Resumen
Los microARN son los ARN de cadena corta de nucleótidos endógenos que regulan la función génica mediante la unión directa del ARNm diana. En este estudio, hemos investigado los efectos de microARN-206 (miR-206) en el desarrollo de cáncer gástrico. miR-206 se confirmó primero en ser regulados a la baja en las muestras de cáncer gástrico. Por el contrario, la regulación positiva de c-Met fue confirmada en muestras de tejido de cáncer gástrico humano, con su nivel inversamente correlacionada con la expresión de miR-206. Introducción de miR-206 inhibe la proliferación celular mediante la inducción de G1 detención del ciclo celular, así como la migración y la invasión. Por otra parte, se confirmaron importantes moléculas de proliferación y /o migración relacionados tales como c-Met, CDK4, p-Rb, p-Akt y ERK-P para ser regulados a la baja por Western blot. La orientación de c-Met también afectó directamente a la proliferación de células AGS, la migración y la invasión.
In vivo
, miR-206 que expresan las células tumorales también se muestran retraso en el crecimiento en comparación con las células tumorales no afectados. Nuestros resultados demuestran que el miR-206 suprime la expresión de c-Met en el cáncer gástrico y podría funcionar como un potente supresor tumoral en tumores que sobreexpresan c-Met. La inhibición de la función de miR-206 podría contribuir a la proliferación celular aberrante y la migración, lo que lleva al desarrollo del cáncer gástrico
Visto:. Zheng Z, Yan D, Chen X, Huang H, Chen K, Li G, et al. (2015) microARN-206: La inhibición eficaz de la progresión del cáncer gástrico a través del Camino de c-Met. PLoS ONE 10 (7): e0128751. doi: 10.1371 /journal.pone.0128751
Editor: Hiromu Suzuki, Universidad Médica de Sapporo, Japón
Recibido: 4 Febrero 2015; Aceptado: 1 de mayo de 2015; Publicado: 17 Julio 2015
Derechos de Autor © 2015 Zheng et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este trabajo fue apoyado, en parte, por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China subvención 81100671 (DY), Fundación Provincial de Zhejiang Ciencias Naturales de China subvención Y2110609 ( DY), y Wenzhou Ciencia & amp; Tecnología Oficina de Grant Y20080096 (DY). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico es el cuarto cáncer más común y la segunda causa principal de muerte relacionada con el cáncer en el mundo [1]. Su morbilidad y la mortalidad es particularmente pronunciada en los países asiáticos debido a una variedad de influencias [1]. Desde su presentación es a menudo asociada con la enfermedad avanzada, existe una necesidad urgente de los avances en su detección y en última instancia su gestión. En la actualidad, la comprensión de los microARN (miARN) en influir en la formación del cáncer gástrico está ocurriendo a un ritmo rápido.
Desde la primera descripción de miARN en el nematodo
C
.
elegans
en 1993, el impacto de estos pequeños ARN no codificantes ha trascendido varias ramas de la biología molecular [2]. MiRNAs son altamente biomarcadores específicos de tejido con el potencial de alterar y transformar el tejido residente. Debido a que la sobreexpresión y subexpresión han sido asociados con la tumorigénesis [3], son a la vez bien establecidos sus papeles como oncogenes y genes supresores de tumores [4, 5]. Durante los últimos años, poco a poco se está dilucidado su impacto en el desarrollo y la detección de tumores de órganos sólidos, incluyendo cáncer gástrico. Ya hay varios miRNAs identificados en el mecanismo anti-apoptótica cáncer gástrico, como miR-21 y miR-148a [6, 7]. Otras vías influenciados por miRNAs incluyen la progresión del ciclo celular que comprende miR-222/221, miR-106b /93/25 y miR-24 [6, 7].
Uno de los otros nuevos miRNAs prometedores para órganos sólidos tumores incluye el miR-206 [8]. Este particular miARN pertenece a un grupo de "myomiRs" que está implicado en el desarrollo del músculo esquelético [9]. Después de haber sido asociado con otras numerosas enfermedades, incluyendo enfermedad cardíaca, enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la enfermedad de Alzheimer, su papel en la oncogénesis recibido un escrutinio más recientemente incluyendo rabdomiosarcoma, cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, schwannoma, y cáncer gástrico [8, 9]. Aunque elevados en algunos tipos de cáncer, incluyendo el de ovario y macroglobulinemia de Waldenstrom, miR-206 se suprime todo en tumores de órganos sólidos [9]. miR-206 ha sido previamente demostrado que inhibe la proliferación del cáncer gástrico en parte por la supresión de ciclina D2 [10]. En esta investigación, nos hemos centrado en el papel de miR-206 en la oncogénesis cáncer gástrico a través de la vía de c-Met, que ha sido tradicionalmente una vía de señalización influyente para la oncogénesis en una variedad de tumores [11]. c-Met se ha predicho y se demostró que el gen diana de múltiples miRNAs incluyendo el miR-206 [9, 12].
Resultados
Supresión de miR-206 conducido a un aumento de c-Met expresión en el cáncer gástrico
se realizó el análisis en tiempo real de RT-PCR para detectar la expresión de miR-206 en 40 muestras de cáncer gástrico y los tejidos normales. Se encontraron niveles de miR-206 en la mayoría de las muestras de tejido de tumor gástrico (34/40) a ser significativamente más bajos que los tejidos normales (Fig 1A). expresión de miR-206 estaba inversamente relacionada con el nivel de c-Met observado en muestras de tumor (Fig 1B). La mayoría de las muestras de tumor, con una disminución de la expresión de miR-206, mostraron alto porcentaje (& gt; 50%) de la tinción de c-Met. Por el contrario, los tumores con expresión normal de miR-206 mostraron la expresión de c-Met muy débil o negativo.
(A) en tiempo real RT-PCR análisis que muestra la expresión de miR-206 en los tejidos normales (fijado en 1 ) y la cantidad relativa de miR-206 en los tumores, como la reducción de pliegue. N: tejidos normales; T: tumores. U6 snRNA se utilizó como control interno. (B) la expresión de miR-206 en las células se correlaciona inversamente con c-Met. Se presentó la tinción inmunohistoquímica representativos de tres muestras de tumores gástricos y sus respectivos tejidos normales adyacentes. números de muestra 2, 6 y 23 son idénticos a los de Real-time RT-PCR. Las células tumorales con & gt; 50% de tinción positiva se considera que tienen una fuerte expresión de c-Met.
miR-206 inducida G1 detención y inhibe la proliferación celular, la migración y la invasión de células de cáncer gástrico AGS
A medida que el miR -206 expresión se redujo en los especímenes de cáncer gástrico, hemos tratado de determinar si la introducción de miR-206 tuvo ningún efecto biológico sobre las células AGS. células AGS transfectadas con la molécula de miR-206 mostraron una inhibición del crecimiento celular en comparación con el control negativo basado en el ensayo de MTS (Fig 2A). análisis FACS de las células mostró detención del ciclo celular G1 (S1 Fig). El número de colonias también se redujo con la transfección de miR-206 (S2 Fig).
(A) ensayo de proliferación celular MTS se llevó a cabo en el día 3 como se indica. (B) células AGS se evaluaron con ensayos Transwell y Matrigel. El número de células que habían migrado a través de los poros de cultivo de inserción (izquierda) o había invadido través de los poros de inserción Matrigel (derecha) se cuantificó contando cinco campos visuales independientes. *: Las diferencias en la migración celular o invasión entre miR-206 y las células transfectadas de control negativo fueron significativas,
P Hotel & lt; 0.01.
miR-206 puede inhibir la migración y la invasión de las células AGS (Figura 2B y S3 FIG). Se observó una reducción dramática de la migración hacia las cámaras inferiores de miR-206 células AGS transfectadas (86 ± 15 frente a 165 ± 16 en células AGS,
P Hotel & lt; 0,01, n = 3). Además, las células transfectadas con miR-206 mostraron que la invasividad inducida por HGF también se vio obstaculizado significativamente después de miR-206 de transfección (57 ± 12 frente a 116 ± 14 en las células AGS,
P
& lt; 0,01, n = 3).
miR-206 downregulated la expresión de c-Met y las proteínas relacionadas con el ciclo otra célula
Hemos identificado previamente c-Met como objetivo directo de miR-206 [9]. El análisis de transferencia Western confirmó que la expresión de c-Met se redujo en miR-206 de la transfección en células AGS (Fig 3). Al mismo tiempo, ectópico miR-206 también se ha reducido regulado la expresión de CDK4, p-Rb, p-Akt y ERK-P.
miR-206 también regula a la baja la expresión de p-Akt y p-ERK1 /2, pero no Akt total o ERK1 /2.
regulación a la baja de c-Met inhibe la proliferación de células de cáncer gástrico, la migración y la invasión
a continuación, c-Met siRNA se utilizó primero para disminuir la expresión de c-Met en células AGS (S4 Fig). Se llevaron a cabo ensayos de MTS para detectar la proliferación de células. células AGS transfectadas con c-Met siRNA demostraron una reducción de crecimiento de las células en comparación con células de control negativo (Fig 4A; 25,10 ± 3,81% de disminución). Tanto la migración inducida por HGF y la invasión se redujeron cuando se comparan c-Met siRNA células transfectadas con las células control transfectadas negativos. Como se indica en la figura 4B y S5 Fig, disminución de la migración (88 ± 10 frente a 155 ± 15, P & lt; 0,01, n = 3) y la invasión (72 ± 7 vs 126 ± 12, P & lt; 0,01, n = 3) ambos eran estadísticamente significativas.
(a) ensayo de proliferación celular MTS se llevó a cabo en el día 3 después de la transfección. (B) El impacto de c-Met siRNA en células AGS se cuantificó mediante cultivo o insertos de Matrigel.
El crecimiento del tumor
Introducción de miR-206 suprime
in vivo
a continuación se investigó si la sobreexpresión de miR-206 pudo reprimir el crecimiento del tumor
in vivo
. Después de 8 semanas, los volúmenes de los tumores promediados fueron significativamente más bajos de células infectadas con lentivirus que expresan miR-206, en comparación con el control (Fig 5).
(A) fotografías representativas de ratones desnudos de 8 semanas después de la inoculación. (B) El volumen medio de los tumores fue estadísticamente significativa. * N = 5 cada uno,
P Hotel & lt; 0.01.
Discusión
El cáncer gástrico se ha mantenido una significativa carga de cuidado de la salud en todo el mundo a pesar de años de investigación [1]. Según la OMS, el cáncer gástrico sigue siendo una de las principales causas de cáncer con una alta tasa de mortalidad [1]. Al igual que con otros tumores de órganos sólidos, cada vez es más claro que es necesaria una mejor comprensión de la oncogénesis del tumor para mejorar el pronóstico de estos pacientes. Siendo prevalente en los países asiáticos, los datos están surgiendo sobre el papel de miRNAs en el desarrollo o la supresión de los cánceres gástricos [6].
miRNAs han funciones duales en términos de desarrollo de cáncer gástrico [6, 13]. Algunos miRNAs son los supresores de tumores y otros son oncomiRs [6]. Ueda et al. encontrado 22 miRNAs upregulated y 13 downregulated en el plasma de pacientes con cáncer gástrico [13]. Los objetivos que están bajo investigación en el caso de cáncer gástrico incluyen reguladores de p16, a través de miR-24, y p21 a través de miR-222/221 y miR-106b /93/25 [6]. Otros, como el miR-21, pueden ser regulados por incremento en hasta el 92% de las muestras de tejido de cáncer gástrico [14]. Los candidatos identificados en el cáncer gástrico servir como supresores tumorales incluyen el miR-181b, miR-101 y miR-486 [6]. Por ejemplo, se cree que miR-101 para apuntar EZH2, la COX-2, MCL-1 y Fos [15]. miR-486 se cree que afecta OLFM4, afectando posiblemente la apoptosis aguas abajo [16].
Una vez establecido que la mayoría de los miRNAs servir como supresores de tumores, se investigó la vía c-Met en el cáncer gástrico. En el estudio de la vía c-Met para rhadbomyosarcoma, encontramos la importancia de esta vía en el sarcoma [9]. c-Met se sabe que está mal regulada en el cáncer gástrico [11, 17-19]. El MET proto-oncogén codifica una proteína conocida como receptor del factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), que posee actividad tirosina quinasa [18]. Normalmente nos encontramos con que expresa sólo en células madre, pero también han visto su desregulación en la oncogénesis [18]. En este estudio, hemos sido capaces de confirmar que el c-Met está involucrado de manera significativa en el cáncer gástrico y su papel como un objetivo de miR-206 es fundamental en la oncogénesis.
la progresión del ciclo celular se desregula en el cáncer gástrico. Sobre la base de los informes anteriores, ciclina D2 es elevada en el cáncer gástrico cuando miR-206 se ve afectada [10]. miR-206 se ha demostrado que es un marcador pronóstico potente [10]. Su regulación a la baja se asocia con menor supervivencia global. Restauración de miR-206 conduce a la detención del ciclo celular G0 /G1, confirmando su papel como un supresor de tumores. Nuestro trabajo también mostró la desregulación del ciclo celular con CDK4 y fosforilada-Rb se vea afectado. CDK4 es un miembro de la familia quinasa dependiente de ciclina con la actividad de Ser /Thr proteína cinasa. Conduce a la progresión de la fase G1. Además, la quinasa conduce a la fosforilación de Rb, que es un supresor de tumores implicados en la progresión del ciclo celular.
Aunque los resultados similares se han confirmado en gástrico, cánceres de ovario y de mama, el papel de miR-206 parece tener un efecto opuesto en el cáncer de colon [6, 20]. Una correlación inversa se observó entre el miR-206 y KLF4 en un panel de cánceres de colon humano [20]. KLF4, que tiene propiedades oncogénicas en otros tipos de cáncer como el de mama, piel y pulmón, funciona como un supresor de tumores en el cáncer de colon [20]. Su promotor es hiper-metilado con niveles elevados de miR-206 que conduce a la regulación negativa de KLF4 [20]. Estos hallazgos indican que el miR-206 no puede funcionar de manera similar en todas las células epiteliales, que niega el enfoque único en quimioterapéuticos.
En el presente estudio, hemos identificado un mecanismo para la regulación de la expresión génica de c-Met a través de miR-206 en el cáncer gástrico. c-Met sobreexpresión siguiente miR-206 downregulation parece ser la etiología común de la patogénesis del cáncer gástrico en la mayoría de las muestras examinadas en este estudio. En resumen, hemos demostrado que el miR-206 modula negativamente la vía de señalización de c-Met implicado en la proliferación celular y la migración. Nuestros estudios de esperar que tener importantes consecuencias clínicas en el tratamiento del cáncer gástrico. miR-206 es un candidato tanto para la detección inmunohistoquímica de tumores pequeños y una posible diana para terapias biológicas.
Materiales y Métodos
Cultivo de células
La línea celular de cáncer gástrico humano, AGS, adquiridos de ATCC (Manassas, VA), se cultivó en F-12 de Ham Medio (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con suero bovino fetal 10%. (FBS; Hyclone, Logan, UT)
Ética declaración
Este estudio se llevó a cabo en estricta conformidad con las recomendaciones y la aprobación del Comité de Cuidado y uso de Animales de la Universidad de Medicina de Wenzhou (Número de Permiso: WZMCOPT-043011). Cuarenta muestras de tumor gástrico y los tejidos gástricos de donantes normales se obtuvieron de la segunda hospital afiliado de la Universidad Médica Wenzhou (Wenzhou, China). La recogida de muestras fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Wenzhou en la investigación en seres humanos, y el consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada caso. Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Declaración de Helsinki y las leyes nacionales.
RT-PCR cuantitativa
ARN total fue extraído de muestras de tumor gástrico humano y controles normales con el reactivo Trizol (Invitrogen). 10 ng de ARN total se utilizaron para la síntesis de ADNc por el microARN TaqMan transcripción reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA), y el nivel de expresión de miR-206 se cuantificó por el microARN ensayo TaqMan (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR se realizó usando el sistema de PCR en tiempo real de Applied Biosystems ViiA 7 (Applied Biosystems).
tinción inmunohistoquímica de c-Met
Las secciones de parafina embebido en fijado en formol las muestras de tumor gástrico humano (5 micras) y se hicieron entonces con parafina dE con xileno y etanol. Los portaobjetos se trataron con peróxido de hidrógeno 0,3% y después se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpo de c-Met en 1: 300 dilución (CST, Beverly, MA). La tinción inmunohistoquímica se realizó utilizando el sistema de detección de HRP EnVision /DAB (Dako, Glostrup, Dinamarca).
La proliferación celular ensayo
células AGS se sembraron a 2000 células por pocillo en placas de 96 pocillos ( Costar, High Wycombe, Reino Unido) para cada transfección. Las transfecciones se realizaron con el reactivo (Lipofectamine RNAiMAX; Invitrogen), por triplicado. Para cada pocillo, se emplearon 50 nm miR-206 imita molécula (Ambion, Austin, TX), o una transfección control negativo (Ambion). Después de 72 horas de cultivo, la proliferación celular se evaluó mediante el ensayo de MTS (CellTiter 96 acuoso; Promega, Madison, WI).
ensayos de migración Transwell
24 horas después de la transfección, las células fueron cosechadas por AGS tripsinización y se lavó una vez con solución de D-Hanks (Invitrogen). Para medir la migración de células o invasión, la cultura tamaño de poro de 8 micras o insertos de Matrigel (Transwell; Costar) se colocaron en los pocillos de placas de cultivo de 24 pocillos. En la cámara baja, 400 l F-12 que contiene 10% de SFB y se añadieron 20 ng /ml de HGF. Después, se añadieron 5x10
4 células a la cámara superior. Después de 20 horas de incubación, las células que habían migrado a través de los poros se tiñeron con violeta cristal y se observaron bajo el microscopio (Zeiss, Oberkochen, Alemania) usando un objetivo de 20X.
análisis de transferencia de Western
células AGS (1x10
5) fueron sembradas en placas de 6 pocillos y se cultivaron en F-12 durante 24 horas antes de la transfección. 72 horas después de la transfección, las células se lavaron con PBS frío y se sometieron a un tampón de lisis (35 mM Tris-Cl [pH 6,8], 20 g /L de sodio dodecil sulfato de [SDS], ditiotreitol 100 mM). lisados de proteínas (20 mg cada uno) se separaron usando electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida al 8%, entonces electro-transferido a membranas de filtro de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con un tampón que contenía 5% de leche sin grasa en PBS con 0,05% de Tween-20 durante 2 horas y se incubaron durante la noche con anticuerpo a 4 ° C. Después de un segundo lavado con PBS que contenía 0,05% de Tween-20, las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Millipore, Darmstadt, Alemania) y se revelaron con un kit de detección de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL). GAPDH se utilizó como control de carga. Los anticuerpos para CDK4, p-Rb, ERK, Akt, p-ERK, p-Akt, c-Met y GAPDH eran de Señalización Celular Tecnología (Beverly, MA).
ensayos SiRNA
c-Met-siRNA (Ambion) y control negativo siRNA (Ambion) se utilizaron para regular a la baja la expresión de c-Met en células AGS. 50 nM de c-Met-siRNA o control negativo siRNA se transfectó en células AGS con Lipofectamine RNAiMAX. ensayo de MTS se llevó a cabo 72 horas después de la transfección, mientras que los ensayos Transwell y Matrigel se llevaron a cabo 24 horas después de la transfección, como se describe anteriormente.
In vivo
el crecimiento del tumor ensayo
La la expresión de pre-microARN construye Lenti-miR-206 y Pcdh-CMV-MCS-EF1-copGFP control de vectores se adquirieron de Sistema Biosciences (Mountain View, CA). células AGS fueron infectadas con lentivirus que expresan el miR-206 o el control negativo. ratones desnudos hembra, 6 semanas de edad, se inocularon con células AGS (8x10
6) que expresa miR-206 o controles negativos en sus flancos, y luego sacrificados después de 8 semanas. El tamaño del tumor se midió y el volumen se calculó utilizando la fórmula: (
L
x
W
2) x 0,5, (
L
, longitud;
W
, anchura), de acuerdo con el método se informó anteriormente [21]. Todos los estudios y los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo de la Universidad de Medicina de Wenzhou.
El análisis estadístico
Todos los datos se muestran como la media ± SEM. Los resultados mostrados se expresan como el valor medio ± SEM de los resultados obtenidos a partir de triplicados en un experimento. Los resultados representan los obtenidos en tres experimentos separados. Las diferencias entre los grupos experimentales y los grupos control fueron analizados utilizando de Student
t-test
. La significación estadística fue aceptada en
P Hotel & lt; 0.05.
Apoyo a la Información
S1 Fig. análisis FACS de las células AGS transfectadas con miR-206. Las células AGS
se recogieron 48 horas después de la transfección con miR-206 o NC, se tiñeron con yoduro de propidio, y se analizaron por citometría de flujo. Se evaluaron diez mil células en cada muestra. Los resultados más representativos de tres experimentos independientes se representan
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s001 gratis (TIF)
S2 Fig. La formación de colonias de ensayo.
células AGS transfectadas con el miR-206 o NC se sembraron a baja densidad. Después de 7 días, la formación de colonias se determinó por tinción con cristal violeta. Los resultados típicos en tres experimentos independientes se muestran
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s002 gratis (TIF)
S3 Fig. Los efectos de miR-206 en células AGS se evaluaron con los ensayos y Transwell Matrigel. México La cantidad de células que habían migrado a través de los poros de la cultura de inserción (arriba) o habían invadido a través de los poros de inserción Matrigel (abajo) fue fotografiado usando una 20X objetivo de microscopio
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s003 gratis (TIF)
S4 Fig. . Downregulation de c-Met de siRNA
Western blot se realizó para confirmar la supresión de la expresión de c-Met después de la transfección lipofectamina de células AGS con cualquiera de c-Met siRNA o un control negativo (CN)
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s004 gratis (TIF)
S5 Fig. Los efectos de c-Met siRNA en células AGS se evaluaron con los ensayos y Transwell Matrigel. México La cantidad de células que habían migrado a través de los poros de la cultura de inserción (arriba) o habían invadido a través de los poros de inserción Matrigel (abajo) fue fotografiado usando un objetivo de microscopio 20X
doi:. 10.1371 /journal.pone.0128751.s005 gratis (TIF)