Extracto
Los microARN (miRNA) son cortos de ARN no codificante, que regulan una variedad de funciones celulares mediante la supresión de la expresión de la proteína diana. La hipótesis de que un conjunto de microARN regular las respuestas tumorales a la hipoxia mediante la inhibición de los componentes de la vía de señalización de hipoxia. Hemos encontrado que la expresión de miR-22 en el cáncer de colon humano es menor que en el tejido de colon normal. También se encontró que el miR-22 controla la hipoxia 1α factor inducible (HIF-1α) expresión en la línea celular de cáncer de colon HCT116. La sobreexpresión de miR-22 inhibe la expresión de HIF-1α, la represión de la producción de factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) durante la hipoxia. Por el contrario, desmontables de miR-22 endógena aumenta la hipoxia inducida por la expresión de HIF-1α y VEGF. El medio acondicionado a partir de células que sobreexpresan miR-22 contiene menos proteína VEGF que las células de control, y también inducen menos crecimiento de células endoteliales y la invasión, lo que sugiere miR-22 en células adyacentes influencias función de la célula endotelial. Tomados en conjunto, nuestros datos sugieren que el miR-22 podría tener un efecto antiangiogénico en cáncer de colon
Visto:. Yamakuchi M, Yagi S, T Ito, Lowenstein CJ (2011) microARN-22 Regula La hipoxia señalización en Las células del cáncer de colon. PLoS ONE 6 (5): e20291. doi: 10.1371 /journal.pone.0020291
Editor: Costanza Emanueli, Universidad de Bristol, Reino Unido
Recibido: 18 Enero, 2011; Aceptado: April 24, 2011; Publicado: 23 de mayo de 2011
Derechos de Autor © 2011 Yamakuchi y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue apoyada por conceder Asociación Americana del corazón (0835446N) (MI) y la subvención del NIH (CJL). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son los ARN no codificantes cortos (18-22 nt), que inhiben la expresión génica. miRNAs maduro se producen por la RNasa III enzimas Drosha y Dicer, a continuación, incorporar en el ARN inducida por silenciar complejo (RISC), y finalmente se unen a la región 3 'no traducida (3'-UTR) de sus ARNm del gen diana, inhibiendo su expresión [1], [2]. Se cree que el apareamiento de bases consecutivo de al menos 7 nucleótidos entre la secuencia de los genes miARN (secuencia de semillas) y el elemento de miARN reconocimiento (MRE) es necesario para reprimir la traducción de proteínas [3], [4], [5], [6], [7]. Además, algunos estudios sugieren que la unión imperfecta tal como oscilaciones o protuberancias en la secuencia de semillas inhibe la traducción de proteínas [8], [9].
MiRNAs tienen una variedad de funciones fisiológicas y patológicas, incluyendo el control de la tumorigénesis [ ,,,0],10], [11], [12]. El factor de transcripción más comúnmente mutado en el cáncer, p53, regula un conjunto de miRNAs. La activación de p53 aumenta la producción de miR-34a, y la sobre expresión de miR-34a induce la detención del ciclo celular, la senescencia y apoptosis. Otro factor de transcripción relacionado con el cáncer, c-myc, regula un conjunto separado de miRNA. C-myc disminuye la expresión de varios miRNAs incluyendo miR-22 en líneas celulares de cáncer [13]. Estudios recientes mostraron que el miR-22 se dirige varias proteínas tales como el estrógeno receptor de un (ERA), c-Myc proteína de unión (MYCBP), Myc factor asociado X (MAX), y PTEN, lo que sugiere que el miR-22 puede estar implicado en la tumorigénesis. Sin embargo aún se desconoce la función de miR-22 en células de cáncer.
factor de inducible por hipoxia 1 (HIF-1) es un factor de transcripción heterodimérico que regula la transcripción de genes tales como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y de fibroblastos básico factor de crecimiento (bFGF) [14], [15], [16]. HIF-1 es un heterodímero que consiste en dos subunidades, HIF-1a y HIF-1ß (ARNT). Hipoxia o hipoxia miméticos estabilizar HIF-1α inhibiendo su hidroxilación prolil. HIF-1 está implicada en la angiogénesis, invasión, metástasis, la captación de glucosa y el metabolismo en las células del cáncer [17]. La hipoxia en los tumores puede actuar como un disparador para la angiogénesis para ofrecer una mayor oxígeno al cáncer. la expresión de HIF-1α se asocia con un mal pronóstico en el cáncer colorrectal y cáncer de páncreas [17], [18], [19].
A continuación, identifica HIF-1α como un objetivo para el miR-22 en un cáncer de colon línea celular. Encontramos que miR-22 niveles en el cáncer de colon humano son más bajos que en el tejido de colon normal. Dado que las muestras de cáncer de colon con menor miR-22 muestran una mayor expresión de VEGF, que postula que el miR-22 regula la señalización de la hipoxia en líneas celulares de cáncer de colon.
Resultados
La expresión de miR-22 en el cáncer de colon
se utilizó primera transferencia de Northern para medir la expresión de miR-22 en tejidos humanos, y encontramos que el miR-22 se expresa en la mayoría de los tejidos, pero relativamente abundante en corazón, músculo liso, la vejiga y el tejido adiposo (Fig. 1A). A continuación examinó la expresión de miR-22 en varias líneas celulares de cáncer. Pudimos detectar miR-22 en tres líneas celulares de cáncer de colon, HCT116, HCT116 p53 KO y HT29, y también en una línea celular de cáncer epitelial, HeLa (Fig. 1B). Para examinar el nivel de miR-22 en el cáncer de colon, se midió la expresión de miR-22 por qPCR en 9 muestras de cáncer de colon humano y 9 tejidos normales del colon de pacientes en el hospital Johns Hopkins. La expresión de miR-22 es menor en las muestras de cáncer de colon (P = 0,02) (Fig. 1C). Dado que estamos interesados en estudiar cómo los microARN regulan la angiogénesis tumoral, también se midió la expresión de ARNm de VEGF en las mismas muestras y se encontró que la expresión de VEGF mRNA en muestras de cáncer de colon es más alta que en las muestras de colon normal (P = 0,03) (figura 1C) . También se encontró que los niveles de ARN de miR-22 y VEGF están correlacionados negativamente (P & lt; 0,05) (Figura 1D).
(A) miR-22 expresión en tejidos humanos normales.. Una membrana comercial que contiene ARN de tejidos humanos normales se sondeó para miR-22 utilizando el análisis del Norte. (B) la expresión de miR-22 en líneas celulares. Los lisados celulares se probaron para miR-22 mediante transferencia de Northern. (C) miR-22 y VEGF expresión en tejido de colon humano normal y el cáncer de colon humano. Se extrajo ARN de 9 muestras normales humanos de colon (blanco) y de 9 muestras de cáncer de colon humano (negro), y se analizó mediante qPCR para miR-22 y VEGF expresión (n = 9 ± S.D.). especímenes de cáncer de colon contienen menos de miR-22 y más de VEGF especímenes normales del colon. (D) La asociación de miR-22 y VEGF en el cáncer de colon humano. transformación logarítmica natural de la proporción relativa de ARN de miR-22 y VEGF se utilizó para el análisis estadístico (n = 30).
HIF-1α es un objetivo de miR-22
Desde HIF-1α es parte de una importante vía de detección de oxígeno, se realizaron búsquedas de miARN potencial que pudiera controlar traducción HIF-1α mediante análisis computacional (miARN objetivos humano en el Memorial Sloan-Kettering Cancer Center computacional Biología sitio web http: //BCOI. mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl), y se encontró que la secuencia de semillas de miR-22 coincide con el 3 'UTR de HIF-1α (7 nucleótidos, acompañará un partido de oscilación). Exploramos cómo miR-22 regula HIF-1 y la hipoxia de señalización utilizando células de cáncer de colon HCT116 como un modelo in vitro de cómo las células tumorales responden a la hipoxia. Para examinar si el miR-22 regula la expresión de la proteína HIF-1α, transfectadas las células HCT116 con pre-miR-22 para más de expresión de miR-22 y con anti-sentido-miR-22 para desmontables de miR-22. La transfección de pre-miR-22 en HCT116 aumentó miR-22 niveles más de 10 veces (Fig. 2A). Desmontables de miR-22 mediante la transfección con anti-sentido-miR-22 disminuyó los niveles de miR-22 hasta el 40% (Fig. 2A). La hipoxia aumenta la expresión de HIF-1α en HCT116, como se esperaba (Fig. 2B). Sin embargo, la sobre expresión de miR-22 expresión de HIF-1α inducida por hipoxia inhibido en HCT116 y HT29 (Fig. 2B-D). Por el contrario, desmontables de miR-22 aumento de la expresión de HIF-1α en condiciones de hipoxia (Fig. 2C-D). La sobreexpresión de miR-22 no alteró el nivel de HIF-1β, el socio de dimerización de HIF-1α (Figura S1). Estos estudios muestran que endógena de miR-22 inhibe la HIF-1α.
(A) La alteración de la expresión de miR-22 mediante transfección. células HCT116 se transfectaron con pre-miR-22 o anti-sentido-miR-22 o oligonucleótidos de control, y los niveles de miR-22 se midieron mediante qPCR. (B) El exceso de expresión de miR-22 inhibe la expresión de HIF-1α. células HCT116 fueron transfectadas con oligonucleótidos de control o pre-miR-22 y, a continuación expuestos a normoxia o hipoxia durante 16 h. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia de HIF-1α. La hipoxia induce HIF-1α, pero el miR-22 suprime la HIF-1α. (C) Las líneas celulares de cáncer de dos colon, HCT116 (dos paneles superiores) y HT29 (dos paneles inferiores), fueron transfectadas con pre-miR-22 o anti-sentido-miR-22, expuestos a la hipoxia, y los lisados celulares se inmunotransfirieron para HIF-1α. (D) La cuantificación por densitometría de inmunotransferencia para HIF-1α en las células HCT116 transfectadas como anteriormente (n = 3 ± S.D.).
microARN puede regular la expresión génica mediante la supresión de la traducción. La sobreexpresión o derribo de miR-22 no alteró la expresión de ARNm de HIF-1α, lo que sugiere que el miR-22 regula la traducción de HIF-1α, pero no (Fig. 3A) la transcripción. HIF-1α humana UTR 3 'tiene un sitio de unión potencial de miR-22 (Fig. 3B). Para explorar el mecanismo por el que miR-22 regula HIF-1α, hicimos un vector informador de luciferasa, que contiene un fragmento del 3 'UTR de HIF-1α (que se extiende después del codón de parada de 0 a 401 bp) que incluye un MIR -22 sitio de unión. Nos células HCT116 co-transfectadas con este vector reportero y con pre-miR-22 o control. La sobreexpresión de miR-22 disminución de la actividad de la luciferasa (Fig. 3C izquierda). Sin embargo, miR-22 no afecta a la expresión de la luciferasa con un mutados-22 miR elementos de unión (Fig. 3C derecho), lo que sugiere que el miR-22 inhibe la expresión de HIF-1α a través de la interacción con el 3 'UTR de HIF-1α.
(A) miR-22 no afecta el ARNm de HIF-1α. HCT116 células fueron transfectadas con pre-miR-22 o anti-sentido-miR-22 o el control. El ARN total se cosechó y se analizó para HIF-1α mRNA por qPCR (n = 3 ± S.D.). (B) Human 3'UTR HIF-1α contiene un sitio de unión para miR-22. (C) miR-22 reprime la transactivación de HIF-1α 3'UTR. células HCT116 se transfectaron con un vector indicador de luciferasa (MiRreport) que contiene el 3 'UTR de HIF-1α (panel izquierdo) o una UTR 3' mutada de HIF-1α (panel derecho) y con pre-miR-22 o pre-MIR -controlar. Las células se recogieron y se midió la actividad de luciferasa (n = 3 ± SD).
miR-22 controla la expresión del VEGF en HCT116
Para investigar el papel de miR-22 en la expresión del VEGF , HCT116 transfectadas con pre-miR-22 o anti-sentido-miR-22 o el control, y luego se midió la expresión del ARNm de VEGF por qPCR. La hipoxia y la desferioxamina hipoxia mimético (DFX) aumentó la expresión de ARNm de VEGF (Fig. 4A, barras blancas). La sobreexpresión de miR-22 o la disminución de la hipoxia inducida por la expresión de VEGF DFX (Fig. 4A, barras negras). Por el contrario, desmontables de miR-22 aumenta la expresión del VEGF inducida DFX (Fig. 4B). A continuación se midió la concentración de VEGF en los medios de comunicación. DFX aumentó la secreción de VEGF a partir de células HCT116. La sobreexpresión de miR-22 suprimió la secreción de VEGF. Por el contrario, desmontables de miR-22 mejorado la liberación de VEGF (Fig. 4C-D). Por otra parte, hemos examinado el efecto de miR-22 tras la expresión de angiopoyetina 2 (ANGPT2) y el factor de células madre (SCF), porque ANGPT2 y SCF son factores de crecimiento angiogénicos que están regulados por HIF-1 [20]. ANGPT2 inducida por la hipoxia y SCF, y la sobre-expresión de miR-22 inhibida hipoxia inducida por la expresión de ANGPT2 y SCF (Figura S2).
HCT116 fueron transfectadas con pre-miR-22 o anti-sentido-miR-22 o control, y luego expuesto a la normoxia o hipoxia durante 16 h. Los medios de comunicación se analizó para VEGF por ELISA y el ARN de lisados celulares se analizaron para ARNm de VEGF por qPCR (n = 3 ± S.D. * P & lt; 0,05) (A) Pre-miR-22 disminuye VEGF mRNA. (B) anti-sentido-miR-22 aumenta ARNm de VEGF. (C) Pre-miR-22 disminuye la proteína VEGF. (D) Anti-sentido-miR-22 aumenta la proteína VEGF.
miR-22 en HCT116 regula el crecimiento celular endotelial
Desde la angiogénesis implica la proliferación de células endoteliales, hemos probado el efecto de miR-22 sobre la proliferación de HUVEC. Transfectadas las células HCT116 con pre-miR-22 o el control, expusieron las células a normoxia o hipoxia, y se recogieron los medios de comunicación. Añadimos este medio acondicionado de células endoteliales humanas primarias (HUVEC), se cultivaron durante otros 3 días, y luego se midió la proliferación de HVUEC por ensayo de incorporación de BrdU. No hubo diferencia significativa entre los medios de comunicación a partir de células transfectadas normoxia pre-miR-22 y medios de comunicación a partir de células de control transfectadas normoxia (Fig. 5A). Como era de esperar, los medios de las células hipóxicas transfectadas con el control de aumento de la proliferación de HUVEC. Sin embargo, los medios de comunicación de las células hipóxicas transfectadas pre-miR-22 bloquean este aumento en la proliferación (Fig. 5A).
células HCT116 se transfectaron con pre-miR-22 o control, y se recogieron los medios de comunicación. células HUVEC (A) se cultivaron en placas de 12 pocillos, se añadieron los medios acondicionados y las HUVEC se incubaron durante 3 días. La proliferación se controló mediante ensayo de incorporación de BrdU (n = 5 ± S.D. * P & lt; 0,05). Pre-miR-22 disminuye la capacidad de las células tratadas de hipoxia para producir factores que estimulan la proliferación endotelial. (B) las células HUVEC se rascaban, se añadieron los medios acondicionados, y se fotografiaron en 16 h. (C) Medición de la distancia recorrida por cada herida con relación al control expuesto con normoxia. (* P & lt; 0,05) guía empresas
Desde la angiogénesis también implica la migración endotelial, probamos el efecto de miR-22 sobre la migración HUVEC utilizando el cero ensayo de cicatrización de la herida. Hemos añadido a las células HUVEC El medio acondicionado a partir de células HCT116 que habían sido transfectadas con pre-miR-22 o control y luego habían sido expuestas a normoxia o hipoxia. Después de 16 h se midió la migración endotelial desde el borde de la herida cero. Medios a partir de células HCT116 expuestos a la hipoxia aumenta la migración endotelial (Fig. 5B-C). La sobreexpresión de miR-22 en HCT116 descenso de la migración HUVEC (Fig. 5B-C). Estos datos sugirieron que el miR-22 en HCT116 afecta la biología endotelial, aumentando la proliferación y la migración.
Discusión
El principal hallazgo de este estudio es que el miR-22 inhibe la señalización de hipoxia. MiR-22 se expresa en muchas células cancerosas, incluyendo la línea celular de cáncer de colon HCT116. Por otra parte, el miR-22 suprime la traducción de HIF-1α. Por último, el miR-22 inhibe la expresión del VEGF mediante la supresión de la expresión de HIF-1α. Dado que otros han demostrado que los límites de c-myc expresión de miR-22, los tumores que sobreexpresan c-myc se podría esperar a tener niveles más bajos de miR-22, mayores niveles de HIF-1α y VEGF. Por lo tanto, estos datos sugieren que el miR-22 puede regular la angiogénesis tumoral.
Los objetivos de miR-22
individual miARN pueden modular la expresión de muchos genes. Varios informes identifican posibles objetivos de miR-22 mediante el uso de algoritmos de software, tales como TargetScan, Miranda y PicTar, en combinación con estudios celulares. MiR-22 objetivos del Receptor de Estrógeno un (ERA) y reprime la señalización de estrógenos en varias líneas celulares de cáncer de mama [21], [22]. MiR-22 también reprimió c-Myc vinculante MYCBP de proteínas [23], c-Myc pareja de unión MAX [24] y el gen supresor de tumores PTEN [25], [26], [27]. PPAR-alfa y BMP-7 también son objetivos de miR-22 [28]. Se encontró que el HIF-1α es un nuevo objetivo de miR-22. La 3 'UTR de HIF-1α incluye una secuencia complementaria para miR-22 que consiste en 7 nucleótidos; esta secuencia semilla contiene un nucleótido de unión oscilante (G-A). Nuestros datos bioquímicos sugieren que el miR-22 regula directamente la expresión de HIF-1α comprar la supresión de la traducción de HIF-1α.
Papel de miR-22 en la angiogénesis tumoral
miR-22 tiene un papel único en tipos de células específicos. MiR-22 regula la diferenciación de una línea celular de monocitos [24]. MiR-22 regula PPAR-alfa y BMP-7 vías de señalización en los condrocitos humanos [28]. En el cáncer, la función de miR-22 es controvertido. El miR-22 gen de ratón se asigna a una región genómica asociada al cáncer, y el gen humano de miR-22 se encuentra dentro de una pérdida de la región de heterocigosidad (LOH) en varias células del cáncer [23], [29], lo que sugiere que el miR-22 está implicado en la supresión del crecimiento tumoral. La expresión ectópica de miR-22 inhibe la formación y la proliferación de colonias de células MCF-7 [23]. Esta actividad supresora de tumores de miR-22 consiste en la represión de MYCBP. Sin embargo otros han demostrado que la que desmontables de miR-22 aumenta la tasa de apoptosis en células 16HBE-T [26]. La aparente contradicción entre estos dos estudios puede deberse a diferentes líneas celulares o diferentes métodos para alterar miR-22 niveles. Se encontró que el miR-22 inhibe la secreción de VEGF, lo que sugiere miR-22 puede actuar como un factor anti-angiogénesis en líneas celulares de cáncer de colon. Nuestros datos proporcionan soporte a esta idea: muestras humanas de cáncer de colon tienen niveles más bajos de miR-22 y más altos niveles de VEGF, en comparación con el tejido de colon humano normal. Nuestros datos revelan otro mecanismo a través del cual el miR-22 podría actuar como un supresor de tumores:. Pérdida de la expresión de miR-22 no sólo permite un aumento de la MYCBP sino también un aumento de HIF-1α
Hipoxia señalización y miARN
crecimiento local del tumor está limitado por la hipoxia: medida que se expande el tumor, su centro se vuelve hipóxica, la inducción de genes como el VEGF que desencadenan la angiogénesis [30], [31], [32]. El heterodímero HIF-1 juega un papel crítico en la señalización de hipoxia en tumores [15], [33]. Nosotros y otros han identificado los genes miARN que controlan la señalización de la hipoxia. Hemos determinado anteriormente que el miR-107 inhibe la HIF-1β [34]. Otros han demostrado que miR-20b limita la expresión de HIF-1α en líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón y cáncer de mama [35], [36], [37]. El cúmulo de miR-17-92 también modula el crecimiento tumoral mediante la inhibición de la expresión de HIF-1α. Nuestro estudio actual añade el miR-22 a la lista de miRNAs que regulan la proteína HIF-1.
Materiales y Métodos
Cultivo celular, transfección exposición a la hipoxia y
vena umbilical humana células endoteliales (HUVEC) fueron adquiridos de Lonza (Walkersville, MD). HUVEC (pasaje 2-5) se cultivaron en medio basal endotelial (EBM2) suplementado con factores de crecimiento (Lonza). HeLa y HEK293 (ATCC, Manassas, VA) se cultivaron en medio DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). HCT116 (regalo de Bert Vogelstein, la Escuela de Medicina de la Universidad Johns Hopkins) y HT29 (ATCC) se cultivaron en un medio de McCoy 5A suplementado con 10% de SFB. La deferoxamina (DFX) y otros reactivos se obtuvieron de Sigma (St Louis, MO). Para exponer las células a la hipoxia, las células fueron cultivadas en cámara de Billups-Rotenburg con un 94% de N2, 1% de O2 y 5% de CO2 en 37 C durante 24 horas.
espécimen humano
de colon humano especímenes de cáncer (n = 9) y la muestra de colon normales no cancerosos emparejados (n = 9) fueron obtenidas de pacientes en el hospital Johns Hopkins, Baltimore, MD, con el consentimiento informado documentado en cada caso. La recopilación y el análisis de la muestra de cáncer de colon humano fueron aprobados por la Escuela de Medicina Junta de Revisión Institucional de la Universidad Johns Hopkins. Los pacientes sometidos a cirugía por cáncer colorrectal proporcionados consentimiento por escrito de donar tejidos para su análisis.
La transfección
precursor miRNAs y anti-sentido oligonucleótidos para miRNAs eran de Applied Biosystems (Foster City, CA). Para la transfección de precursor de miARN, las células HCT116 se transfectaron con SIPORT NeoFX (Applied Biosystems) con precursor de miARN 0-20 nM o con anti-sentido miARN 0-40 nM y se recogieron 48 horas más tarde.
transferencia de Northern
Los ARN totales se extrajeron de las células utilizando Trizol (Invitrogen). ARN de tejido humano se obtuvieron de Applied Biosystems. Se llevó a cabo la transferencia de Northern de miR-22, como se ha descrito anteriormente. En resumen, 10 g de cada uno de ARN se cargaron en 15% TBU-gel (Invitrogen), se transfirió a membrana de nitrocelulosa, y se hibridaron con sondas
32P de extremo marcado específico para miR-22 a 42 ° C durante 16 horas. La sonda de miR-22, 5'-TAAAGCTTGCCACTGAAGAACT-3 'fue sintetizado por Integrated DNA Technologies; todos los demás reactivos fueron adquiridos de Applied Biosystems.
PCR cuantitativa en tiempo real (QRT-PCR)
Para analizar la expresión de los genes miARN, se utilizaron ensayos TaqMan microARN para cuantificar los niveles de madurez miRNAs siguiente al del fabricante instrucciones. Brevemente cDNA fue sintetizado a partir de ARN pequeño purificado (10 ng) y se realizó PCR en Tiempo Real utilizando iCycler iQ (BioRad). Los niveles de expresión se normalizaron a U6. Los cebadores para los genes miARN RT-PCR y la mezcla de PCR se adquirieron de Applied Biosystems. Para detectar la expresión del ARNm, la síntesis de ADNc se realizó utilizando la alta capacidad de síntesis de ADNc kit (Applied Biosystems). Los cebadores para el VEGF humano y ß-actina fueron adquiridos de Applied Biosystems.
Los ensayos de luciferasa
Un fragmento de la 3 'UTR de HIF-1α (empezando después del codón de terminación TGA y que se extiende por 401 pb) que contiene el elemento de respuesta de miR-22 se clonó en PMIR-INFORME vector de luciferasa (Applied Biosystems). La mutación del elemento de miR-22 respuesta (5'-GTTGACGG-3 '→ 5' G
Un
T
C
Un
G
GG-3 ') era hecha por mutagénesis dirigida kit del sitio QuikChange (Stratagene). células HCT116 se sembraron a 5 x 10
4 células por pocillo en placas de 24 pocillos. Al día siguiente, los vectores PMIR-INFORME luciferasa incluyendo 3 'UTR de HIF-1α y precursor miR-22 o oligonucleótidos revueltos se transfectaron en las células utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Cuarenta y ocho horas después de la transfección, ensayos de luciferasa se realizaron utilizando el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega).
Western blotting
Las células se lisaron en 0,4 ml de tampón de lisis (50 mM Tris pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 10 mM, 1% de NP40, NaF 20 mM, ortovanadato 1 mM y cóctel inhibidor de la proteasa). Los lisados se separaron por electroforesis, se transfirieron a una membrana y se hicieron reaccionar con anticuerpos específicos. El anticuerpo para ratón HIF-1α fue de Señalización Celular Tecnología (Danvers, MA). Todos los otros anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios apropiados eran de Santa Cruz.
VEGF concentraciones
Se utilizó ELISA para cuantificar VEGF secretada a partir de células HCT116 en los medios de comunicación. células HCT116 se incubaron en 1 ml de medio con FBS al 1% en ausencia (controles) o presencia de DFX o bajo normoxia o hipoxia durante 24 horas a 37 ° C. Los sobrenadantes se ensayaron para la producción de VEGF utilizando el kit de ELISA VEGF humano de acuerdo con el protocolo del fabricante (R & amp; D Systems).
BrdU ensayo de incorporación de
células HCT116 o HeLa fueron transfectadas con Pre-MIR -22 o pre-miR-control y se cultivaron durante 72 horas. BrdU se añadieron a cada pocillos y se incubaron durante 4 horas. Después de la fijación de las células, las células se incubaron con anticuerpo anti-BrdU durante 1 hora, a continuación, con conjugada con peroxidasa de cabra anti-IgG de ratón durante 30 min. TMB sustrato de peroxidasa se añadieron a cada pocillos. Leer la placa usando un lector de espectrofotómetro de microplacas ajustado a una longitud de onda de 450 nm.
cicatrización de heridas ensayo
Las HUVEC se sembraron en placas de 12 pocillos y se cultivaron hasta la confluencia. Un cero se ha realizado mediante una punta de pipeta 1.000 l y el cambio de medios para acondicionar medios de HCT116 transfectadas con pre-miR-control o pre-miR-22. Las imágenes fueron capturadas a las 16 h, y se midieron las distancias entre las células.
El análisis estadístico
Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar. Las comparaciones estadísticas se realizaron entre dos grupos con la prueba t y entre varios grupos por ANOVA. Un valor de P & lt; 0,05 se consideró significativo
Apoyo a la Información
Figura S1..
HIF-1β no es un objetivo de miR-22. Descripción: HCT116 células fueron transfectadas con pre-miR-22 o pre-miR-control, y se expusieron a normoxia o hipoxia durante 16 h. Los lisados celulares se sometieron a inmunotransferencia de HIF-1a y HIF-1b. La sobreexpresión de miR-22 inhibe la expresión de HIF-1a, pero no HIF-1b
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figura S2.
miR-22 regula la expresión de factores angiogénicos. Descripción: HCT116 células fueron transfectadas con pre-miR-22 o el control, y luego expuestas a normoxia o hipoxia durante 8 h. RNAs de lisados celulares se analizaron para la angiopoyetina 2 factor de células (ANGPT-2), madre (SCF), y la COX-2 mRNAs por qPCR (n = 3 ± SD * P & lt; 0,05) La sobreexpresión de miR-22 disminuyeron las expresiones de factores angiogénicos
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Reconocimientos
agradecemos a Dr. Scott Kern para que nos proporciona el cáncer de colon humano especímenes.