Extracto
El microambiente tumoral está repleta de proteinasas. Como un sensor de proteinasas, proteinasa receptor 2 activado (PAR
2) desempeña un papel crítico en la tumorigénesis. Demostramos que PAR
2 y su proteinasa activación se coexpresan en diferentes líneas celulares de cáncer de colon, incluyendo HT29. La inactivación de la proteinasa o desmontables de PAR
2 de manera significativa no sólo redujo la proliferación celular in vitro, sino también la tumorigenicidad inhibido de HT29 in vivo. Además, la activación de PAR 2 síntesis de ADN
promovida y la actividad ciclina D1 upregulated tanto a nivel transcripcional y post-transcripcional. Otros estudios demostraron que los genes miARN-34a mediada
2 inducida por la regulación positiva PAR ciclina D1. La inhibición de miR-34a suprimió parcialmente la supresión de ciclina D1 inducida por PAR
2 deficiencia. Además, hemos demostrado que el TGF-β contribuyó a la regulación de miR-34a por PAR
2. Por último, en muestras de carcinoma colorrectal, la regulación positiva de PAR
2 y regulación a la baja de miR-34a se correlacionaron significativamente con el grado y la metástasis lymphomatic. Nuestros resultados proporcionan la primera evidencia de que los genes miARN media la proliferación de células cancerosas de señalización mediada por proteinasa autocrina
Visto: Ma. Y, Bao-Han W, X Lv, Su Y, Zhao X, Y Yin, et al. (2013) microARN-34a media la señalización autocrina del PAR
2-Activación de la proteinasa y su papel en la proliferación de células del cáncer de colon. PLoS ONE 8 (8): e72383. doi: 10.1371 /journal.pone.0072383
Editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Estados Unidos de América
Recibido: 3 Abril de 2013; Aceptado: 9 Julio 2013; Publicado: 26 Agosto 2013
Derechos de Autor © 2013 Ma et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por fondos del Programa de Investigación fundamental 973 clave Nacional de China (http://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx) (2012CB967003) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (http: //www.nsfc .gov.cn /Portal0 /default152.htm) (81172034, 91129717 y 81201966). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
con la finalización del proyecto del genoma humano, un total de 553 genes son anotados para ser codifica la proteinasa [1]. Identificación de receptores de proteinasa activado (PAR) revela un papel clave para proteinasas, no sólo como enzimas de proteínas que degradan, sino también como potenciales activadores del receptor que transmiten estímulos extracelulares en los eventos de señalización intracelular. PARs son siete receptores transmembrana que abarca los dominios acoplados a proteína G (GPCR) que actúan como objetivos de ciertas serina proteinasas, tales como trombina y tripsina. La escisión proteolítica de su extremo amino terminal extracelular crea el nuevo extremo amino terminal que funciona como un ligando tethered y activa el receptor. El mecanismo de activación única de PARs proporciona un nuevo mecanismo por el cual afecta el comportamiento microambiente celular. Hasta la fecha, cuatro miembros de la familia PAR han sido identificados, PAR
1 a PAR
4, todos los cuales comparten similitudes en su estructura y mecanismo de activación [2]. PAR
2 es el único miembro de la familia que no puede ser activado por la trombina. Los estudios en ratones knock-out revelaron que el PAR
2 juega un papel más importante en la formación de tumores en comparación con otros PAR [3].
PAR
2 se expresa ampliamente en el cuerpo y juega un papel crítico en diversos tipos de cáncer humano, incluyendo el cáncer de colon y de pulmón [4], [5]. PAR
2 promueve la progresión del tumor a través de una variedad de mecanismos, tales como la proliferación celular, la invasión y la metástasis. Se demostró que PAR
2 estimuló la proliferación celular en diferentes células cancerosas y surgió como un factor mitógeno potente en diferentes tipos de cáncer [6] - [10]. Otros estudios demostraron que la transactivación de EGFR [7], la activación de MAPK [9] y α integrina
5β adhesión
1 dependiente de fibronectina [10] podría mediar la proliferación celular PAR
2-estimulado. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales PAR
2 regula el ciclo celular son todavía oscuros.
Como un componente importante del microambiente, proteinasas promover la proliferación de células tumorales y conducir a un crecimiento celular descontrolado. Algunas de las proteasas son capaces de actuar como activadores endógenos de PAR
2 in vivo. Además de la tripsina, activador de plasminógeno de tipo uroquinasa (uPA) /plasmina, FXa, FVIIa, factores de tejido, matriptase y calicreínas (KLKs) pueden todos activar PAR
2 [11]. expresión extra-pancreático de tripsina se muestra en los cánceres gástricos y de colon [12], [13]. La expresión forzada de tripsinógeno aumenta dramáticamente la tumorigenicidad de células de cáncer gástrico en ratones desnudos [13]. La evidencia directa muestra que la tripsina actúa sobre PAR
2 es un factor de crecimiento muy potente para las células de cáncer de colon humano [9].
Teniendo en cuenta la omnipresencia de PAR
2, y la producción de proteasas por tumores , la existencia de un bucle autocrino no es inesperado, especialmente en carcinomas colorrectales. La expresión anormal de PAR
2 se encontró en los cánceres del tracto GI y líneas celulares de cáncer [14] - [16]. se detectó expresión de matriptase y tripsina en HT29 líneas celulares de cáncer de colon [18] DLD-1 [17] y. Más recientemente, KLK14 se encontró que se expresa y ser capaz de activar PAR
2 en células de cáncer de colon [19]. Se espera que la interacción autocrina de serina proteinasas y PAR
2 participa en las células cancerosas proliferan en el colon.
En el presente estudio, hemos demostrado que la acción autocrina de tripsina y KLK14 promovido células de cáncer de colon proliferación a través de la activación de PAR
2. La interrupción del bucle autocrino por desmontables de PAR
2 redujo el crecimiento de células de cáncer tanto in vitro como in vivo. Por otra parte, hemos demostrado por primera vez que el miR-34a, que se dirige a la ciclina D1, era esencial para el PAR
2 inducida por la proliferación celular.
Métodos y materiales
Cultivo Celular y Celular líneas
la línea de células epiteliales del colon humano HT-29, Caco-2, HCT-116, RKO y la línea celular A549 de adenocarcinoma de pulmón humano se obtuvieron de ATCC (Manassas, VA, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en la Dulbecco modificado a medio /F12 de Eagle (Hyclone) suplementado con FBS al 10% (Gibco).
Estable líneas celulares transfectantes con PAR
2 Derribo
ShRNA vector pRFP- C-R que contienen cuatro diferentes PAR
2 secuencias específicas de interferencia y la secuencia revueltos fueron adquiridos de OriGene Technologies. células HT29 fueron transfectadas con uno de los shRNAs y seleccionaron con puromicina (1 mg /ml). Cuantitativa en tiempo real PCR (QRT-PCR) y Western blot se realizaron para comprobar la expresión de PAR
2.
Productos químicos y Reactivos
Los inhibidores de tripsina (Nº Cat. T6522 y T9128) y actinomicina D se adquirieron de Sigma-Aldrich. (Cat. No. 04 693 159 001) inhibidor de proteinasa cóctel y TGF-β se compraron de Roche y amplificador de I + D; D, respectivamente. informador de luciferasa impulsado por E2F fue generosamente proporcionado por el profesor Nathalie Rivard, Universidad de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canadá. El PAR
2-selectivo péptido de activación (SLIGRL-NH
2) y la secuencia inversa de péptidos inactivos (LRGILS-NH
2) se prepararon a Shanghai Apeptide Co. Ltd. (Shanghai, China). ARNsi de la beta-catenina y el control de ARN se describió anteriormente [20].
Ética y Declaración de muestras humanas
Muestras de tejidos de treinta casos de cáncer colorrectal y de búsqueda de la mucosa normal se analizaron. Los pacientes fueron reclutados en el Hospital del Cáncer, Academia China de Ciencias Médicas, Beijing, China. Todos los pacientes recibieron ningún tratamiento contra el cáncer antes de la cirugía y los formularios de consentimiento informado firmado para la recogida de muestras. Todos los procedimientos que implican muestras humanas fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Academia China de Ciencias Médica Cancer Institute. tejidos de CRC y los tejidos normales emparejados se sumergieron en RNAlater ™ (Ambion) durante 24 h y luego se almacenaron a -70 ° C hasta su uso.
BrdU etiquetado Ensayo
Ensayo de proliferación celular se realizó con BrdU kit de ensayo de etiquetado (Roche) de acuerdo con el procedimiento del fabricante. Brevemente, las células fueron incubadas con 10 mM 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) durante 24 h. Después de la fijación, las células se incubaron con anticuerpo anti-BrdU durante 1 h. El análisis colorimétrico se realizó con un lector de microplacas Imark ™ (BioRad) después de la adición de solución de sustrato durante aproximadamente 20 min. Los datos se calcularon de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se muestran como el valor de absorbancia a 450 nm después de la sustracción de los valores para el grupo en blanco. Los experimentos para el número de células se llevaron a cabo en paralelo. Los resultados de ensayo de marcado BrdU se normalizaron con el número de células.
Formación de Colonias
Para el ensayo de formación de colonias, las células se sembraron a baja densidad (500 células /placa) y se dejaron crecer hasta visible aparecieron las colonias. Las células fueron teñidas con Giemsa y se contaron las colonias.
Análisis MTT
3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio (MTT) se llevaron a cabo ensayos para medir el número relativo de células viables. En los puntos de tiempo indicados, el medio se reemplazó con medio fresco suplementado con MTT (0,5 mg /ml) (Sigma-Aldrich). Se midió la absorbancia utilizando un lector de microplacas Imark ™ (BioRad) a una longitud de onda de 490 nm. Los experimentos se repitieron al menos tres veces.
Western Blot
extractos de proteínas de las células cultivadas se prepararon mediante la suspensión de células en tampón de lisis (0,01% de EDTA, 0,1% de Triton X-100, y 10% proteinasa cóctel inhibidor). Las concentraciones de proteínas se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de proteínas (Bio-Rad). Brevemente, se separaron 50 mg de lisados en 12% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno. Las membranas se sondaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios contra humano Ciclina D1 (1:1,000; Cell Signaling Technology), PAR
2 (N-19, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) o β-catenina (Cell Signaling Technology), seguido de incubación con anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa (Cell Signaling Technology) a una dilución 1:10,000 por 1 h. La señal se visualizó con ECL (Millipore).
Aislamiento de ARN, RT y PCR
Total de ARN, aislado a partir de células A549, células HT29 o muestras de pacientes utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen), fue tratados con DNasa I y a transcripción inversa usando un kit de transcripción (Invitrogen) para obtener total de cDNA como plantillas para la detección de ARNm, o transcritos con el kit de transcripción Takara ™ microARN para obtener ADNc como moldes para la detección de microARN.
Todos los cebadores utilizado para la PCR cuantitativa fueron adquiridos de GeneCopoeia (Fulen Gen Co. Ltd., Guangzhou, china). Cuantitativa en tiempo real PCR se normalizaron a GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) o la expresión de ARNm y U6 miARN respectivamente
Los cebadores para PCR normal tripsinógeno, KLK14 y PAR
2 fueron los siguientes:. Trysinogen sentido, 5'-TACCTTTGTTGCAGCTGCTG-3 ', y anti-sentido, 5'-CACCACCCACTGTTCGCTG-3'; KLK14 sentido, 5'-CACTGCGGCCGCCCGATC; y anti-sentido, 5'-GGCAGGGCGCAGCGCTCC-3 '; PAR
2 sentido, 5'-TGAAGATTGCCTATCACATAC-3 'y anti-sentido, 5'-TGCATTATTTTCTGATTAAGAGCC-3'. Actina se utilizó como control interno.
luciferasa reportero de ensayo
La transfección transitoria se realizó con un luciferasa impulsado por E2F como reportero para la actividad transcripcional. El agente de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen) se incubó con el ADN en medio libre de suero durante 30 min antes de ser añadido a las células. Las células se incubaron con el complejo de transfección durante 2 h. Los lisados celulares para la actividad de la luciferasa se recogieron 24 h después de la transfección, y las células se trataron con PAR
2-AP durante 3 h antes de la cosecha. Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo con un kit de ensayo de luciferasa Dual-(Promega) y los datos se normalizaron a PTK-RL.
tumorigénesis en ratones desnudos
Para los estudios in vivo, 10
6 se inyectaron las células en ratones desnudos por vía subcutánea y el crecimiento tumoral se siguió durante 3 semanas. Todo el cuidado de los animales estaba en conformidad con las directrices institucionales. El tamaño del tumor (
V
) se calculó dos veces por semana a partir de la segunda semana, utilizando la fórmula,
V gratis (mm
3) = 0,52 x (anchura)
2 × (longitud).
Análisis estadístico
Los datos se presentan como medias ± SEM. La comparación de & gt; 2 grupos se realizó mediante ANOVA, ya sea con un test post hoc de Tukey o una prueba post hoc de Dunnett. Comparación de 2 grupos se realizó mediante la prueba t de Student para datos no apareados. Un valor asociado de
p & lt;.
0,05 fue considerado significativo
Resultados
Desmontables de PAR
2 Proliferación Celular Bloqueado en células HT29
este estudio, hemos probado PAR
2 niveles de ARNm en diferentes células de cáncer de colon HT29 incluyendo, HCT116, Caco-2 y células RKO. De acuerdo con informes anteriores [18], todas las células ensayadas mostraron expresión positiva de PAR
2 (Figura 1A). La expresión de PAR endógena
2 de activación de proteinasas tripsinógeno y KLK14 También se investigaron por RT-PCR. KLK14 mRNA estaba presente en todas las células de cáncer de colon humanos analizados, mientras que la expresión tripsinógeno se observó sólo en Caco-2 y líneas de células HT29 (Figura 1A). Dado que las células HT29 presentan alta expresión tanto de tripsinógeno y KLK14, seleccionamos esta línea celular de carcinoma de colon derivados en estudio.
A. la expresión del ARNm de PAR
2, tripsinógeno, KLK14 se midió con PCR regular en líneas celulares de cáncer de colon. células de cáncer de colon B. fueron pretratadas con los inhibidores de la tripsina (T9128 y T6522) o serina proteinasas (cóctel inhibidor de proteinasa, PIC) y la proliferación celular se midió mediante el ensayo de MTT. La expresión de ARNm de C PAR
2 en células transfectantes estables (PAR
2-1 y PAR
2-2) se midió por PCR en tiempo real. HT29 RS representa las células de control transfectadas de forma estable con RNA control mezclado. el nivel de proteína de PAR
2 se midió mediante Western Blot y se muestran como inserto. El efecto de PAR
2 desmontables sobre la proliferación celular se midió mediante el ensayo de MTT (D) y (E) la formación de colonias en las células HT29. F. Las células (10
6) se inyectaron por vía subcutánea en ratones desnudos, se midieron los volúmenes de los tumores como se indica y pesos de los tumores se determinaron en el sacrificio. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01 Todos los datos se muestran como media ± SEM. N = 3-6. Todos los experimentos se repitieron al menos 3 veces de forma independiente.
Para determinar si el PAR
2 bucle autocrino-proteinasa es crucial para la proliferación celular, se utilizaron dos métodos para romper el bucle autocrino. En primer lugar, diferentes inhibidores se utilizaron para bloquear la actividad de proteinasa. Se aplicaron dos inhibidores de la tripsina (T6522 y T9128) y un cóctel de inhibidores de proteinasa (PIC) para bloquear conocidos y desconocidos de la proteinasa de la serina que puede activar PAR
2, y todos ellos bloquearon significativamente la proliferación de células HT29 tal como se mide mediante el ensayo de MTT ( Figura 1B). En segundo lugar, PAR
2 de expresión estable fue derribado en células HT29 (Figura 1C). análisis MTT y la formación de colonias se indica respectivamente que desmontables de PAR
2 bloquearon la proliferación celular (Figura 1D) y la capacidad de formación de colonias (Figura 1E) in vitro. Lo más importante, desmontables de PAR
2 en células HT29 redujo significativamente el crecimiento tumoral en ratones desnudos (Figura 1F). Estos datos indicaron que la activación autocrina de PAR
2 por sus proteinasa activación promover la proliferación de células de cáncer de colon tanto in vitro como in vivo.
Ciclina D1-E2F vía mediada por PAR
2 mediada por la proliferación de células
Para determinar los mecanismos moleculares que subyacen a los efectos de PAR
2 de activación en la proliferación, se utilizó la línea celular de carcinoma de pulmón humano A549 derivadas de epitelio, que expresa PAR
2 pero no la proteinasa de activación. El ensayo etiquetado BrdU mostró que el selectivo PAR
2-péptido activador (PAR
2-AP), pero no el péptido de secuencia inversa (RP), indujo un aumento significativo en la síntesis de ADN (Figura 2A). Además, PAR
2 de activación aumentó significativamente Ciclina D1, tanto en el ARNm y los niveles de proteína (Figura 2B y C). Estos resultados sugieren que la activación de PAR
2 promueve el ciclo celular en la transición G1 /S de control.
A549 células fueron tratadas con péptido PAR
2 activación (PAR
2-AP, 50 mM) o revertir péptido (PAR
2-RP) durante 24 h. A. síntesis de ADN se midió por assay.B etiquetado BrdU. Se detectaron niveles de ciclina D1 y ciclina E mRNA con PCR después del tratamiento con o sin PAR
2-AP. C. nivel de proteína de la ciclina D1 se determinó mediante Western blot. las células A549 se trataron con D. PAR
2-AP (50 M) 24 h después de la transfección transitoria con E2F-luciferasa (1 mg /pocillo). Los datos se normalizaron con tk-RL y se muestra como el porcentaje del grupo de control. células de E. HT29 fueron tratados con PIC (inhibidor de proteinasa cóctel) o T9128 (inhibidor de tripsina). la síntesis de ADN se midió por el ensayo de marcaje con BrdU. F. Proteína (izquierda) y los niveles de ARNm (derecha) de la ciclina D1 en las células PAR se midieron
2 knockout. *
p Hotel & lt; 0,05, ***
p Hotel & lt; 0,001 Todos los datos se muestran como media ± SEM. N = 3-6. Todos los experimentos se han repetido al menos 3 veces de forma independiente.
En general, la activación del complejo ciclina /CDK puede causar la hiperfosforilación de pRb que conduce a la activación de la transcripción E2F y encender los genes diana aguas abajo, tales como la ciclina E. El ensayo de informador de luciferasa mostró que la activación de PAR
2-AP de PAR
2 elevada actividad transcripcional E2F (Figura 2D), junto con una elevación simultánea de la expresión de ciclina E mRNA (Figura 2B). Estos resultados indican que la activación de PAR
2 promueve la proliferación celular a través de la señalización de E2F ciclina D1 /.
Además, hemos probado si la ciclina D1 juega un papel en el PAR
2 activación automática en las células HT29. El tratamiento con PIC o inhibidor de tripsina suprimió significativamente la síntesis de ADN en las células HT29 (Figura 2E). El nivel de expresión de ciclina D1 en las células PAR
2 desmontables también se downregulated en la proteína y los niveles de mRNA (Figura 2F). Estos hallazgos sugieren que la ciclina D1 mediada la proliferación celular inducida por 2-PAR
.
PAR
2 regula la expresión de ciclina D1 en los niveles transcripcional y post-transcripcional
Para entender el mecanismo por el el cual PAR
2 regula la activación de ciclina D1 expresión, hemos utilizado células A549 que no tengan un bucle autocrino. En primer lugar, las células A549 fueron pretratadas con actinomicina D para inhibir la transcripción. La inhibición de la transcripción completamente bloqueado PAR
2 inducida por ciclina D1 en el ARNm (Figura 3A), pero no a nivel de proteínas (Figura 3B). Por otro lado, desmontables de β-catenina, que es un factor de transcripción clave para la inducción de la ciclina D1, también completamente bloqueada la expresión de ciclina D1 mRNA (Figura 3C). Estos resultados sugirieron que β-catenina mediada la PAR upregulation
2 inducida de la ciclina D1 en el nivel transcripcional. Sin embargo, desmontables de β-catenina sólo modestamente reducida ciclina D1 a nivel de proteínas (Figura 3D), lo que indica que Ciclina D1 también se reguló por PAR
2 a nivel post-transcripcional.
se trataron previamente las células A549 con actinomicina D (2 mg /ml) 30 min antes de la estimulación con PAR
2-AP (50 mM) durante 24 h. niveles (A) ARNm y proteínas (B) de la ciclina D1 se detectaron mediante PCR en tiempo real y Western Blot. siRNA dirigidos beta-catenina se transfectó en células A549 24 h antes del tratamiento con PAR
2-AP. (C) mRNA y (D) los niveles de proteína de la ciclina D1 se detectaron por PCR en tiempo real y Western Blot, respectivamente.
Se ha informado de que la fosforilación de la ciclina D1 está implicado en su degradación. Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en fosfo-ciclina D1 después de PAR
2 de activación (datos no mostrados).
MiRNAs Mediate PAR
2 inducida por la expresión de ciclina D1
Además de la modificación de proteínas, microRNAs (miRNAs) están emergiendo como importantes reguladores de la expresión génica mediante la escisión de ARNm diana o mediante la inhibición de su traducción. De hecho, varios microRNAs habían sido demostrado para regular ciclina D1 expresión directamente [21]. Para determinar si los miRNAs fueron regulados por PAR
2, se han detectado los niveles de miR-15a, miR-16 y miR-34a en células PAR 2
desmontables y PAR
2 células activadas. PCR en tiempo real mostró que el nivel de miR-34a, pero no miR-15a y miR-16, fue elevado dramáticamente en PAR
2 desmontables células HT29 (PAR
2-1 y PAR
2-2 ) en comparación con células de control revueltos RNA (RS) (Figura 4A). Además, PAR
2 de activación se redujo significativamente la expresión de miR-34a en las células A549 (Figura 4B). Para probar si miR-34a puede ser regulada por proteinasas HT29 derivada, que hambre células HT29 de 3 h, 24 h y 48 h para acumular el PAR
2 de activación de proteinasas (tripsina y KLK14) en medio. PCR cuantitativa mostró que el nivel de expresión de miR-34a se downregulated con el tiempo (Figura 4C). Inhibidor de miR-34a que redujo el nivel de miR-34a (Figura 4D, panel superior) restaurado parcialmente la regulación a la baja de la ciclina D1 en las células PAR
2 desmontables (Figura 4D, panel inferior). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que miR-34a mediada upregulation
2 inducida por PAR de la ciclina D1.
(A) RNA total de HT29, HT29 RS (revueltos ARN de control) y dos clones diferentes de estable se recogieron células transfectantes con PAR
2 desmontables (PAR
2-1 y PAR
2-2). Los niveles de miRNAs específicos se midieron con PCR en tiempo real. (B) las células A549 se trataron con PAR
2-AP para 24 h. (C) HT29 se incubaron las células con DMEM /F-12 medio sin FBS durante el tiempo diferentes como se indica. (D) La transfección de inhibidor de miR-34a o ARN de control (C-ARN) con Lipofectamin2000 en HT-29-RS o HT-29-PAR-2. Tres días más tarde las células se recogieron para el ensayo. Los niveles de miARN se midieron con PCR en tiempo real y se normalizó con U6. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01 Todos los datos se muestran como media ± SEM. N = 3-6.
TGF-β mediada por PAR-2 relacionados
Expresión miARN-34a
La siguiente pregunta es cómo PAR activación
2 regula la expresión de miR-34a. El tratamiento con medio condicionado de células HT29 de control (HT-29-R) redujo significativamente el nivel de expresión de miR-34a que fue upregulated de desmontables de PAR
2 en las células HT29 (HT-29-PAR-2) (Figura 5A). Desde TGF-β se ha informado a disminuir la expresión de miR-34a recientemente (39), el papel de TGF-β en la expresión miR34a relacionados PAR-2-fue probado. En primer lugar, se encontró que TGF-β (5 ng /ml) fue capaz de disminuir la expresión de miR-34a tanto en PAR
células HT29 2 deficientes (HT-29-PAR2) (Figura 5B) y en células A549 (Figura 5C). Lo más importante, el agotamiento de TGF-β a partir del medio condicionado de HT-29-RS por el anticuerpo anti-TGF abolió efecto inhibidor de medio condicionado a la expresión de miR-34a (Figura 5D). Todos estos indican fuertemente que el TGF-β mediada por la regulación de miR-34a inducida por PAR
2 de activación.
(A) HT-29-RS o células HT-29-PAR-2 fueron tratados con medio condicionado de células HT-29-RS (CM-RS) durante 3 días. (B) HT-29-PAR-2 células se trataron con TGF-β (5 ng /ml) durante 12 horas. células A549 (C) se trataron con TGF-β (5 ng /ml) durante 6 horas. (D) medio condicional de HT-29-RS (CM-RS) se incubó con anticuerpo β y la proteína anti-TGF A /G agarosa a 4 ° C durante 2 horas. Después de centrifugación, el sobrenadante se utilizó (CM-RS-anti-TGF β) para el tratamiento de células HT-29-PAR-2 durante 3 días. Después de que los diferentes tratamientos como se mencionó anteriormente, las células se recogieron para el ensayo de miR-34a con PCR en tiempo real. *
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01 Todos los datos se muestran como media ± SEM. N = 4-8.
Correlación de PAR
2, tripsinógeno, KLK14, ciclina D1 y miR-34a en muestras de cáncer de colon
Para comprender mejor el papel biológico del PAR
2 de señalización autocrina en la carcinogénesis colorrectal humano, los niveles de expresión de PAR se midieron
2 y sus proteinasa activantes en muestras de 30 pares de T3 humana de cáncer colorrectal (CRC). Regular RT-PCR fue empleado para detectar la expresión de mRNA de tripsinógeno y KLK14 en muestras de CRC y mostró que casi todas las muestras expresan PAR
2 de activación de la proteinasa (Figura 6A). El setenta por ciento (21/30) de las muestras de CRC humanos mostró expresión tripsinógeno elevada en los tejidos tumorales en comparación con tejidos de colon normales emparejados, mientras que los tejidos normales casi no mostraron expresión tripsinógeno. PCR en tiempo real demostró que PAR
2 se expresa ampliamente en la mucosa normal y muestras de CRC primarias. Como se muestra en la Figura 6B, PAR
2 se encontró que era, en promedio, de manera significativa (
p
& lt; 0,05) sobreexpresado en muestras de CRC con un mayor grado de desarrollo, mientras que CyclinD1 y miR-34a no mostraron significativo cambios (Figura 6B). Curiosamente, los niveles más altos de PAR
2, ciclina D1 y un menor nivel de miR-34a se correlacionaron significativamente con la metástasis de los ganglios linfáticos en muestras de CRC (Figura 6C). Tomados en conjunto, estos datos validan que el bucle autocrino de PAR
2 y su proteinasa de activación puede promover el desarrollo tumoral y la invasión del cáncer en muestras de CRC humanos.
(A) La expresión de tripsinógeno y KLK14 en el CCR humana muestras de tumor (T) y el tejido normal apareado (N) se midieron con PCR. Actina se utilizó como control interno. La expresión de mRNA PAR
2, CCND1 y el nivel de miR-34a en muestras de CRC humanos se pusieron a prueba con PCR en tiempo real. Fueron comparados de acuerdo con (B) el grado o (C) la situación de la metástasis de los ganglios linfáticos. Los datos se muestran como el pliegue del cambio de muestra del tumor (T) para emparejado tejido normal (N).
Discusión
Los microARN (miRNA) se expresan de manera endógena 17-25 nucleótidos, ARN no codificante y regular la expresión génica a nivel post-transcripcional. Desde la primera miRNA, lin-4, fue descubierto en 1993 [22], [23], aproximadamente 1.000 miRNAs han sido identificados en los seres humanos [24] y puede dirigirse a más del 30% de todos los genes y una mayoría de vías genéticas [25] , [26]. En la última década, han surgido miRNAs como reguladores críticos en el cáncer [27] y están implicados en el desarrollo de una variedad de cánceres, incluyendo el carcinoma colorrectal [28]. aumento de la evidencia indica que los miRNAs específicos se correlacionan con el estadio de la enfermedad, la metástasis y la supervivencia en el CCR. Hasta la fecha, hay 118 miRNAs todos los cuales han sido verificados y están asociados con el desarrollo de CRC [29]. Algunos de función de miRNAs como supresor de tumores, tales como let7a, miR-34 a /b /c, miR-126, miR-143, miR-145 y miR-200 de la familia, mientras que se piensa que algunos de ellos para ser oncogénico, tales como el cúmulo de miR-17-92, miR-21 y miR-135.
la proliferación celular incontrolada es una característica del cáncer. Un número de miRNAs han sido identificados que regulan el ciclo celular. Algunos de los miRNAs promover la proliferación celular, tal como miR-125 ter [30], mientras que algunos de ellos inducir la detención del ciclo celular. Por ejemplo, Let-7 se ha encontrado que es un supresor potente de crecimiento en diferentes células del cáncer [31], [32]. Dos relacionados miRNAs miR-143 y miR-145 se han encontrado para suprimir el crecimiento en parte a través de la orientación ERK5 [33]. La trombina se ha demostrado que estimula la proliferación celular a través del aumento de miR-222 que puede inhibir la expresión de p27 [34]. El presente estudio demostró que la serina proteinasa activa PAR
2 y también fue capaz de afectar el nivel de miRNAs, que funcionalmente mediada crecimiento celular en las células cancerosas (Figura 7).
Como un regulador clave de G1 /S de control, ciclina D1 puede ser objetivo de varios miRNAs. MiR-15a y miR-16 se eliminan con frecuencia o las reguladas y estos eventos correlacionan inversamente con la expresión de ciclina D1 en el cáncer. Otros estudios demostraron que la ciclina D1 está regulada directamente por el miR-15a y miR-16 [35]. Además, la expresión de ciclina D1 puede ser regulada por el miR-200b y Let-7b apuntando Rho GTPasa de la familia 3 (Rnd3) [36], [37]. En el presente estudio, se detectaron miR-15a y miR-16. Sin embargo, no hubo ningún cambio significativo en sus niveles de expresión después de PAR
2 de activación en las células A549 (Figura 3F) o después de PAR
2 knowdown en las células HT29. Por otra parte, no hubo ningún cambio significativo de miR-200b y Let-7b (datos no mostrados), ni hubo ningún cambio consistente en la expresión del gen diana, Rnd3, tal como se determina mediante transferencia Western y ensayo indicador de luciferasa con 3 'UTR de Rnd3 (datos no mostrados). Se da a entender que el miR-15a, miR-16 y miR-200b no son los mediadores de la regulación al alza PAR
2 inducida por la ciclina D1.
miR-34a pertenece a la familia de miR-34, que también incluye miR-34b y miR-34c. Los bajos niveles de miR-34 con frecuencia se han observado en varios tumores, incluyendo CRC [38]. La inactivación de miR-34a endógena estimula la proliferación celular y la inhibe la apoptosis dependiente de p53 a través de la orientación de ciclina E2, quinasas dependientes de ciclina 4/6 (CDK4 /6) [38]. Nuestro estudio ha demostrado, por primera vez, que el miR-34a mediado el bucle autocrino de PAR
2 y su proteinasa de activación, que se requiere para mantener la proliferación de células de cáncer de colon.
La activación de ERK y la transactivación de EGFR se han demostrado estar involucrados en el efecto proliferativo de PAR
2 [7], [9]. Sin embargo, en el estudio actual, ni el inhibidor de ERK (PD98059 y U0126) ni el inhibidor de la tirosina quinasa de EGFR (AG1478) fueron capaces de bloquear la proliferación celular o el cambio en la expresión de miR-34a en HT29 y las células A549 (no datos mostrado). Se da a entender que la regulación de miR-34a no dependía de EGFR y ERK después de PAR
2 de activación en las células cancerosas.
Recientemente, se ha informado de que la actividad TGF-β elevado suprime la expresión de microARN-34a en el tejido hepático [39]. Además, PAR
2 de activación se ha demostrado que aumentar la producción de TGF en ratones [40]. Por lo tanto, no se sorprende de que TGF media la supresión de miR-34a inducida por la activación de PAR
2 en el estudio actual. Además, la activación constitutiva de PAR
2 debido al bucle autocrino de PAR
2 y su proteinasa activación puede contribuir en parte al bajo nivel de miR-34a, que es común en varios tipos de cáncer, como el cáncer de colon.
Dadas las funciones emergentes de PAR
2 en el cáncer, PAR
2 se ha convertido en diana atractiva para la terapia del cáncer. PAR
2 se expresó en términos generales en el cáncer y positivamente correlacionado con la progresión del tumor en el CCR. Más importante aún, PAR
2 se activó no sólo por proteinasas del microambiente del cáncer, sino también, como nuestro estudio muestra, por proteinasas producidas por las propias células cancerosas. Por otra parte, teniendo en cuenta la regulación de los genes miARN PAR
2 de activación que ahora hemos descrito, se espera un efecto más amplio sobre la proliferación después de la orientación PAR
2 de activación en las células cancerosas. Con la mejora del PAR
2 antagonistas actualmente en desarrollo, PAR
2 será un buen objetivo para la terapia del cáncer en el futuro.
Reconocimientos
Agradecemos al profesor Nathalie Rivard,