Extracto
La resistencia a la quimioterapia basada en cisplatino es una de las principales causas de fracaso del tratamiento en el cáncer de vejiga avanzado (aC) pacientes. Cada vez hay más pruebas de que los microARNs están involucrados en el desarrollo y progresión de la Columbia Británica. Sin embargo, poco se sabe acerca de la función de los microARN para predecir el efecto de la quimioterapia adyuvante en la supervivencia aC y regulación de la respuesta al cisplatino. Para abordar esta cuestión, se empleó RT-qPCR para evaluar la significación clínica de miR-203 expresión en 108 tejidos de pacientes con CM que reciben quimioterapia adyuvante basada en cisplatino, y llevamos a cabo estudios in vitro para explorar la sensibilidad quimioterapéutico a cisplatino en el miR-203 que sobreexpresan BC Células. Se encontraron niveles de miR-203 fueron significativamente menores en el grupo BC progresión que el grupo no progresión (
P Hotel & lt; 0,001). Análisis de la curva ROC ilustra el miR-203 podría diferenciar significativamente a los pacientes progresaron de aquellos sin progresión (
P Hotel & lt; 0,001), obteniéndose un área bajo la curva ROC de 0,839 (IC del 95%, desde 0,756 hasta 0,903). Por otra parte, la baja expresión de miR-203 correlaciona con la supervivencia libre de progresión más corta (SLP) y la supervivencia global (SG) de los pacientes antes de Cristo, y fue un factor pronóstico independiente. La sobreexpresión de miR-203 en 5637 y las células T24 BC podría disminuir la viabilidad celular, aumentar la citotoxicidad cisplatino, y promover la apoptosis. Western Blot y ensayo indicador de luciferasa mostraron Bcl-w y survivina fueron abajo objetivos directos de miR-203. También hubo una asociación inversa significativa entre el miR-203 y Bcl-w o survivina expresión en tejidos BC (r = -0.781, -0.740, tanto
P Hotel & lt; 0,001). En conclusión, la disminución de miR-203 predice la progresión y el mal pronóstico para los pacientes tratados con BC quimioterapia basada en cisplatino, mientras que la sobreexpresión de miR-203 puede mejorar la sensibilización cisplatino mediante la promoción de la apoptosis a través de la orientación directa Bcl-w y survivina
Cita.: Zhang X, Zhang Y, Liu X, fang A, Li P, Li Z, et al. (2015) microARN-203 es un indicador pronóstico en el cáncer de vejiga y mejora la quimiosensibilidad a la apoptosis a través de cisplatino por orientación Bcl-w y survivina. PLoS ONE 10 (11): e0143441. doi: 10.1371 /journal.pone.0143441
Editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, Francia |
Recibido: 30 Julio, 2015; Aceptado: 4 de noviembre de 2015; Publicado: 23 Noviembre 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/) a CW (Nº 81271916) ; Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http://www.nsfc.gov.cn/) a XZ (Nº 81.301.506); Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Shandong (http://www.sdnsf.gov.cn/portal/) a XZ (ZR2013HQ063); . Y el programa de Doctorado de Educación Superior de China (http://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm) a XZ (Nº 20130131120067)
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
a nivel mundial, el cáncer de vejiga (BC) es la segunda neoplasia maligna más común del sistema urinario, con cerca de 386.300 nuevos casos y 150.200 muertes al año [1 ]. Debido a que la mayoría de los pacientes con CM localmente avanzados experimentan una recaída después de la cistectomía radical [2], la quimioterapia adyuvante se realiza habitualmente en un esfuerzo para retrasar la recurrencia y prolongar la supervivencia. En la actualidad, el cisplatino es uno de los fármacos de quimioterapia más importantes en régimen de combinación antes de Cristo, como MVAC (metotrexato, vinblastina, doxorrubicina y cisplatino) y GC (gemcitabina y cisplatino). Sin embargo, sólo el 50% de los pacientes con CM musculares invasivos han respondido a la quimioterapia basada en cisplatino [3]. Peor aún, algunos pacientes sólo sufren toxicidad sin lograr un beneficio quimioterapéutico. Por lo tanto, hay una necesidad urgente para predecir el efecto de la quimioterapia adyuvante en la supervivencia BC y comprender los mecanismos que previenen la respuesta a la quimioterapia.
Estudios recientes han encontrado resistencia al tratamiento con cisplatino podría estar mediada por microRNAs (miRNAs) [ ,,,0],4, 5]. miRNAs son una clase de ARN reguladoras no codificantes, compuesta por aproximadamente 22 nucleótidos que funcionan principalmente para regular a la baja los ARNm diana mediante la unión específica a su región 3 'no traducida (3'-UTR) y, posteriormente, la promoción de la degradación y /o inhibición de la traducción [6, 7]. Varias publicaciones han documentado miRNAs pueden actuar como supresores de tumores u oncogenes implicados en la formación de tumores, el mantenimiento y la metástasis, y son posibles biomarcadores para el diagnóstico del cáncer, el resultado terapéutico y el pronóstico [8-10]. Entre ellos, miR-203 por lo general actúa como un supresor de tumores, y es el regulado en múltiples tipos de tumores malignos humanos incluyendo aC [11]. Recientemente, miR-203 expresión se ha relacionado con el desarrollo de resistencia frente a la quimioterapia en muchos tipos de cáncer. Por ejemplo, los niveles de miR-203 se redujeron en células adquiridas de quimioterapia resistentes a los fármacos de cáncer de mama [12]. La sobreexpresión de miR-203 aumentó el efecto contra el cáncer de paclitaxel en células de cáncer de colon a través de la inhibición de la proliferación celular, la promoción de la apoptosis y muerte celular [13]. Por el contrario, Zhou et al [14] encontró que la expresión exógena de miR-203 resistencia inducida al oxaliplatino en células de cáncer colorrectal. Hasta ahora, se sabe poco sobre el papel potencial de miR-203 en la quimioterapia basada en cisplatino antes de Cristo y se necesita más investigación.
En este estudio, el miR-203 se examinó en los tejidos clínicamente resecado de BC tratados con se analizó la cistectomía radical y quimioterapia adyuvante basada en cisplatino, y la asociación entre el miR-203 y el pronóstico. Además, se investigaron los mecanismos subyacentes a la función de miR-203 en la quimio-resistencia de BC. Encontramos una baja expresión de miR-203 se correlaciona con la progresión y la pobre supervivencia de los pacientes que reciben quimioterapia adyuvante BC basada en cisplatino. Además, la restauración de la expresión de miR-203 podría aumentar la sensibilidad de cisplatino en las células BC a través de la promoción de la apoptosis de células por la orientación Bcl-w (también conocido como BCL2L2) y survivina (conocida también como BIRC5), que se indica miR-203 podría tener algún valor potencial en la predicción del pronóstico y de la aplicación terapéutica.
Materiales y Métodos
pacientes y muestras de tejidos
el estudio fue aprobado por el Comité de Ética del hospital de la Universidad de Shandong Qilu, y informado por escrito también se obtuvo el consentimiento de cada paciente. El estudio inicial incluyó un total de 149 pacientes con CM tratados con cistectomía radical y quimioterapia adyuvante basada en cisplatino en el Hospital Qilu, la Universidad de Shandong entre abril de 2007 y marzo de 2010. Todos los pacientes habían confirmado histológicamente localizada carcinoma de células transicionales, que tuvo como pT3a-4a /N + y M0 según la clasificación de la AJCC 2010 /TNM. se le dio el régimen de quimioterapia estándar (vehículo de motor, o GC) entre 3 y 10 semanas después de la resección completa, con un máximo de 6 ciclos a menos progresión o toxicidad inaceptable aparecieron. De ellos, 25 recibieron radioterapia, tratamiento con BCG o quimioterapia neoadyuvante, y 16 fueron excluidos debido a la resección incompleta. Los remanding 108 pacientes fueron seguidos con cistoscopia trimestral durante los 2 primeros años, y posteriormente cada seis meses a 5 años, y posteriormente cada año hasta enero de 2015. La progresión se definió como la recurrencia locorregional, metástasis a distancia o la muerte debido a BC. la supervivencia libre de progresión (SLP) se calculó a partir del momento de la cirugía a la fecha de la primera progresión y la supervivencia global (SG) se calculó a partir del momento de la cirugía a la fecha de la muerte. Los pacientes sin eventos anteriormente fueron censurados al finalizar el estudio. Todos los tejidos se congelaron rápidamente y se confirmó mediante análisis patológico, y se almacena a -80 ° C hasta la extracción de RNA.
Líneas celulares y cultivo
Las líneas celulares de BC humanos (5637 y T24) y la línea celular HEK 293T fueron adquiridos de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.), y se mantuvo en RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero bovino fetal al 10% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y se cultivaron a 37 ° C con un ambiente humidificado de 5% de CO
2 en el aire.
la transfección
Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) se utilizó para miR 203 /imita imita miARN transfecciones de control negativo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. miR-203 imita (Dharmacon, Lafayette, CO, EE.UU.) fueron oligonucleótidos de ARN de doble cadena diseñados para imitar endógena, Maduro miR-203. imita miARN control negativo (Dharmacon) estaba basado en cel-miR-67, secuencia madura: UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA, y tenía un diseño idéntico y modificaciones que miR-203 imita
La extracción de RNA y RT-qPCR
ARN total fue extraído a partir de tejidos, utilizando el método estándar de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante, y se mide mediante un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.). RT-qPCR se realizó en ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). La detección de miR-203 se llevó a cabo como se describe anteriormente [15]. Para Bcl-w y Survivin ARNm cuantificación, el ARN fue inverso-transcrito utilizando alta capacidad de cDNA transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE.UU.), a continuación, las 10 veces diluida cDNA se amplificó con Power SYBR Green PCR Master Mix ( Applied Biosystems). El nivel relativo de expresión de miR-203 y Bcl-w y survivina mRNAs se calcularon utilizando 2
-ΔΔCT método a través normalizado para hacer referencia a genes U6 snRNA y de ARNm de GAPDH, respectivamente.
viabilidad de las células de ensayo
la viabilidad celular se cuantificó usando el Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Diojindo Laboratories, Kumamoto, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células (5 × 10
3 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos en 24 horas por triplicado después de la transfección, y se incubaron con 0, 5, 10, 15, 20, 25 y 30 micras cisplatino en 100 l de medio de cultivo por otro 24h. A continuación, se añadió WST-8 sustrato a 37 ° C durante 2 h, y se leyó la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro.
La citometría de flujo para el ensayo de apoptosis
La citometría de flujo análisis de la apoptosis se analizó utilizando una Anexina V-FITC kit /PI tinción (BestBio, Shanghai, china) según las instrucciones del fabricante. Veinticuatro horas después de la transfección, las células (1 × 10
4 células /pocillo) fueron estimuladas con 5μM cisplatino durante 48 horas y después se recogió. Después de lavar 3 veces con PBS frío con, las células se resuspendieron en tampón seguido por tinción con Anexina V-FITC durante 15 min y PI durante 5 min en la oscuridad de unión. 1 × 10
4 se evaluaron las células en un citómetro de flujo FACS Calibur (BD, Bedford, MA, EE.UU.). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
TUNEL ensayo
Las células (1 × 10
4 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos en triplicado después de la transfección, y se incubaron con 5μM cisplatino en medio de cultivo durante 24 horas 100 pl. Las células se fijaron en 4% de paraformaldehído durante 30 min, después se neutralizó con 2 mg /ml de glicina durante 5 min, permeabilized en 0,1% de Triton X-100 durante 10 minutos, y finalmente marcaron con fluoresceína-12-dUTP utilizando desoxinucleotidil transferasa terminal. La fluorescencia verde localizada de células apoptóticas (fluoresceína-12-dUTP) se detectó mediante microscopía de fluorescencia.
Western Blot análisis
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron en hielo frío ensayo de inmunoprecipitación de radio tampón (RIPA) durante 30 min, y la concentración de proteína se cuantificó utilizando Bio-Rad reactivo de ensayo de proteínas (Bio-Rad, CA, EE.UU.). Treinta muestras de proteína g se cargaron y se separó en 10% de geles de SDS-poliacrilamida, y se transfirieron a membranas de fluoruro de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon primero con no grasa de leche descremada 5% durante 2 h, después se incubaron con anti-Bcl-w (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EE.UU.), anti-survivina (1: 1000; Abcam, Cambridge, Massachusetts, EE.UU.) o anticuerpo monoclonal de conejo anti-β-actina (1: 1000; Cell Signaling Technology) durante la noche a 4 ° C, seguido de incubación con anticuerpo secundario marcado con HRP (1: 5000; Cell Signaling Technology) durante 1 hora a temperatura ambiente. Por último, las bandas se visualizaron usando el kit de detección de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EE.UU.) en FluorChem Sistema E quimioluminiscente Western Blot Imaging (Cell Biosciences, Santa Clara, CA, EE.UU.).
ensayo indicador de luciferasa
El PMIR-INFORME
TM vectores (RiboBio, Guangzhou, china) se construyeron con el tipo salvaje (WT) o mutante (MUT) 3'-UTR de Bcl-w y survivina, y todas las secuencias eran insertado entre el hRluc y el gen hLuc. células HEK293T (1 × 10
4 células /pocillo) se sembraron en placas de 96 pocillos y co-transfectadas con miR-203 de control /negativo miARN y WT-survivina 3'-UTR vector /MUT survivina 3'-UTR vector o WT-Bcl-w 3'-UTR vector /MUT Bcl-w 3'-UTR vector usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se recogieron y analizaron mediante el sistema de doble ensayo de luciferasa (Promega, Madison, WI, EE.UU.). Cada ensayo se realizó por triplicado.
Análisis estadístico
La expresión de miR-203 en muestras de tejido se determinó como la distribución no normal utilizando la prueba de Kolmogorov-Smirnov. Por lo tanto, se utilizó la prueba de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis para evaluar la importancia de miR-203 diferencias entre los grupos. característico (ROC) curva de funcionamiento del receptor se realizó para evaluar el poder de discriminación de miR-203 para discriminar pacientes progresó desde aquellos sin progresión, y se estableció el valor de corte óptimo basado en el índice de Youden (sensibilidad especificidad +-1) [16]. Las curvas de supervivencia se construyeron por el método de Kaplan-Meier, y se compararon mediante la prueba de log-rank. modelo de Cox se utilizó para la identificación de factores independientes de la SLP y la SG. Se realizó la prueba t de Student para determinar la significación de los datos en el ensayo de viabilidad, el ensayo de apoptosis y el ensayo indicador de luciferasa. La relación entre el miR-203 y expresión del gen diana fue explorada por correlación de Spearman. Todos los análisis estadísticos se realizaron con SPSS Statistics 17.0 para Windows (IBM Corporation, Armonk, Nueva York, EE.UU.).
Resultados
Características de los pacientes
La edad media de los 108 aC pacientes que reciben quimioterapia adyuvante basada en cisplatino fue de 62 (42-81) años de rango, y el período medio de seguimiento fue de 51,5 (6-65) meses de rango. Durante el seguimiento, 45 pacientes mostraron progresión, de los cuales 32 casos tuvieron recurrencia locorregional, 11 casos mostraron metástasis a distancia, y finalmente murieron 39 con BC. Las características basales de los pacientes detalle se muestran en la Tabla 1.
reducción de la expresión de miR-203 se asoció con la progresión de la enfermedad
Los niveles de miR-203 se redujo significativamente en el grupo de progresión en comparación con grupo de no progresión (
P Hotel & lt; 0,001; figura 1A y archivo S1). Las curvas ROC análisis ilustrado miR-203 se obtuvo un área bajo la curva ROC valor (AUC) de 0,839 (IC del 95%, 0,756 a 0,903) para distinguir los pacientes con progresión de los que no progresión, que fue más preciso que adivinar (
P
& lt; 0,001; figura 1B). Sin embargo, no se encontraron asociaciones significativas entre los niveles de miR-203 y la edad, el género, grado, estadio T, el estado ganglionar, y los regímenes de quimioterapia (todos a
P Hotel & gt; 0,05; Tabla 2).
miR-203 niveles (a) fueron detectados por el método RT-qPCR y normalizado contra U6 ARN en 108 casos de cáncer de los tejidos de la vejiga. Los niveles de miR-203 en el grupo de progresión fueron significativamente más bajos que los del grupo no progresión (
P Hotel & lt; 0,001, Mann-Whitney U test). distinguidos pacientes (B) de la curva ROC con la progresión de los que no la progresión utilizando el miR-203, con un área bajo la curva ROC valor de 0,839 (IC del 95%, 0,756-0,903). (C, D) de Kaplan-Meier y las curvas de la SSP del sistema operativo basado en la expresión de miR-203 de pacientes con cáncer de vejiga. Se utilizó el óptimo valor de corte (0,345) calculado por el análisis ROC para clasificar a los pacientes como de alta y baja de miR-203 grupos de expresión. Bajo la expresión de miR-203 se correlacionó significativamente con la SLP acortada o el sistema operativo. (Ambos
P Hotel & lt; 0,001, prueba de log-rank)
miR-203 predice el pronóstico en pacientes con CM después de la quimioterapia
con base en el valor de corte óptimo (0,345) calculado por el análisis ROC para la progresión aC después de la quimioterapia, 79 pacientes cuyos niveles de miR-203 estaban por encima de 0.345 fueron clasificados como de alto grupo de la expresión de miR-203 , los 29 casos restantes se clasificaron como grupo de baja expresión de miR-203. curva de supervivencia de Kaplan-Meier mostró una baja expresión de miR-203 se correlacionó significativamente con la SLP y la SG más corta (dos a
P Restaurant & lt; 0,001; Figura 1C y 1D).
análisis de regresión de Cox univariante reveló asociaciones significativas entre el miR-203, estadio T, el estado ganglionar y la SSP (todo a
P Hotel & lt; 0,05; Tabla 3), así como el miR-203, el estadio T y OS (todos a
P
& lt; 0,05; Tabla 3). Al poner por encima de los factores importantes en el modelo de Cox multivariado, el miR-203, estadio T y el estado ganglionar demostraron tener valor pronóstico independiente de la SSP (todos a
P Hotel & lt; 0,05; Tabla 3), y miR-203, T etapa demostró valor pronóstico independiente para el sistema operativo (todos a
P Hotel & lt; 0,05; Tabla 3).
La sobreexpresión de miR-203 mejorado la sensibilización cisplatino en las células BC
para explorar el efecto de miR-203 en la quimiosensibilidad cisplatino en las células BC, curvas de concentración-dependiente para 5637 y las líneas celulares transfectadas con T24 BC miR-203 imita y control negativo se representaron. Como se muestra en la figura 2A, 24 horas después de la transfección, las miR-203 niveles de expresión en 5637 y las células T24 transfectadas con miR-203 imita fueron 5297 y 8089 veces más altas que las transfectadas con el control negativo (
P
& lt; 0,001). viabilidades celulares de miR-203 que sobreexpresan 5637 y las células T24 se redujeron drásticamente en comparación con las células transfectadas con el control negativo en un gradiente de concentración de 5, 10, 15, 20, 25 y 30 micras durante 24 horas (todo a
P
& lt; 0,05; figura 2B y 2C). Los valores máximos de la mitad de la concentración inhibitoria (IC50) de cisplatino para 5637 y T24 células fueron 11,1 (95% IC 9.7 a 12.5) micras y 14,3 (95% IC 12,7-16,1) mu M, respectivamente. La sobreexpresión de miR-203 redujo significativamente los valores de IC50 de 8,3 (IC 95% 6.9 a 9.6) M y 9,0 (95% CI 7.6 a 10.4) micras, respectivamente. Además, los efectos de miR-203 en gemcitabina y cisplatino combinación se muestran en la S2 de archivos.
(A) miR-203 niveles de expresión en 5637 y las células T24 transfectadas con miR-203 imita /control negativo. los niveles de miR-203 se incrementaron significativamente en las células transfectadas con el miR-203 imita en comparación con las células transfectadas con el control negativo (*
P Hotel & lt; 0,001, prueba de la t, n = 6). (B, C) Las curvas de concentración-dependiente para las líneas celulares 5637 y T24 transfectadas con el miR-203 imita y control negativo a las 24 h. viabilidades celulares de células miR-203 que sobreexpresan se redujeron drásticamente en comparación con células de control negativo a los 5, 10, 15, 20, 25 y 30 micras cisplatino (todo a
P
& lt; 0,05, prueba de la t). (D) La citometría de flujo análisis de la apoptosis a través de la doble tinción de las células con anexina V FITC y yoduro de propidio (PI). (E) análisis de cuantificación de la apoptosis se muestra en la figura 2B. La sobreexpresión de miR-203 aumentó significativamente la apoptosis en células T24 y 5637 líneas (*
P Hotel & lt; 0,01, prueba t, n = 6). ensayo (F) indica TUNEL 5637 y líneas de células T24 transfectadas con miR-203 imita mostró niveles elevados de división del ADN en comparación con el control normal (40 ×). Las células se tiñeron con DAPI y se sometieron a ensayo de TUNEL para detectar el ADN y las células apoptóticas.
A continuación, se realizó un análisis de citometría de flujo para cuantificar la apoptosis a través de la doble tinción de las células con anexina V FITC y yoduro de propidio ( PI). Los resultados demostraron la sobreexpresión de miR-203 apoptosis aumentada significativamente en ambas líneas celulares BC (ambos a
P
& lt; 0.05; Fig 2D y 2E). Para verificar que el aumento de la apoptosis se debió a la activación de la vía de la apoptosis antes mencionado, se midió la fragmentación del ADN mediante el ensayo de TUNEL y se confirmó que las células transfectadas con miR-203 mostraron niveles elevados de escisión de ADN (Fig 2F).
Bcl-w y survivina fueron abajo objetivos directos de miR-203
Bcl-w y survivina se predijeron como posibles blancos directos de miR-203 por dos grandes programas de predicción de destino, TargetScan 5.1 (http: //www.targetscan.org/) y Miranda (http://www.microrna.org/). Por otra parte, Bcl-w y survivina jugaron un papel importante en el desarrollo de C., y su regulación a la baja se asociaron con una mayor sensibilidad a la apoptosis inducida por cisplatino [17-20]. Los miR-203 sitios de segmentación predichos en las regiones 3'UTR de Bcl-w (también conocidos como BCL2L2) y survivina (conocida también como BIRC5) se muestran en la figura 3A. Un ensayo de luciferasa dual reportero se empleó para confirmar si el 3'UTR de Bcl-w y survivina mRNAs tenía sitios diana para miR-203. Se construyó un vector indicador de luciferasa que codifica la secuencia de tipo salvaje 3'-UTR del ARNm de Bcl-w o ARNm de survivina, incluyendo los miR-203 sitios diana previstos, y un correspondiente vector reportero mutante. Como se muestra en la figura 3B, miR-203 intensidad de luminiscencia, inhibió de WT-Bcl-w vector 3'-UTR y WT-survivina 3'-UTR vector (tanto
P
& lt; 0,01), mientras que la mutación de el sitio de unión bloqueó la disminución de la actividad de la luciferasa, lo que indica que había una interacción directa entre miR-203 y el 3'UTR de Bcl-w ARNm o ARNm de survivina.
(a) Ilustración de la predicho miR-203 focalización sitios en las regiones 3'UTR de Bcl-w y survivina. (B) Ensayo de actividad de luciferasa Dual-se llevó a cabo en las células HEK293T co-transfectadas con el control /miR-203 y vectores PMIR-INFORME con el tipo salvaje /mutante 3'-UTR de Bcl-w (arriba) y survivina (abajo). *
P
& lt; 0,01, prueba de la t, n = 6. (C) transferencias de Western que muestran la regulación por disminución de las proteínas Bcl-w y Survivin después de la transfección de miR-203 imita en 5637 y las líneas de células T24. β-actina se utilizó como control. (D) RT-qPCR que muestra la regulación por disminución de Bcl-w y survivina ARNm después de la transfección de miR-203 imita en 5637 y las líneas de células T24. *
P Hotel & lt; 0,01, prueba t, n = 6. análisis de correlación (E) de Spearman que muestra una asociación inversa significativa entre el miR-203 y ARNm de Bcl-w o expresión de survivina mARN en tejidos de cáncer de vejiga (r = -0.781, -0.740, tanto en el
P
. & lt; 0,001) guía empresas
Para confirmar aún más su relación en BC, transfectadas 5637 y T24 líneas celulares con miR-203 imita o control negativo, y se analizó la expresión de ARNm y de la proteína de Bcl-w o survivina mediante RT-qPCR y ensayos de transferencia de Western. Los resultados mostraron que las expresiones endógenos de Bcl-w y survivina se redujeron significativamente tanto en los niveles de proteína para miR-203 células BC transfectadas (figura 3C y 3D) mRNA y. En consonancia con esto, también hubo una asociación inversa significativa entre el miR-203 y Bcl-w o ARNm de survivina expresión en tejidos BC (r = -0.781, -0.740, tanto en el
P Hotel & lt; 0,001; Figura 3E ). En su conjunto, el miR-203 podría ejercer su función atacando directamente a Bcl-w y el gen de survivina en BC.
Discusión
postoperatoria quimioterapia basada en cisplatino ha sido ampliamente utilizado para el músculo BC invasivos o metastásicos , dando como resultado una respuesta en un máximo de 70% de los pacientes [21]. Desafortunadamente, debido a la quimiorresistencia de células de cáncer, la respuesta no es sostenida en más de 50% de los casos, lo que resulta en una tasa de supervivencia a los 5 años del 15% [22, 23]. Por lo tanto, es importante para entender mejor los factores que determinan respuesta a la quimioterapia y el pronóstico. Nordentoft et al [24] han encontrado 15 miRNAs en respuesta al tratamiento con cisplatino y 5 miRNAs asociados con el tiempo de supervivencia, de los cuales 3 miRNAs (miR-886-3p, miR-923, miR-944) fueron considerados como predictores de cisplatino respuesta y el pronóstico. Estudios previos han documentado disminución de la expresión de miR-203 se asoció con la progresión tumoral y mal pronóstico en algunos tipos de cáncer, tales como la cabeza humana y el cuello carcinoma de células escamosas [25], los gliomas [26], y el adenocarcinoma de esófago [27]. Consistente con los hallazgos descritos anteriormente, este estudio cuantificó el miR-203 niveles en una cohorte de pacientes con CM tratados con cistectomía radical y quimioterapia adyuvante basada en cisplatino, y se encontró miR-203 se redujo significativamente en los pacientes con enfermedad progresiva, aunque no asociado con otra características clinicopatológicas. Por otra parte, el análisis ROC mostró miR-203 tenía un poder de diagnóstico para discriminar pacientes con o sin progresión. Con base en el valor de corte óptimo de miR-203, clasificamos todos los pacientes en grupos de alto y bajo de expresión de miR-203. El análisis de Kaplan-Meier demostró grupo de baja expresión de miR-203 tenía la SLP y la SG pobres. Los análisis de regresión multivariante de Cox demostró que el miR-203 fue un factor pronóstico independiente de pacientes con CM. Por lo tanto, mi-203 podría ser utilizado para la predicción del pronóstico de pacientes con CM tratados con quimioterapia adyuvante a base de cisplatino.
resistencia celular a cisplatino a menudo presenta una naturaleza multifactorial, incluyendo la captación intracelular de los fármacos debilitado, el aumento de la reparación de daños en el ADN, y disminución de la ejecución del programa de apoptosis [28]. Drayton et al [29] encontró miR-27a contribuyó a la resistencia a cisplatino mediante la regulación de glutatión intracelular. Vinall et al [30] mostró co-tratamiento con miR-34a y cisplatino resultó en una inhibición dramático en la proliferación de células de cáncer en comparación con el tratamiento con cisplatino solo. Por el contrario, el cisplatino induce desmetilación del promotor de miR-34a y aumenta la expresión de miR-34a, sensibilizando además células BC a cisplatino [31]. En este estudio, se encontró que la transfección de células BC con miR-203 imita las células sensibles a la actividad citotóxica de cisplatino. Mientras tanto, los datos de los ensayos de apoptosis mostraron al añadir 5μM cisplatino, más apoptosis se encuentra en las células de cáncer de vejiga miR-203 que sobreexpresan, lo que sugiere que la inhibición de la BC células viabilidad podría estar relacionada al menos en parte, a la mayor susceptibilidad a la inducida por cisplatino apoptosis. Por lo tanto, el régimen de combinación de miR-203 imita y cisplatino podría mejorar los resultados del tratamiento del paciente antes de Cristo.
Para obtener una comprensión más precisa del papel de miR-203 en el desarrollo antes de Cristo, se analizaron sus posibles objetivos de abajo. Como miembro de la familia Bcl-2, Bcl-w puede promover la supervivencia celular mediante la inhibición de la vía intrínseca de la apoptosis [32]. Chen et al [33] encontraron Bcl-w se sobre-expresado en las muestras de BC en comparación con los tejidos normales adyacentes, lo que sugiere que jugaron un papel importante en la carcinogénesis de BC. Survivina, que era un miembro clave del inhibidor de la apoptosis de proteínas de la familia (IAP) [34], ejecuta su función antiapoptótica mediante el bloqueo de la actividad de las caspasas en un complejo con ligada al X inhibidor de la proteína de la apoptosis (XIAP) [35]. Un estudio multicéntrico encontró que la expresión de survivina se asoció con un riesgo elevado de recurrencia y AC-mortalidad específica por cáncer [36]. Nuestros datos demuestran que el miR-203 podría unirse directamente la 3'-UTR de Bcl-w y survivina, lo que resulta en la expresión regulada hacia abajo de Bcl-w y survivina a nivel post-transcripcional. Estos fueron apoyados por los datos clínicos en los que encontramos el miR-203 fue la expresión y una correlación negativa con Bcl-w y survivin expresión ARNm en tejidos BC muestras. Por lo tanto, el miR-203 podría ser considerado como un potencial agente terapéutico por la inhibición simultánea de factores anti-apoptóticas Bcl-w y Survivin.
En conclusión, nuestro estudio demuestra que la disminución de miR-203 se puede utilizar como un predictor de la progresión y el pronóstico de pacientes con CM tratado con quimioterapia basada en cisplatino. Por otra parte, la sobreexpresión de miR-203 puede mejorar la sensibilización cisplatino mediante la promoción de la apoptosis a través de la orientación directa Bcl-w y survivina. Se necesitan estudios adicionales para confirmar si multicéntricos miR-203 podría ser útil como un indicador de la quimiosensibilidad de los regímenes de quimioterapia basada en cisplatino, así como una diana terapéutica para BC en la clínica.
Apoyo a la Información
S1 Archivo . Los miR-203 niveles de expresión de los pacientes CVNMI, grupo Progresión con 45 casos y el grupo de no progresión con 67 casos
doi: 10.1371. /Journal.pone.0143441.s001 gratis (XLSX)
S2 Archivo. Los efectos de miR-203 en combinación con gemcitabina y cisplatino
doi: 10.1371. /Journal.pone.0143441.s002 gratis (DOCX)