Extracto
Micro (MI) ARN son importantes reguladores implicados en diversos procesos físicos y patológicos, incluyendo el cáncer. La familia de miRNA-302 se ha documentado que desempeñan un papel crítico en la carcinogénesis. En este estudio, se investigó el papel de los genes miARN-302a en el cáncer de próstata (CaP). la expresión de los genes miARN-302a se detectó en 44 tejidos con CaP y 10 tejidos normales de la próstata, y se analizó su significado clínico-patológica. La proliferación celular y el análisis del ciclo celular se realizaron en células de CaP que expresaban de forma estable los genes miARN-302a. El objetivo de genes de miARN-302a y la vía aguas abajo se investigaron más. En comparación con los tejidos normales de la próstata, la expresión de los genes miARN-302a se downregulated en los tejidos de CaP, y fue incluso menor en los tejidos de CaP con una puntuación de Gleason ≥8. La sobreexpresión de los genes miARN-302a inducida por la detención del ciclo celular G1 /S en células de CaP, y suprime la proliferación de células de CaP, tanto in vitro como in vivo. Además, inhibe los genes miARN-302a
AKT
expresión uniéndose directamente a su región no traducida 3, lo que resulta en alteraciones posteriores de la
AKT-GSK3-ciclina D1
y
AKT-p27
Kip1
vía. Estos resultados ponen de manifiesto miRNA-302a como un supresor de tumores en el CaP, lo que sugiere que los genes miARN-302a se puede utilizar como un objetivo potencial para la intervención terapéutica en el CaP
Visto:. Zhang GM, Bao CY, Wan FN, Cao DL , Qin XJ, Zhang HL, et al. (2015) microARN-302a suprime la proliferación de células tumorales mediante la inhibición de
AKT Hoteles en cáncer de próstata. PLoS ONE 10 (4): e0124410. doi: 10.1371 /journal.pone.0124410
Editor Académico: Jun Li, Escuela de Medicina de la Universidad Sun Yat-sen, CHINA
Recibido: 21 Octubre, 2014; Aceptado: March 13, 2015; Publicado: 29 Abril 2015
Derechos de Autor © 2015 Zhang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Grant No. 81202003 SNCF) (http://www.nsfc.gov.cn . /) y la Fundación de Ciencias de Shanghai Comisión Municipal de Salud y Planificación Familiar (subvención Nº 2.010.145) (http://www.wsjsw.gov.cn/wsj/) a GHS
Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.
Introducción
a medida que el tumor maligno más frecuente entre los hombres en los países desarrollados [1], el cáncer de próstata (CaP) muestra asimismo un aumento constante de la incidencia en china durante las últimas décadas. Según el Informe Anual de Registro de Cáncer de China (2012), el CP se ha convertido en el sexto cáncer más común y la novena causa de muerte por cáncer en los hombres, especialmente en las zonas urbanas [2]. Además, hasta el 70% de los pacientes con CaP tienen metástasis en el momento del diagnóstico, dando como resultado de forma espectacular disminución de la supervivencia a largo plazo [3]. Por lo tanto, existe una necesidad imperativa para explorar los mecanismos por los que se inician la generación de CaP y la progresión.
La creciente evidencia indica que los microRNA (miRNA), un tipo de endógeno, pequeños RNAs no codificantes, participan en diversos procesos celulares. A través de la unión específica y la escisión de ARNm o inhibiendo su traducción [4,5], la función de miRNAs ya sea como oncogenes o supresores tumorales [6]. La familia de miRNA-302 fue identificado por primera vez en las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células de carcinoma de embriones humanos en 2004. Desde entonces, varios estudios sobre la familia de miRNA-302 se han centrado en su papel potencial en la reprogramación de células somáticas en células madre pluripotentes inducidas , así como embrionario auto-renovación [7]. Varios factores de transcripción que se expresan en el desarrollo temprano de células madre del cáncer y mantenimiento, como
Oct4
,
Sox2
, y
Nanog
, se encontraron esencial para la regulación transcripcional de la familia de miRNA-302 [8]. Curiosamente, Fareh et al. demostró que la expresión estable de los genes miARN-302 fue capaz de inducir la pérdida de
Oct4
,
Sox1
, y
Nanog
[9]. El papel de los genes miARN-302 en la tumorigénesis ha sido debatida recientemente, como conclusiones contradictorias han sido dibujado por diferentes grupos de investigación. Por ejemplo, endógena miRNA-302 no se detectó en células de cáncer cervical, y la expresión ectópica de la proliferación celular inhibida miRNA-302 y la formación de tumores [10]. En contraste, la transfección de los genes miARN-302b en las células de cáncer de colon se tradujo en una mayor capacidad para la formación de colonias, la invasión y la migración in vitro [11]. Sin embargo, hasta la fecha, se han realizado pocos estudios para investigar el posible papel de los genes miARN-302 en el CaP.
En el presente estudio, se encontró que, en comparación con los tejidos normales de la próstata, tejidos con CaP expresaron menor miRNA-302a niveles, y la expresión de los genes miARN-302a se asoció inversamente con la puntuación de Gleason (GS). También se muestra que la sobreexpresión de los genes miARN-302a en células de CaP puede inducir la detención del ciclo celular e inhibir la proliferación de células en la formación vitro y tumor in vivo. Además, se identificaron
AKT
como un gen diana a través del cual los genes miARN-302a ejerce su papel inhibidor en el CaP.
Materiales y Métodos
Las muestras de pacientes
tejido de CaP y el tejido benigno de la próstata se obtuvieron del banco de tejidos en la Universidad de Fudan Centro de cáncer de Shanghai. características clínico de estos pacientes fueron recuperados de la base de datos del Departamento de Urología. El protocolo de estudio fue aprobado por el Consejo Institucional de Revisión de la investigación en la Universidad de Fudan de Shanghai Centro de Cáncer y el consentimiento informado firmado se obtuvo de todos los participantes del estudio.
Cultivo de células
líneas celulares de CaP humano, riñón embrionario humano las células 293T (HEK293T) y células epiteliales normales de la próstata (RWPE-1) fueron adquiridos por el Instituto de Investigación de la célula de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, República Popular china). LNCaP y 22Rv1, PC-3, DU145, y las células HEK293T se hicieron crecer en medio RPMI 1640, medio F-12K, medio MEM, y medio DMEM, respectivamente, todos suplementado con suero bovino fetal 10%. células RWPE-1 se cultivaron en medio K-SFM suplementado con extracto de pituitaria bovina y factor de crecimiento epidérmico recombinante humano. Las células fueron cultivadas a 37 ° C en 5% de CO
2.
ARN, la extracción de miARN y cuantitativa en tiempo real de reacción en cadena de la polimerasa
El ARN total se aisló a partir de células cultivadas y tumor tejidos utilizando el reactivo Trizol. cDNA de la primera cadena se sintetizó usando el kit de RevertAid Primera Strand cDNA de síntesis (Life Technology, Carlsbad, CA), que luego se utiliza para la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR), junto con cebadores directo e inverso y el Poder SYBR Green PCR Master Mezcla.
β-actina
se utilizó como control interno para la
AKT niveles Versión taquigráfica. El primer secuencias fueron los siguientes:
AKT
-Forward: GGGTTTCTCCCAGGAGGTTT, revertir: GTCCATGGTGTTCCTACCCA; β-actina-forward: ACCGAGCGCGGCTACAG, revertir:. CTTAATGTCACGCACGATTTCC
De acuerdo con las instrucciones del fabricante, miARN de tejidos y células se extrajo usando el kit de aislamiento mirVana miARN (Life Technology, Carlsbad, CA), y los niveles de expresión de miRNA-302a se detectaron por ensayos TaqMan (miARN tecnología de la vida, Carlsbad, CA), utilizando U6 pequeños ARN nucleares como un control interno.
la construcción del vector, la producción de lentivirus, y transfección celular
la secuencia de HSA-miARN-302a madura se sintetizó y se introdujo en el vector PLKO.3G para producir PLKO.3G-miR-302a. Un vector de restauración AKT se construyó introduciendo el
AKT
CDS, que se amplificó a partir de cDNA de PC-3 en el vector Pcdh-CMV-MCS-EF1-copGFP. El vector informador de luciferasa-3 no traducida (UTR) se genera a través de la construcción de la
AKT
3UTR, lo que lleva a un sitio de unión de miRNA-302a putativa en MT01 vectorial. Todos los vectores construidos fueron verificados por secuenciación.
PLKO.3G-miR-302a mezclado con psPAX2 y PMD2-G se transfectó en células HEK293T utilizando Lipofectamine reactivo 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante . Cuarenta y ocho horas más tarde, lentivirus se cosechó y se utilizó para infectar células PC-3 y DU145. A continuación, las células fueron ordenados por citometría de flujo (Beckman Coulter, Brea, CA) para establecer líneas celulares estables que expresan constitutivamente los genes miARN-302a (PC-3-302a y células DU145-302a).
Los ensayos de luciferasa
Cuarenta y ocho horas después de la transfección, las células se lisaron usando 50 l de tampón de lisis pasiva. A continuación, un ensayo de doble luciferasa se llevó a cabo como se indica por el fabricante (Promega, Madison, WI). La relación de luciérnaga a luciferasa de Renilla actividad se utilizó para expresar actividades de luciferasa. Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
cosecha de proteínas y transferencia de western
Las proteínas totales se recogieron usando el kit de extracción CelLytic (Roche, Basilea, Suiza) que contiene inhibidores de la proteasa y, a continuación cuantifican utilizando la proteína BCA kit reactivo de ensayo (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) según las instrucciones del fabricante. Después de separar proteínas usando electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio, la proteína se transfirió a membranas de fluoruro de polivinilideno y, a continuación bloqueada en la leche desgrasada 5%. El uso de los anticuerpos primarios y anti-conejo vinculados a peroxidasa de rábano picante (1: 5000) (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX) como el segundo anticuerpo, las proteínas diana se probaron y luego visualizaron utilizando el Sistema Blotting PlusWestern ECL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA).
β-actina fue
uso como control de carga. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes:
AKT gratis (1: 1000), fosforilada
AKT gratis (
pAKT
)
(Ser473) gratis (1: 500 ),
GSK3 gratis (1: 500),
pGSK3β (Ser9) gratis (1: 500),
ciclina D1 gratis (1: 1000),
p27
Kip1 gratis (1: 1000),
PI3K gratis (1: 1000), (Cell Signaling Technology, Boston, MA) y
β-actina
(1: 2000). (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)
proliferación celular y ensayos de ciclo celular
se realizaron ensayos EdU CCK-8 y para detectar la proliferación celular. Brevemente, CCK-8 ensayos se llevaron a cabo como sigue: Se sembraron células en una placa de 96 pocillos a una concentración de 1 × 10
4 células /pocillo. Después de la adhesión, las células se cultivaron en medio fresco mezclado con CCK-8 (10: 1) (Dojindo, Shanghai, China) durante 2 horas, antes de que la absorbancia se midió con un lector de microplacas a 450 nm. Para los ensayos de edu, se incubaron las células en solución EdU (1: 5000) durante 2 horas, a continuación se cosecharon y se tiñeron usando el Cell-Light EdU Apolo 643 In vitro Citometría de Flujo Kit (Ribobio, Guangzhou, China), de acuerdo con las instrucciones del fabricante . Las células fueron luego analizadas por citometría de flujo
Un ensayo de ciclo celular también se ha realizado mediante citometría de flujo:. Brevemente, las células se fijaron con etanol al 75% frío durante la noche, y después se lavaron con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, se añadió yoduro de propidio (50 mg /ml) que contiene RNasa a las células para la tinción de ADN antes de citometría de flujo.
Colonia ensayo de formación de
Las células aisladas se sembraron en placas de 60 mm a una concentración de 500 células /pocillo y después se incubó en 5% de CO
2 a 37 ° C. Veinte días después, las células se tiñeron con 0,5% de cristal violeta durante 30 minutos. el número de colonias en cada placa se contaron usando un microscopio invertido.
En vivo tumorigenicidad
Las células PC-3 transfectadas con PLKO.3G-SCR (células PC-3-SCR) y PC- se inyectaron células 3-302a subcutáneamente en cada flanco posterior del mismo macho de 4-6 semanas de edad BALB /c de ratón desnudo, que se adquirieron de Shanghai SLAC Laboratory Animals Co., Ltd. (Shanghai, china). tamaños de los tumores se midieron usando calibradores al menos tres veces por semana. Los ratones fueron sacrificados con CO
2 en día 44. El volumen del tumor se calculó y se midió el peso del tumor después del sacrificio. Los tumores fueron divididos en dos partes, cada parte fijada con formalina al 10% y conservas de -80 ° C. Los experimentos con animales se realizaron con la aprobación del Comité de Ética Animal Studies del Centro de Cáncer de la Universidad Fudan de Shanghai.
La inmunohistoquímica
Se realizó inmunohistoquímica (IHC) tinción de las muestras incluidas en parafina como se describe anteriormente [ ,,,0],12]. En pocas palabras, conejo anti-
AKT
y anticuerpo anti-ratón /conejo rábano anticuerpo marcado con peroxidasa (Univ-bio, Shanghai, China) se utilizaron como el primario y el segundo anticuerpo, respectivamente.
los análisis estadísticos
la diferencia entre las variables continuas se analizaron mediante de Student
t-test
o el análisis de la varianza. Dos caras
P-valores
& lt; 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS versión 20.0 (IBM Corporation, Nueva York).
Resultados
expresión de los genes miARN-302a se suprime en los tejidos de CaP y es más bajo con GS mayores
CaP tejidos fueron adquiridos a un total de 44 pacientes varones con una edad media de 67 años (rango, 49 a 77 años) con diagnóstico reciente, patológicamente confirmado CaP. Entre ellos, 32 pacientes habían recibido la prostatectomía radical y 12 pacientes habían recibido la resección transuretral de la próstata. tejidos normales de la próstata patológicamente confirmados fueron adquiridos a partir de 10 pacientes varones con cáncer de vejiga que había recibido la cistectomía radical. Las características clínicas y patológicas de todos los pacientes se detallan en la Tabla S1.
Hemos detectado miRNA-302a niveles de expresión en tejidos de CaP 44 y 10 tejidos prostáticos normales y encontró que, en comparación con los tejidos normales de la próstata, tejidos con CaP expresamos menor niveles de miARN-302a (figura 1A). Por otra parte, hemos analizado la relación entre los niveles de miARN-302a y características clínico en pacientes con CaP. No se encontró asociación significativa entre los niveles de miARN-302a y la edad, los niveles de antígeno específico de la próstata, o estadio clínico (Tabla S1). Sin embargo, la comparación de los genes miARN-302a niveles de expresión en diferentes tejidos CaP reveló que la expresión de los genes miARN-302a se redujo significativamente cuando GS & gt; 7 (Fig 1B). En conjunto, se postula que la regulación por disminución de la expresión de los genes miARN-302a puede desempeñar un papel importante en la progresión del CaP.
expresión (A) los genes miARN-302a se downregulated en el tejido CaP en comparación con el tejido normal de la próstata. (B) la expresión de los genes miARN-302a fue menor en los tejidos de CaP con GS & gt; 7 en comparación con aquellos con GS = 7. (C) Los niveles más bajos de expresión de miRNA-302a se detectaron en cuatro líneas celulares humanas CaP en comparación con las células epiteliales normales de la próstata. (D) Se detectaron altos niveles de expresión de los genes miARN-302a en células de CaP expresan de forma estable los genes miARN-302a (*
P Hotel & lt; 0,05).
La sobreexpresión de los genes miARN-302a inhibe CaP el crecimiento celular in vitro e in vivo
Para investigar la función de los genes miARN-302a en el CaP, que mide la expresión de los genes miARN-302a en cuatro líneas celulares humanas (CaP LNCaP, 22Rv1, PC-3 y DU145) y las células epiteliales de próstata normales (RWPE-1) por cuantitativa en tiempo real PCR. Como se muestra en la figura 1C, hubo una menor expresión de los genes miARN-302a en las cuatro líneas celulares en comparación con las células RWPE-1. Debido a que se especuló que la sobreexpresión de los genes miARN-302a puede inhibir el crecimiento de células de CaP, que sobreexpresa de forma estable los genes miARN-302a en células PC-3 y DU 145, que fue confirmada por cuantitativos de la transcriptasa inversa (QRT)-PCR (Figura 1D).
La CCK-8, edu, y ensayos de formación de colonias se llevaron a cabo para examinar si la sobreexpresión de los genes miARN-302a afectada la proliferación celular in vitro CaP. Como se muestra en la figura 2, hubo una significativamente menor (
P
& lt; 0,05) la tasa de crecimiento en PC-3-302a y células DU145-302a en comparación con los controles. Los análisis de citometría de flujo indicó que los porcentajes de células EdU-positivas en ambos PC-3-302a y células DU145-302a fueron menores que en los controles. Además, en comparación con los controles, tanto PC-3-302a y células DU145-302a desarrollaron menos colonias en los días 20 y 15., respectivamente. Por lo tanto, los experimentos in vitro demuestran que los genes miARN-302a ejerce un papel supresor en la proliferación de células de CaP.
Un ensayo de CCK-8 se realizó para medir la proliferación en células PC-3 y DU145 (B) (A). Los datos representan la media ± desviación estándar del valor de la densidad óptica (OD) detectado a 450 nm a partir de tres experimentos independientes. La proliferación celular se detectó en las células PC-3 y (D) DU145 (C) usando el ensayo de EdU analizado por citometría de flujo. (E, F) ensayos de formación de colonias indicaron un menor número de colonias en los genes miARN-302a que sobreexpresan células de CaP. (*
P Hotel & lt; 0,05).
A fin de validar nuestras observaciones in vivo, se inyectaron células PC-3-SCR y células PC-3-302a a la izquierda y flanco posterior derecho de cinco ratones desnudos, respectivamente. volúmenes de los tumores se midieron usando calibradores en diferentes puntos temporales después de la inoculación, y pesos de los tumores se midieron después de sacrificio. Tanto el volumen y la masa fueron notablemente más baja en los tumores de PC-3-302a que en PC-3-Scr tumores (
P Hotel & lt; 0,05; Figura 3). Tomados en conjunto, se observó inhibición de la proliferación celular obvia después de la sobreexpresión de los genes miARN-302a en células de CaP.
células PC-3-GFP y células PC-3-302a se inyectaron en la izquierda y posterior derecha del flanco de ratones BALB /c ratones desnudos, respectivamente (A, B). El volumen del tumor (C) y la masa (D) en el grupo de PC-3-302a fueron notablemente más bajo que en el grupo de PC-3-GFP. (*
P Hotel & lt; 0,05).
La sobreexpresión de los genes miARN-302a induce la detención del ciclo celular en células de CaP
Ahora se observó que la inhibición del crecimiento de células de CaP , se realizó un análisis del ciclo celular para investigar si la sobreexpresión de los genes miARN-302a dio lugar a alteraciones del ciclo celular. Como se muestra en la figura 4, la proporción de células en fase G1 aumentó notablemente en células PC-3-302a, mientras que la proporción de células en la fase S fueron notablemente menos que en el control. Se observaron resultados análogos en las células DU145-302a, lo que sugiere que los genes miARN-302a inducir eficazmente G1 detención del ciclo celular /S en células de CaP
.
La proporción de células en la fase G1 se incrementó significativamente en células PC-3-302a células (A, C) y DU145-302a (B, D) en comparación con los controles, mientras que la proporción de células en la fase S fueron notablemente menos que los controles. (* P & lt; 0,05).
Suprime
Mirna-302a
AKT
expresión atacando directamente a su 3UTR
Para detectar los mecanismos moleculares por los cuales miRNA- 302a ejerce sus funciones de regulación postranscripcional, que utilizan algoritmos bioinformáticos (http://www.targetscan.org) para buscar posibles genes diana, y encontraron que el 3UTR de
AKT
ARNm alberga un sitio de unión conservada para miRNA-302a. A continuación, se analizó la expresión de
AKT
en el nivel de ARNm y proteínas en las células PC-DU145-302a 3-302a y los controles. Como se muestra en las figuras 5A y 6, en comparación con los controles,
AKT
expresiones disminuyó significativamente en PC-3-302a y células DU145-302a, tanto a nivel de ARNm y proteína. Además,
AKT
expresión en tumores de PC-3-302a fue significativamente menor que en los tumores-Scr PC-3, según lo determinado por PCR en tiempo real y la tinción IHC (Fig 5B y 5C). Estos resultados sugieren que
AKT
expresión es downregulated por miRNA-302a en el CaP.
AKT
expresión de ARNm se suprimió notablemente en (A) PC-3-302a y DU145 células -302a, y tumores de PC-3-302a (B) (se detectaron cinco tumores independientes). (C) La inmunohistoquímica tinción indica una menor expresión de
AKT Hoteles en tumores PC-3-302a. (D) la actividad luciferasa relativa fue suprimida en particular de tipo salvaje
AKT
-3 región no traducida (UTR) las células transfectadas. (E) Representación esquemática del indicador de luciferasa, que llevó a la de tipo salvaje o mutante
AKT
3 'UTR. (* P & lt; 0,05).
análisis de Western blot mostró downregulated AKT, AKT fosforilada (pAKT) y niveles de ciclina D1 y upregulated GSK3, pGSK3β y p27
Kip1 niveles de miARN-302a que sobreexpresa células de CaP. los niveles de PI3K no se vieron afectados.
Para probar si regula los genes miARN-302a
AKT
uniéndose directamente a su 3UTR, un vector que contiene el indicador de luciferasa humana
AKT
3UTR que lleva a la secuencia de unión de tipo salvaje miRNA-302a se subclonó. Un vector de luciferasa que lleva la región mutante 7 pb complementarios a la región 5 semillas de los genes miARN-302a se generó como el reportero control (Fig 5E). En comparación con el control, la actividad relativa de luciferasa fue suprimida en un 36% (
P Hotel & lt; 0,05) en los de tipo salvaje
AKT
células 3UTR transfectadas (Figura 5D). Por lo tanto, los genes miARN-302a inhibe células de CaP a través de la orientación directa
AKT
.
Mirna-302a inducida por alteraciones del ciclo celular en células de CaP mediante la inhibición de la
AKT-GSK3-ciclina D1
y
AKT-p27
Kip1
vías
a fin de evaluar el efecto de los genes miARN-302a en el
AKT
vía de señalización, se han detectado la expresión de aguas arriba (
PI3K
) y aguas abajo (
GSK3
,
ciclina D1
y
p27
Kip1
)
AKT
efectores por Western blot. Además, también se examinaron los niveles de AKT fosforilada (pAKT) y pGSK3β. En comparación con las células de control correspondientes, tanto GSK3 y pGSK3
β
niveles, así como p27
niveles Kip1, eran notablemente elevada, mientras que pAKT y ciclina D1 se redujeron notablemente en los genes miARN-302a transfectadas PC-3 y las células DU145. Sin embargo, la expresión de
PI3K
no fue influenciada por los genes miARN-302a transfección (figura 6). A fin de confirmar estos hallazgos, se restauró
AKT
expresión mediante transfección transitoria de un
AKT Gráficos vectoriales de expresión que lleva
AKT
CD en PC-3-302a y células DU145-302a (nombre de PC-3-AKT-CDS y DU145-AKT-CDS respectivamente). Como se indica en la figura 7, después de la restauración de la expresión de AKT, tanto GSK3 y p27
Kip1 niveles se redujeron, mientras que la expresión de ciclina D1 no fue rescatado en ambos PC-3-AKT-CDS y células DU145-AKT-CDS. Teniendo en cuenta el papel fundamental de la
AKT-GSK3-ciclina D1 y AKT-p27
Kip1
vías de transición del ciclo celular de señalización, nuestros resultados sugieren que los genes miARN-302a podría inducir G1 /S detención del ciclo celular en células de CaP inhibiendo simultáneamente las teclas
AKT-GSK3-ciclina D1
y el
AKT-p27
Kip1
vía, suprimiendo así las células CaP Los análisis de la proliferación
.
Western blot mostró que la expresión de AKT rescatado, y inhibió la expresión de GSK3 y p27
niveles Kip1 por la restauración de AKT. Sin embargo, niveles de ciclina D1 no fueron rescatados.
Discusión
En este estudio, se observó que los genes miARN-302a se downregulated en los tejidos de CaP. Los análisis posteriores revelaron menor expresión en los tejidos con CaP GS ≥8 que aquellos con GS & lt; 8. La sobreexpresión de los genes miARN-302a inducida por la detención en G1 /S en células de CaP, y la proliferación de células CaP notablemente suprimida in vitro e in vivo. Por otra parte,
AKT
se reveló como un gen diana directa y funcional de los genes miARN-302a.
Durante la última década, más investigación con miRNA-302 se ha centrado en su papel en hESCs, que son caracterizado por la auto-renovación y pluripotencia. Los estudios que analizan la función de miRNA-302 en la carcinogénesis son limitados e inconsistentes. Lin et al. encontró que los genes miARN-302 podría inhibir la tumorigenicidad e inducir la apoptosis en las células MCF7 de cáncer de mama humano, teratocarcinoma embrionario Tera-2 células, y carcinoma hepatocelular células HepG2 [13]. Del mismo modo, la proliferación celular fue suprimida en las células HeLa y SiHa de cáncer cervical, así como carcinoma hepatocelular células SMMC-7721, a través de la regulación del ciclo celular [10,14]. Sin embargo, Zhu et al. observado un fenómeno inverso en las células de cáncer de colon: la sobreexpresión de los genes miARN-302b condujo a la capacidad de formación de colonias mejorada in vitro [11]. La capacidad de formación de colonias aumentada fue validado también en las células madre del cáncer de cabeza y cuello carcinoma de células escamosas [15]. Por primera vez, hemos revelado suprimimos la expresión de los genes miARN-302a en los tejidos de CaP en comparación con los tejidos normales de la próstata, y una menor expresión en tejidos con CaP GS superiores. Por lo tanto, especular que los genes miARN-302a podría desempeñar un papel importante en el desarrollo y la progresión del CaP.
En nuestro estudio, se observó un efecto inhibidor de miRNA-302a sobre la proliferación celular en las células PC-3 y DU145 CaP, a través de obstaculizar el G1 a transición de fase S, que se considera como un acontecimiento clave en la proliferación celular. De acuerdo con estudios anteriores [8,10,14], también encontramos notable regulación a la baja de
ciclina D1 Hoteles en miARN-302a que sobreexpresan células de CaP. Curiosamente, los genes miARN-302 se prevé para apuntar muchos reguladores del ciclo celular. Por ejemplo, Lin et al. demostraron que los genes miARN-302 suprime simultáneamente
ciclina E-CDK2
y
ciclina D-CDK4 /6
vías de señalización [13], y este bloqueo destino estaba regulado por varios factores de transcripción, tales como
Oct4
y
Sox2
[8]. Sin embargo, la tarjeta et al. informó de que los genes miARN-302a promueve un aumento en la fase S y una disminución de la fase G1 en hESCs, aunque
ciclina D1
fue también reprimido [8]. Claramente, la investigación adicional elucidar los mecanismos exactos de los genes miARN-302 se necesita la función.
Nuestras observaciones de que la sobreexpresión de los genes miARN-302a en células de CaP indujo inhibición del crecimiento celular in vitro e in vivo sugieren que los genes miARN-302a podría post- transcriptionally regular un gen esencial que está implicado en la proliferación celular. Como un oncogén importante,
AKT
influye en una amplia gama de funciones fisiológicas, incluyendo el metabolismo, la proliferación, la supervivencia, la angiogénesis, la migración y la invasión [16]. Del mismo modo,
AKT
fue probada para impulsar la formación de CaP en vivo [17]. Nuestros resultados indican que los genes miARN-302a suprimió la proliferación y tumorigenicidad de células de CaP a través de la
AKT-GSK3-ciclina D1
y el
AKT-p27
Kip1
vía, y por la unión directa 3UTR de
AKT
. Por otra parte, la expresión de
PI3K
, que es el principal efector aguas arriba de
AKT
y también ha demostrado ser importante en el desarrollo del CaP, no fueron afectados por los genes miARN-302. El papel regulador de los genes miARN-302 en
AKT
también fue demostrado por Cai et al: después de miRNA-302 transfección en células de cáncer de cuello uterino, se observó una expresión elevada de los inhibidores de quinasas dependientes de ciclina
p27
Kip1
y
p21
Cip1
, junto con downregulated
niveles de AKT
. Por otra parte, también demostraron que
ciclina D1
es otro objetivo de genes de miARN-302, lo que representó nuestra observación de que la expresión de ciclina D1 no fue rescatado después de la restauración AKT [10]. Por lo tanto, como un objetivo de miRNA-302,
AKT
fue notablemente suprimida y evocados alteraciones en muchas vías de señalización corriente abajo.
Nuestros resultados también dan ciertas pistas con respecto al tratamiento del cáncer miRNAs-dirigidos. Estudios previos revelaron que algunos miRNAs específicos a menudo se sobreexpresa en los tumores, mientras que la mayoría de los miRNAs se downregulated [18,19]. Se encontró la supresión Global miARN para impulsar la carcinogénesis en tanto in vitro como in vivo en modelos [20], destacando los efectos protumorigénicas siguiente miARN pérdida de función. Liang et al. observado un papel sensibilizante de terapia de reemplazo de los genes miARN-302 en las células de cáncer de mama a la radiación ionizante [21]. Otro estudio reciente informó que la entrega viral de let-7 miARN podría inhibir el crecimiento tumoral en un modelo de adenocarcinoma de pulmón de ratón [22]. Del mismo modo, nuestros resultados validaron el efecto inhibidor de la sustitución de los genes miARN-302a en células de CaP. Tomados en conjunto, estos estudios sugieren que la sobreexpresión de incluso una sola miARN en células de cáncer podría conferir un beneficio terapéutico sustancial.
En resumen, nuestro estudio demuestra que los genes miARN-302a es fundamental para el crecimiento celular mediante la regulación de CaP G1-S fase transición. la expresión de los genes miARN-302a se suprime en los tejidos de CaP, y es aún menor en los tejidos con CaP GS superiores. Además, a través de la unión directa a sus inhibe 3UTR, miRNA-302a
AKT
expresión, dando lugar a alteraciones posteriores en
AKT-GSK3-ciclina D1
y
AKT-p27
Kip1
vías. Aunque está claro que los genes miARN-302a participa en el CaP, se necesitan más estudios para explicar los mecanismos exactos que subyacen a su papel en la progresión del CaP, y así determinar su valor potencial como un marcador biológico y /o el objetivo de la intervención terapéutica.
Apoyo a la Información sobre Table S1. Características demográficas y clínico-patológicas de 44 pacientes con cáncer de próstata (CaP) guía doi: 10.1371. /journal.pone.0124410.s001 gratis (DOCX)
Reconocimientos
Los autores agradecen nuestros miembros institucionales, especialmente el Dr. Lin Sheng-Huang para la asistencia técnica.