEGF (Qiagen) fueron transfectadas todo a una concentración final de 30 nmol /L.
miARN perfiles de expresión de líneas celulares
el ARN total se aisló de SiHa, ME-180 y HT3 líneas celulares de cáncer de cuello uterino utilizando el kit de aislamiento mirVana miARN (Ambion) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. FirstChoice® ARN total: Cuello uterino humano normal de los tejidos (Ambion) a partir de 3 donantes de tejidos diferentes se utilizó como términos de comparación normales. Los niveles de expresión de 377 miRNAs y snoRNAs 3 (controles) se analizaron en las líneas celulares de cáncer de cuello uterino y tejidos normales del cuello uterino usando la densidad de matriz TaqMan Low (TLDA) Panel de microARN humano (Applied Biosystems), con el Applied Biosystems 7900HT PCR en tiempo real sistema, como hemos descrito anteriormente [14].
miARN perfiles de expresión de los tejidos del paciente
biopsias por punción flash-congeladas fueron obtenidas de pacientes con cáncer de cuello uterino localmente avanzado que estaban previstos para recibir tratamiento primario con quimio-radioterapia estándar, que consiste en la radioterapia de haz externo para el tumor primario de cuello de útero y de los ganglios linfáticos de la pelvis (45 a 50 Gy total de 1,8 a 2-Gy fracciones diarias con el 18-a-25-MV fotones), combinado con dosis semanales de cisplatino (40 mg /m
2 en total, 5 dosis). FIGO (Federación Internacional de Ginecología y Obstetricia) puesta en escena se determinó usando una combinación de: Evaluación pretratamiento con anestesia, la tomografía computarizada (TC) del abdomen y la pelvis, radiografía de tórax, y la resonancia magnética (RM) de la pelvis. La RM también se utilizó para determinar el estado de los ganglios linfáticos; ganglios linfáticos pélvicos y paraaórticos se clasificaron como positivos para la enfermedad metastásica si la dimensión MRI eje corto fue & gt; 1 cm y equívoca si era 8 a 10 mm. Después de la biopsia, las muestras se colocaron en la temperatura óptima de corte (OCT) medio de almacenamiento para el examen histopatológico, Flash-congelado en nitrógeno líquido. H & amp; secciones de tejidos teñidos-E fueron cortadas a partir del material incrustado-OCT y evaluadas por un patólogo ginecológica (B Clarke). contenido celular total (células del estroma y del tumor) se estimó para todas las muestras de tejido utilizando un microscopio de luz, y sólo las muestras que contienen & gt; se consideraron células tumorales 70% para su posterior análisis (n = 79). Las características clínicas de estos 79 pacientes se proporcionan en la Tabla 1. El tiempo medio de seguimiento de esta cohorte fue de 3 años. tejidos normales del cuello uterino al Flash congelada procedentes de 11 pacientes que se sometieron a histerectomía por causas benignas sirven como comparadores normales.
Dos secciones de espesor de 50 micras fueron cortadas de los tejidos embebidos en flash-congelados-OCT y se colocan en un microtubo libre de nucleasa. El ARN total fue aislado utilizando el Norgen total RNA Purification Kit (Norgen Biotek), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. miARN expresión global se midió en el cáncer de cuello uterino y de los tejidos normales del cuello uterino con el TaqMan Low Density Arrays (TLDA) microARN humano v2.0 Un Array (Applied Biosystems), utilizando el 7900HT Real-Time PCR System de Applied Biosystems, como ya se ha descrito [14 ].
cuantitativo en tiempo real PCR análisis de miRNAs y mRNAs
el ARN total fue aislado de las líneas celulares utilizando el kit de purificación de ARN total (Norgen Biotek), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La expresión de miR-196b se midió por reacción cuantitativa en cadena de polimerasa en tiempo real (qRT-PCR) usando el ensayo TaqMan MicroARN estándar (Applied Biosystems). Brevemente, el ARN fue primero a transcripción inversa utilizando el kit TaqMan MicroARN transcripción inversa (RT) y un cebador tallo-bucle específico para miR-196B (Applied Biosystems) [15]. El 2 Se utilizó el método
-ΔΔCt para calcular los niveles relativos de expresión de miR-196b, utilizando RNU44 como un gen de referencia [16]
.
Los productos de RT se amplificaron con los cebadores de miR-196b-específica, como ya hemos descrito anteriormente [14]. Los niveles de expresión de descrito previamente (c-myc, BCL2, Hoxa9, MEIS1), y mRNA objetivos candidato para miR-196b (ANKHD1, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140), y HOXB7 (VEGF, Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) también fueron medidos mediante qRT-PCR. Un microgramo de ARN total fue inverso-transcrito usando transcriptasa inversa Superscript II (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. RT-PCR cuantitativa se realizó utilizando SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) y cebadores de PCR (Tabla S1) diseñados utilizando Primer 3 de entrada. El 2 Se utilizó el método
-ΔΔCt para calcular los niveles relativos de la expresión génica, con GAPDH como gen de referencia [16].
La viabilidad celular, la proliferación y la formación de colonias ensayos
La viabilidad de las células transfectadas se evaluó mediante el ensayo de exclusión con azul de tripano. células ME-180 y SiHa se transfectaron por triplicado con 30 nmol /L de pre-miR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF, o SINEG y se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2. A las 48 y 72 horas después de la transfección, se tripsinizaron las células, se tiñeron con azul de tripano y se contaron usando un hemocitómetro. La proliferación celular se examinó utilizando el CellTiter 96 de la célula no radiactivos Ensayo de proliferación (MTS Assay) (Promega Biosciences), según las instrucciones del fabricante. Para los ensayos de formación de colonias, las células se transfectaron con 30 nmol /L de pre-miR-196b, Pre-MIR Control Negativo#1, siHOXB7, siVEGF, o SINEG y se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2. A las 48 horas después de la transfección, las células fueron re-sembraron a baja densidad en placas de 6 pocillos por triplicado. Las células se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 de 10 a 12 días, a continuación, fijaron y tiñeron con 0,1% de cristal violeta en metanol al 50%. Se contó el número de colonias que contienen al menos 50 células, y la fracción que sobrevive se calculó por comparación con las células transfectadas con el control negativo.
migración celular y la invasión ensayos
BD BioCoat Matrigel Invasión Chambers y control de Inserción (BD Biosciences) se utilizaron para la migración de ensayo y la invasión de las células transfectadas. Cámaras contenían una membrana de tereftalato de polietileno con 8 micras poros. células ME-180 y SiHa fueron transfectadas con 30 nmol /L de pre-miR-196b, NC, siHOXB7, siVEGF, o SINEG y se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2. A las 24 horas después de la transfección, 1,5 × 10
5 células fueron re-sembrados dentro de cada cámara con la que contiene medio bajo en suero (FBS al 1%). Las cámaras se colocan en una placa de 24 pocillos, con alta de suero (FBS 20%) medio en cada cámara inferior para servir como un quimioatrayente. Las células se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2 para 48 horas, a continuación, las membranas se lavaron, se tiñeron, y se monta en portaobjetos. Un microscopio de luz se utiliza para contar el número de migrar o células invasoras. la migración relativa se calculó por comparación con las células transfectadas con el control negativo. invasión porcentual se calcula como el número de células que invadieron a través del inserto de Matrigel, dividido por el número de células que migraron a través del inserto control.
Ciclo Celular Análisis
análisis del ciclo celular se realizó en las células ME-180 y SiHa después de la transfección con 30 nmol /l de pre-miR-196b o NC, para medir la fracción de células en el sub-G
1 fase del ciclo celular. Las células se recogieron y se lavaron dos veces en tampón FACS (PBS /0,5% BSA), se resuspendieron en 1 ml de tampón FACS, a continuación, fija en 1 ml de helado de etanol 70%. Después de 1 h de incubación en hielo, las células se lavaron de nuevo y se resuspendieron en 500 uL de tampón FACS que contiene 40 mg /ml de RNasa A (Sigma) y 50 mg /ml de yoduro de propidio, después se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se analizaron en el BD FACScalibur (Becton Dickinson), utilizando los canales de FL-2W FL-2A y. La citometría de flujo de datos se analizaron utilizando el software FlowJo 7,5 (Árbol de la estrella).
Los experimentos in vivo
de seis a 8 semanas de edad, inmunodeficiencia combinada severa (SCID) se utilizaron ratones hembra de xenoinjerto experimentos, de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado de Animales, Ontario Cancer Institute, University Health Network. Las células fueron transfectadas con pre-miR-196b o NC y se incubaron a 37 ° C, 5% de CO
2. A las 48 horas después de la transfección, se recogieron las células y se diluyeron 5 × 10
5 células viables en 100 l de medio de crecimiento. Las células se inyectaron por vía intramuscular en el músculo gemelo izquierdo de ratones SCID hembra. Tumor de diámetro, más la pierna se midió dos veces por semana y los ratones fueron sacrificados cuando se alcanzó 15 mm. Los tumores se retiraron a los 25 días después de la implantación e inmediatamente fijadas en 10% formalina tamponada durante 24 h, colocados en 70% de etanol durante 24 h, embebidos en parafina, y se seccionaron (5 M) para inmunotinción. Además de hematoxilina y eosina (H & amp; E) de la tinción, se utilizó grupo de diferenciación 31 (CD31) para evaluar la angiogénesis tumoral, Ki-67 para la proliferación de células tumorales, y desoxinucleotidil transferasa terminal mediada dUTP nick fin de etiquetado (TUNEL) para la apoptosis .
enfoque Tri-modal para identificar los genes miARN objetivo
Candidato mRNA objetivos de miR-196b se determinaron utilizando un enfoque tri-modal descrito previamente [8] la combinación de: i) todos los objetivos de predecir miR-196b, de cinco
in silico
bases de datos de predicción de genes miARN objetivo (TargetScan, PicTar, GenMir
++, miRBase, miRDB); ii) mRNAs regulados hasta al menos 2 veces en los tejidos de cáncer de cuello uterino en comparación con tejidos normales de cuello uterino, el uso de dos independientes microarrays de datos disponibles al público [17], [18]; y iii) mRNAs regulados hacia abajo al menos 0,5 veces en ambos 24 y 72 horas después de la transfección con 30 nmol /L de pre-miR-196b, en donde los niveles de transcripción se midieron usando el genoma completo humano 4 Matriz × 44 K One-Color (Agilent).
Luciferase reportero de ensayo
Wildtype o fragmentos mutantes de la región 3 'no traducida (UTR) de HOXB7 que contiene el sitio de unión predicho (posición 220 a 226) para miR-196b se amplificaron individualmente por AmpliTaq Gold ADN polimerasa (Applied Biosystems) usando los cebadores listados en la Tabla S1. Los productos de PCR fueron purificados, después se clonó aguas abajo de la luciérnaga
luciferasa
gen en el vector PMIR-INFORME (Ambion) en el
Spe
I y Hind
sitios de restricción
III , para producir el PMIR-HOXB7 o vector PMIR-HOXB7-mut. células ME-180 y SiHa fueron co-transfectadas con 100 nmol /L de pre-miR-196b o NC, y 100 ng del vector reportero de interés. Como control de referencia, 50 ng de vector de PRL-SV (Promega) que contiene el
Renilla luciferasa
gen también se transfectaron con cada condición. actividades de luciferasa de luciérnaga y renilla se midieron a las 24 horas después de la transfección usando el sistema de ensayo de luciferasa Dual-Glo (Promega) según las instrucciones del fabricante.
Immunoblotting
Las células fueron transfectadas ya sea con 100 nmol /L de pre-miR-196b o NC, y los extractos de proteínas totales fueron cosechadas en hielo después de 48 y 72 horas. Las proteínas de interés se probaron con conejo anti-HOXB7 (1:500 dilución; Invitrogen) o el ratón anti-GAPDH (1:10,000 dilución; Sigma), y se detectaron con IRDye fluorescentes anticuerpos secundarios (dilución 1:20,000, LI-COR). GAPDH se utilizó como control de carga. Las inmunotransferencias se escanean y se cuantificaron utilizando el sistema de imágenes de infrarrojos Odyssey (LI-COR).
Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA)
Las células fueron transfectadas con 30 nmol /L de siHOXB7 o SINEG, y el nivel de VEGF secretado se midió a las 48 y 72 horas después de la transfección, utilizando el humano VEGF DuoSet ELISA (R & amp; D Systems). de acuerdo con las instrucciones del fabricante
5-aza-2 'desoxicitidina Tratamiento
ME-180 y SiHa y se sembraron en placas de 24 pocillos y se incubaron durante la noche a 37 ° C, 5% de CO
2. Los medios que contienen 2 M 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-DCT) (Sigma-Aldrich) se añadió a las células, 1 y 3 días después de la siembra, respectivamente. Las células se recogieron 4 días después de la siembra y el ARN total fue aislado para el análisis de QRT-PCR de la expresión de miR-196b.
Análisis estadístico
Todos los experimentos se han realizado al menos tres veces independientes, y el los datos se presentan como la media ± error estándar de la media (SEM). la función de la prueba t de Student (no pareada, de dos colas) en Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA) se utilizó para comparar dos grupos de tratamiento. Los gráficos se representaron usando software GraphPad Prism (GraphPad software, San Diego, CA). El método de Kaplan-Meier se utilizó para el análisis univariado, y se utilizó la prueba de log-rank para examinar las asociaciones entre la expresión de miR-19b y DFS, donde la expresión se dicotomizó en el valor de la mediana. La relación entre el tamaño tumoral y la expresión de miR-196b se investigó mediante la correlación de Pearson. Las correlaciones entre la expresión de miR-196b, ya sea con FIGO etapa o estado ganglionar se analizaron mediante ANOVA de una vía.
Resultados
miR-196b fue significativamente las reguladas en la Primaria cáncer de cuello tejidos y líneas celulares y está fuertemente asociada con DFS
la expresión de miR-196b se redujo significativamente en casi 4 veces en 79 tejidos de cáncer cervical primaria en comparación con 11 tejidos normales del cuello uterino (
P Hotel & lt; 0,001; Fig. 1A). Es importante destacar que los pacientes con bajo que el nivel de expresión de miR-196b mediano en el momento del diagnóstico experimentaron peores DFS en comparación con aquellos con una mayor expresión de miR-196b (
P
= 0,02; razón de riesgo = 0,39; Fig. 1B). la expresión de miR-196b no se correlacionó significativamente con el tamaño del tumor (
P
= 0,12), el estadio de la FIGO (
P
= 0,14), o el estado ganglionar (
P = 0,60
). miARN expresión global de la elaboración de perfiles llevó a cabo en tres líneas celulares de cáncer de cuello uterino (ME-180, SiHa y HT-3) también confirmó la baja regulación de miR-196b en el cáncer de cuello uterino. A partir de los 55 miRNAs que fueron desregulados al menos 2 veces en todas las tres líneas celulares en comparación con los 3 tejidos del cuello uterino normales, miR-196b fue uno de los más significativamente baja regulado miRNAs (Fig. 1C), consistente con un perfil de expresión de los genes miARN publicado previamente estudio [13].
a) los niveles de expresión de miR-196b se midieron usando QRT-PCR en 79 muestras primarias de cáncer cervical, en comparación con 11 controles normales del tejido epitelial del cuello uterino. El análisis B) de Kaplan-Meier de la DFS en pacientes con cáncer de cuello uterino. Rojos, los pacientes con más alto que el nivel de expresión de miR-196b mediana (n = 39); azules, los pacientes con baja que la expresión de miR-196b mediana (n = 39); un paciente fue retirado del análisis de supervivencia debido a la falta de información de supervivencia. los niveles de C) basales de miR-196b en tres líneas celulares de cáncer de cuello uterino (SiHa, ME-180, y HT-3), en comparación con los tejidos epiteliales del cuello uterino normal, ensayados por qRT-PCR. ** P
. & Lt; 0,01
Para explorar si el miR-196b baja regulación epigenética se determinó, además de la pérdida cromosómica [19] las células, ME-180 y SiHa se trataron con el agente de desmetilación 5-aza-2 'desoxicitidina (5-aza-DCT). Este tratamiento sólo dio lugar a un aumento mínimo en la expresión de miR-196b, lo que indica que la metilación del promotor era poco probable que sea un mecanismo importante para miR-196b subexpresión (Fig. S1 A). Por otra parte, el examen de públicamente disponibles datos de microarrays de expresión génica en tejidos de cáncer de cuello uterino primarios no reveló alteraciones significativas en la expresión de Dicer, Drosha, DGCR8, Exportin-5, o cualquier subunidades de ARN polimerasa II, los cuales están involucrados en biogénesis de miARN y procesamiento (datos no mostrados).
miR-196b el exceso de expresión redujo significativamente la viabilidad celular, clonogenicidad, proliferación y la invasión
Para evaluar la importancia biológica de miR-196b baja regulación , las células fueron transfectadas con 30 nmol /L NC o pre-miR-196b. Sobre regulación de la expresión de miR-196b se mantuvo durante hasta 72 horas después de la transfección (Fig. S1B). La transfección con pre-miR-196b llevó a disminuyó significativamente la viabilidad celular en comparación con los controles en las 48 y 72 horas después de la transfección (ME-180:25% a las 48 h; 41% a las 72 h, SiHa: 29% a las 48 h; 54 % a 72 h) (Fig. 2A). Además, el miR-196b sobre la expresión dio lugar a reducciones significativas en clonogenicidad (ME-180:57% respecto al CN, SiHa: 64% en comparación con NC) (figura 2B.), La proliferación (ME-180:36% a las 48 h , el 35% a las 72 h, SiHa: 22% a las 48 h; 21% a las 72 h) (figura 2C), y la migración (32% respecto al CN), además de la invasión (32%
vs
.. 63% para NC) (Fig. 2D). Las células tratadas con pre-miR-196b demostraron una pequeña, pero no es estadísticamente significativo, aumento en el porcentaje de células en el sub G
1 población, acompañado por una pequeña disminución en el G
0-G
1 población (Fig. S1C).
se evaluaron) células a viabilidad relativa de ME-180 y SiHa a las 48 y 72 horas después de la transfección con pre-miR-196b (30 nmol /L), en comparación con control negativo pre-MIR (30 nmol /L), usando el ensayo de azul de tripano. células B) clonogenicidad de ME-180 y SiHa se evaluaron mediante transfección con 30 nmol /l de pre-MIR 196b o del Control Negativo pre-MIR. A las 48 horas después de la transfección, las células fueron cosechadas y luego se contaron y se re-sembraron a baja densidad en placas de 6 pocillos. Después de 10 días de incubación, las células se fijaron y se tiñeron y el número de colonias (& gt; 50 células) se contaron. células C) la proliferación relativa de ME-180 y SiHa se examinaron a 24, 48, y 72 horas después de la transfección con pre-miR-196b (30 nmol /L), en comparación con el control negativo pre-MIR (30 nmol /L) , usando el ensayo de MTS. D) Imágenes representativas (izquierda) e histogramas (derecha) que representa la capacidad migratoria (parte superior) y la invasividad (parte inferior) de ME-180 células que fueron transfectadas con 30 nmol /l de pre-MIR 196b o del Control Negativo pre-MIR, cosechado a 24 horas después de la transfección, a continuación, se contaron y se re-sembraron en las cámaras de invasión. La migración celular (parte superior), y la invasión (abajo), evaluada a las 48 horas después de la siembra en las cámaras transwell. Todos los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. Carolina del Norte, pre-MIR control negativo; *
P Hotel & lt; 0,05; **
P
. & Lt; 0,01
miR-196b sobre la expresión suprimida tumor angiogénesis tumoral y la proliferación celular in vivo
Las células transfectadas con pre-miR-196b no mostraron una diferencia estadísticamente significativa en el crecimiento del tumor en ratones, en comparación con las células tratadas con NC (Fig. S2). A los 25 días después de la implantación sin embargo, CD31 inmunotinción se observó, sin embargo, que ser reducido a 69% en tumores pre-miR-196b tratados en comparación con los tumores de control (Fig. S3, arriba). Además, esto se asoció con una reducción significativa aún modesto en Ki-67 expresión (46%
vs
. 53% para las células tratadas con NC) (Fig. S3, medio), y un menor, pero no estadísticamente aumento significativo en la tinción de TUNEL (Fig. S3, abajo). Por lo tanto, nuestros datos sugieren que la pre-miR-196b contribuyó a la proliferación de células tumorales y la angiogénesis reducida.
miR-196b se dirige directamente a HOXB7
La baja regulación de miR-196b en los tejidos de cáncer de cuello uterino y líneas celulares, y los efectos fenotípicos significativos de miR-196b sobreexpresión tanto
e in vitro
in vivo
, indicó que el miR-196b parece ser un mediador importante de la progresión del cáncer de cuello de útero . Por lo tanto, se utilizó una estrategia tri-modal [8] para identificar los posibles objetivos de mRNA que podrían explicar estos cambios fenotípicos (Fig. S4). Este método identificado 15 candidatos blancos superpuestos (ANKHD1, CALM3, CLK2, CTDSP2, FGFR1, HDAC, HOXA7, HOXB7, KRT8, PCCB, PUM2, SLC9A6, SMC3, SMG7, SR140). Para la validación de dianas, las células ME-180 se transfectaron con pre-miR-196b o NC, y los niveles de transcripción a las 24 horas después de la transfección se midieron con QRT-PCR para 12 objetivos candidatos (cebadores adecuados no podían ser diseñados para las otras 3 transcripciones ), además de 4 objetivos descritos anteriormente de miR-196b (c-myc, BCL2, Hoxa9, MEIS1). Ninguno de los objetivos descritos anteriormente se alteró significativamente después de miR-196b sobre-expresión (Fig S5A). Sólo 5 de los 12 candidatos blancos probados fueron significativamente las reguladas después de miR-196b sobre-expresión (Fig S5B.); HOXB7 fue seleccionado para su posterior evaluación funcional ya que era el candidato objetivo que demostró el mayor nivel de regulación a la baja (40% en comparación con los controles). Por otra parte, HOXB7 es un miembro de la
Hox
grupo de genes, una familia de genes que han sido reportados que están alteradas en diversos tumores malignos [20], y la familia de miR-196 se sabe que el objetivo de los mamíferos
Hox
genes [21].
Un ensayo de unión luciferasa confirmaron que el miR-196b directa y específicamente interactuó con la 3'-UTR de HOXB7. En comparación con las células control transfectadas con PMIR-INFORME, células transfectadas con PMIR-HOXB7 demostraron una reducción de la actividad de luciferasa (ME-180:68%, SiHa: 71%) cuando se co-transfectadas con pre-miR-196b (Fig 3A.). Este efecto inhibidor fue completamente abrogada con PMIR-HOXB7-mut, que contenía una mutación en el sitio de unión de miR-196b. Además, la transfección con pre-miR-196b como resultado una disminución significativa de la transcripción del ARNm HOXB7 (ME-180:49% a las 48 h, 62% a las 72 h; SiHa: 55% a las 48 h, 69%) a las 72 h (Fig . 3B), y la proteína (74% a las 48 h;. 80% a 72 h) (figura 3C) los niveles a las 48 y 72 horas después de la transfección. No parece haber un mayor factor de cambio en HOXB7 en el ARNm en comparación con la proteína, lo cual no es sorprendente, ya que los miRNAs interactuar directamente con las transcripciones de ARNm y proteínas no. Además, la traducción de proteínas puede verse afectada por una serie de mecanismos que tienen lugar aguas arriba, tales como la exportación nuclear de los transcritos de ARN y el reclutamiento de subunidades ribosomales.
A) actividad de luciferasa relativa de ME-180 o SiHa células a 24 horas después de la co-transfección con PMIR-REPORT, PMIR-HOXB7 o vectores mut PMIR-HOXB7-y pre-miR-196b o NC (30 nmol /L). B) los niveles de expresión de ARNm HOXB7 relativa en las células ME-180 o SiHa después de la transfección (48 y 72 horas) con pre-miR-196b o NC (30 nmol /L), medidos mediante qRT-PCR. Los niveles de expresión se normalizaron a la expresión de GAPDH. imagen de transferencia de Western representativa (parte superior) C), y la cuantificación relativa de los niveles de proteína HOXB7 (parte inferior) después de la transfección (48 y 72 horas) con pre-miR-196b o NC (30 nmol /L). Todos los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. OD, densidad óptica; Carolina del Norte, pre-MIR control negativo; *
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VEGF será un objetivo relevante de HOXB7
Desde HOXB7 es un factor de transcripción, era necesario determinar qué gen (s) regulado por HOXB7 podría ser relevante en este contexto para el cáncer de cuello uterino. Por lo tanto, las células fueron transfectadas con 30 nmol /L de siHOXB7 o SINEG, y niveles de ARNm de objetivos HOXB7 conocidos tales como Ku70, Ku80, DNA-PK, FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, thrombospoindin 2 (THBS2) y VEGF [22] , [23], [24], [25] se midieron a las 48 horas después de la transfección. VEGF demostró el mayor nivel de regulación a la baja (43%) después de HOXB7 desmontables (Fig. S6A). Concordantemente, la reducción significativa de VEGF mRNA (ME-180:63% a las 48 h, 33% a las 72 h; SiHa: 69% a las 48 h, 41% a 72 h) (Fig. 4A) y la proteína secretada (ME-180 :82% a las 48 h, 77% a las 72 h; SiHa: 84% a las 48 h, 75% a 72 h) (se observaron Fig 4B) niveles en ambos 48 y 72 horas después de la transfección con siHOXB7, lo que confirma que el VEGF. era en efecto un objetivo HOXB7 descendente de referencia en esta enfermedad. Además, otros objetivos conocidos pro-angiogénicos de HOXB7 (FGF2, MMP2, WNT5a, PDGFA, THBS2) no se alteró significativamente tras HOXB7 desmontables (Fig. S6A) o sobreexpresión de miR-196b (Fig. S6E), lo que sugiere que HOXB7 mediada por la angiogénesis
a través de
VEGF en este contexto.
a) la expresión del VEGF relativa en el ARNm después de la transfección de ME-180 o células SiHa con siHOXB7 o SINEG (30 nmol /L), tal como se determina mediante qRT -PCR. Los niveles de expresión se normalizaron a la expresión de GAPDH. B) Los niveles relativos de proteína VEGF secretada después de la transfección de las células ME-180 o SiHa con siHOXB7 o SINEG (30 nmol /L), según lo determinado por ELISA. Todos los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes. SINEG, Todos Estrellas control negativo; *
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Desmontables de HOXB7 o VEGF recapitulado los efectos biológicos observados después de miR-196b sobre la expresión
Para corroborar esta recién vía descrita de miR-196b de orientación HOXB7 que a su vez regula el VEGF, ME-180 y células SiHa fueron tratados con siHOXB7 o siVEGF para determinar si estas intervenciones podrían recapitular los efectos de miR-196b sobre-expresión. Caída de los niveles de transcripción y HOXB7 VEGF y proteínas se mantuvieron durante hasta 72 horas después de la transfección siRNA (Fig. S6B, S6C y S6D). Hemos observado que la viabilidad celular se redujo significativamente después de la transfección con cualquiera de siHOXB7 (ME-180:77% a 48 h, 66% a las 72 h; SiHa: 80% a las 48 h, 70% a 72 h). (Fig 5A, izquierda ) o siVEGF (ME-180:78% a 48 h, 60% a las 72 h; SiHa: 77% a las 48 h, 68% a 72 h) (Fig 5A, derecha), similar a los efectos observados después de la transfección con. pre-miR-196b (ME-180:25% a las 48 h, el 41% a las 72 h; SiHa: 29% a las 48 h, el 54% a las 72 h) (Fig. 2A). Clonogenicidad disminuyó significativamente después ya sea siHOXB7 (ME-180:69%; SiHa: 71%) (Figura 5B, izquierda.) O siVEGF (ME-180:78%; SiHa: 75%) (Fig. 5B, derecha) de la transfección, como ya se observó para la transfección de pre-miR-196b (ME-180:57% respecto al CN; SiHa: 64% respecto al CN) (figura 2B.).