Extracto
microARN-34a (miR-34a), un potente mediador de p53 supresor de tumores, se ha informado para funcionar como un supresor de tumores y miR-34a se encontró que se downregulated en tejidos de cáncer de próstata. Se estudiaron los efectos funcionales de miR-34a en los complejos de transcripción c-Myc en células PC-3 con cáncer de próstata. La transfección de miR-34a en células PC-3 inhibió fuertemente
in vitro
la proliferación celular, la invasión celular y la apoptosis promovida. La transfección de miR-34a en células PC-3 también inhibió significativamente
in vivo de xenoinjertos
el crecimiento tumoral en ratones desnudos en. miR-34a downregulated expresión de c-Myc oncogén apuntando su 3 'UTR tal como se muestra por los ensayos de reportero de luciferasa. Se encontró miR-34a para reprimir RhoA, un regulador de la migración celular y la invasión, suprimiendo complejo transcripcional de c-Myc-Skp2-Miz1 que activa RhoA. La sobreexpresión de c-Myc invierte la supresión de miR-34a de la expresión de RhoA, lo que sugiere que el miR-34a inhibe la invasión por la supresión de RhoA a través de c-Myc. miR-34a también se encontró a reprimir c-Myc-pTEFb complejo de elongación de la transcripción, lo que indica uno de los mecanismos por los que el miR-34a tiene profundos efectos en la función celular. Este es el primer informe para documentar que miR-34a suprime el montaje y la función del complejo c-Myc-Skp2-Miz1 que activa RhoA y el complejo de c-Myc-pTEFb que alarga la transcripción de diversos genes, lo que sugiere un nuevo papel de miR 34a en la regulación de la transcripción de c-Myc complejo
Visto:. Yamamura S, S Saini, Majid S, Hirata H, K Ueno, Deng G, et al. (2012) microARN-34a modula la transcripción de c-Myc Complejos para Suprimir malignidad en las células del cáncer de próstata humano. PLoS ONE 7 (1): e29722. doi: 10.1371 /journal.pone.0029722
Editor: Alfons Navarro, Universidad de Barcelona, España |
Recibido: 27 Diciembre, 2010; Aceptado: 3 de diciembre de 2011; Publicado: enero 3, 2012
Derechos de Autor © 2012 Yamamura et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por becas R01CA138642, T32DK007790 (NIH), el Programa de Premios Mejoramiento de la Investigación VA (REAP) y becas al mérito de revisión. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
microARNs (miRNAs) están altamente conservadas, de cadena simple, ARN no codificante de aproximadamente 22 nucleótidos que regulan la expresión génica mediante silenciamiento postranscripcional de los ARNm diana específicas, mediante la represión de la traducción o escindir transcritos de ARN [1]. miRNAs regulan diversos procesos celulares tales como la progresión del ciclo celular, la proliferación, la apoptosis y el desarrollo. miRNAs se han demostrado que funcionan como oncogenes o genes supresores de tumores [2].
Se elimina el supresor de tumores p53 o mutado en más del 50% de los tumores humanos y es una molécula clave que suprime tumores malignos [3]. p53 se ha encontrado para apuntar a la familia miR-34 [4], [5], [6] y la expresión ectópica de miR-34 genes tiene efectos drásticos sobre la proliferación celular y la supervivencia. Ectópica de miR-34a provoca la detención del ciclo celular en la fase G1 [6], [7] y la apoptosis [7], [8]. Como p53 se ha encontrado para orientar miR-34a y desde, la detención del ciclo celular y la apoptosis también se terminará puntos de activación de p53, el gen miR-34a puede ser un mediador de la función de p53.
El proto-oncogén c-Myc regula la proliferación celular y la transformación tanto transcriptionally y no transcripcionalmente y está desregulado con frecuencia en los cánceres humanos [9], [10]. c-Myc es un factor de transcripción hélice-bucle-hélice y cremallera de leucina básica que se une a elementos potenciadores de la caja (E-cajas) y activa la transcripción de genes que estimulan la progresión del ciclo celular y el crecimiento celular. c-Myc suprime la transcripción de genes que detienen el ciclo celular, a través de Miz1, la proteína c-Myc asociado. c-Myc también tiene una función para reclutar a las histonas acetiltransferasas (HAT). c-Myc interactúa no transcripcionalmente con componentes de la maquinaria de replicación para regular positivamente la síntesis de ADN, que conduce a inestabilidades genómicas.
se informó de c-Myc para activar miR-17-92, un grupo microRNA policistrónico que consiste en el miR -17, 18a, 19a, 20a, 19b y 92a [11], [12]. miR-19 se encontró siendo el principal componente oncogénico de este grupo, la orientación del supresor de tumores PTEN [13]. miR-34c se ha demostrado que regulan negativamente c-Myc en respuesta al daño del ADN y para inhibir la síntesis de ADN inducida por c-Myc [14]. Durante la senescencia inducida por oncogenes, también se encontró miR-34a para apuntar c-Myc [15].
Rho GTPasas son pequeñas proteínas G que regulan diversos procesos celulares, incluyendo la dinámica del citoesqueleto, la migración, el tráfico de vesículas, la proliferación celular , apoptosis, y la transcripción [16], [17], [18]. Rho GTPasas, sus reguladores, y sus efectores se han sugerido para controlar la formación y progresión del tumor. RhoA se ha demostrado que el control de metástasis de cáncer y la progresión [19], [20], [21]. Recientemente, se encontró complejo c-Myc para activar el gen de RhoA [22].
Lo positivo elongación de la transcripción del factor b (P-TEFb) regula la liberación de pausa próxima al promotor de la fase de elongación de la transcripción de Pol II [23] e integra la síntesis de ARNm con la modificación de histonas, el procesamiento de pre-ARNm y ARNm de exportación [24]. P-TEFb se compone de ciclina (CycT1, CycT2a, CycT2b o CycK) y la quinasa dependiente de ciclina 9 (Cdk9) [23]. c-Myc interactúa con ciclina T1 (CycT1), el componente regulador de la P-TEFb, y controla la fase de elongación de la transcripción de Pol II [25], [26], [27].
El c- vía Met se desregula en la mayoría de tumores malignos humanos y regula la formación y progresión del tumor [28], [29]. c-Met interacciona con el factor de crecimiento de hepatocitos /factor de dispersión y se ha implicado en la invasión tumoral y la migración incluyendo células PC-3 [30], [31], [32], [33], [34], [35].
se presenta aquí que el miR-34a se downregulated en tejidos de cáncer de próstata. miR-34a inhibe la proliferación celular
in vitro
,
in vivo
crecimiento del tumor y promueve la apoptosis en células de cáncer de próstata. También encontramos el miR-34a objetivos de c-Met e inhibe PC-3 invasión celular. Se investigaron los efectos de miR-34a en los dos complejos de transcripción c-Myc. Al dirigirse a c-Myc, miR-34a reduce el complejo c-Myc-Miz-Skp2 que induce la transcripción RhoA y la invasión de células inhibida, lo que demuestra que el miR-34a regula indirectamente RhoA. miR-34a también suprimió el complejo de c-Myc-P-TEFb que juega un papel clave en el control de la fase de elongación de la transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II), lo que indica uno de los mecanismos por los que miR-34a tiene efectos dramáticos en celular función. Nuestros resultados demuestran que en el cáncer de próstata células PC-3 miR-34a suprime el montaje y la función del complejo c-Myc que se activa o se alarga la transcripción, revelando un nuevo papel de miR-34a en la regulación de la transcripción por c-Myc.
resultados
miR-34a está regulado por disminución en el cáncer de próstata
se examinaron los niveles de expresión de miR-34a en la captura por láser microdissected (LCM) los tejidos de cáncer de próstata (n = 10) y emparejados regiones normales adyacentes mediante PCR en tiempo real. Todos los tejidos de cáncer mostraron niveles de miR-34a más bajas en comparación con las regiones adyacentes normales emparejados, lo que demuestra que el miR-34a está regulado por disminución en el cáncer (fig. 1A). datos histológicos muestran que estos tejidos son el adenocarcinoma con puntuación de Gleason de 6 o 7. Los patrones de Gleason y otros datos clínicos se muestran en la Tabla S1.
(A) relativa expresión de miR-34a en la captura por láser microdissected (LCM) de próstata tejidos de cáncer de (C) y las regiones adyacentes normales emparejados (N). (B) la sobreexpresión de miR-34a suprime la formación de colonias en agar blando de una línea celular de miR-34a PC-3 transfectadas de forma estable. Después de 14 días de incubación, se contaron las colonias con más de 50 células. Los valores se normalizan a los de control. (C) Imágenes representativas de las colonias. inhibe (D) miR-34a
in vivo
el crecimiento del tumor. Evolución temporal de crecimiento tumoral en ratones desnudos después de la inyección subcutánea de una línea de células de la línea celular de miR-34a PC-3 o el control transfectadas de forma estable. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control. (E) Imágenes representativas de tumores en ratones desnudos a las 5 semanas después de la inyección subcutánea de una línea de células transfectadas establemente miR-34a línea celular PC-3 o el control. (F) de miR-34a induce la apoptosis en las células PC-3. PC-3 células fueron transfectadas con el control pre-MIR negativo (CN) o pre-miR-34a durante 3 días. PC-3 células fueron teñidas con FITC-AnnexinV /7-AAD y la apoptosis se analizaron mediante citometría de flujo. Los datos muestran el porcentaje de células apoptóticas y apoptóticas tempranas de la población celular total de células PC-3. *, P & lt;. 0,05 en comparación con el control
También ensayaron los niveles de expresión de miR-34a en las células y RWPE-1 de la próstata no maligno maligno (, células LNCaP y DU145 PC-3). Real-time RT-PCR reveló que el nivel de expresión de miR-34a era notablemente inferior en las células PC-3 en comparación con células no malignas de células de próstata epitelial RWPE-1 (datos no presentados). Este resultado fue consistente con los datos previamente comunicados utilizando PrEC de próstata humano células epiteliales normales [36]. También se compararon los niveles de expresión de miR-34a en las células malignas de próstata y la microdissected captura por láser (LCM) los tejidos normales de la próstata (n = 10). Real-time RT-PCR mostró que el nivel de expresión de miR-34a fue menor en las células malignas de próstata en comparación con la media del nivel de expresión de miR-34a en los tejidos normales (datos no mostrados). Estos resultados también fueron consistentes con la cifra reportada previamente de datos utilizando tejidos humanos normales [37].
miR-34a inhibe la proliferación celular de las células PC-3
Para estudiar el efecto de miR-34a en el crecimiento de células de cáncer de próstata, transfectadas transitoriamente varias líneas celulares con control de pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a. La transfección transitoria de pre-miR-34a aumento de los niveles de miR-34a en células de cáncer de próstata (Fig. S1A). ensayo de MTS mostró que miR-34a inhibió la proliferación de células PC-3 en aproximadamente un 40% en el día 4 pero no tuvo efecto significativo en células LNCaP y DU145 (Fig. S2A). Un informe reciente indica que PC-3 células tienen características de carcinoma de células pequeñas prostático y no de adenocarcinoma [38], sin embargo hemos utilizado células PC-3 para el estudio adicional debido a que el efecto de supresión de la proliferación de miR-34a fue significativa, lo cual era consistente con los datos de informes anteriores [36]. La transfección transitoria de pre-miR-34a también causó cambios morfológicos significativos en las células PC-3 (Fig. S2B).
Se empleó un sistema lentiviral expresar miR-34a. El sistema lentiviral VIH, expresando el miR-34a o el control de vectores, se utilizó para infectar células PC-3 y se seleccionaron las células infectadas con puromicina. La transfección estable de pre-miR-34a aumento de los niveles de miR-34a en células PC-3 (Fig. S1B). Se realizó el ensayo de formación de colonias en agar blando utilizando las células PC-3 infectadas que expresan el miR-34a o control. miR-34a reducido número de colonias a aproximadamente 20% de la de control, mostrando que miR-34a inhibió significativamente la colonia capacidad de las células PC-3 (Figs. 1B y C) que forma.
Para examinar los efectos de la expresión ectópica de miR-34a en
in vivo
el crecimiento del tumor, se inyecta por vía subcutánea el establo de miR-34a o la línea celular de control en ratones desnudos. Los volúmenes tumorales se midieron cada 7 días durante 5 semanas después de la inyección. xenoinjertos de tumores de células PC-3 que sobreexpresan el miR-34a eran más pequeños que los xenoinjertos de tumores de las células de control. En la semana 5, tamaños de los tumores de xenoinjertos de control fueron aproximadamente 5 veces mayores que los de xenoinjertos de miR-34a, lo que indica que la expresión ectópica de miR-34a suprimió significativamente el crecimiento del tumor in vivo (Figs. 1D y E).
Dado que la expresión ectópica de miR-34a suprime la proliferación de células PC-3, el próximo estudiaron los efectos de miR-34a en la apoptosis en células PC-3 usando citometría de flujo. Se encontró que la expresión ectópica de miR-34a aumentó PC-3 apoptosis de las células de about4 tiempos de que los controles (fig.1F y Fig. S3), lo que demuestra que el miR-34a tiene actividad apoptótica en células PC-3.
miR-34a inhibe la invasión celular y la migración
Se realizó un ensayo de invasión transwell usando Matrigel para investigar el efecto de miR-34a en la capacidad invasiva de las células PC-3. Estamos transfectadas transitoriamente células PC-3 con el control pre-MIR negativo (CN) o pre-miR-34a y se sometieron las células transfectadas para transwell ensayo de invasión. Los resultados revelaron claramente que miR-34 reduce la invasión de células PC-3 a 20% de la de los controles (Figs. 2A y B). Cicatrización de heridas ensayo también mostró que el miR-34a reduce notablemente la migración de las células PC-3 (Fig. 2C y D).
(A) miR-34a inhibe la invasión de células PC-3. las células PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a para 48 h. Las células se recogieron y se sometieron a ensayo de invasión Transwell. Los valores se normalizan a los de NC. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control. (B) Imágenes representativas de las células invadidas. (C) miR-34a inhibe la cicatrización de heridas de células PC-3. las células PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a para 48 h. Las células se recogieron y se sometieron a la herida de curación de ensayo. La anchura de la herida abierta restante calculado en relación a la separación en el tiempo 0 h. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control. (D) Imágenes representativas de la herida ensayo de curación.
objetivos de miR-34a c-myc y c-Met
Los oncogenes, c-Met y c-Myc, han predicho vinculante sitios de miR-34a en sus 3'-UTR (Fig. S4). c-Met tiene 2 predijo sitios de unión de miR-34a en su extremo 3 'UTR (Fig. S3). Hemos clonado los objetivos de miR-34a putativos en la 3'UTRs en un constructo de luciferasa. los ensayos de reportero de luciferasa con miR-34a-que expresan las células PC-3 mostraron que el miR-34a reprimió la actividad de luciferasa. La mutación de los sitios diana de miR-34a putativos en estos UTRs disminuyó la respuesta a miR-34a. Estos resultados indican que miR-34a se une al extremo 3 'UTRs de c-myc y c-Met (Fig. 3A).
células (A) PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con control negativo pre-MIR (NC) o pre-miR-34a o pre-miR-con de 8 h, seguido por transfección transitoria con plásmidos informadores de control o plásmidos 3'UTR de 48 h. actividad de reportero 3'UTR se midió por ensayo de luciferasa y se normalizaron a la actividad de luciferasa de Renilla. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control. (B) las células PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con pre-MIR control negativo (NC) o pre-miR-34a o pre-miR-aire durante 72 horas. nivel de expresión de la proteína se analizó por Western blot.
Hemos examinado los efectos de la transfección de miR-34a en los niveles de proteína de estos genes. La transfección de miR-34a reduce los niveles de proteína de c-Met y c-Myc, la proteína en las células PC-3 (Fig. 3B). Estos resultados confirman que miR-34a se dirige directamente a c-Met y c-Myc a través de la unión a sus 3'UTRs en células PC-3. miR-34a también redujo los niveles de factor de transcripción E2F1 que regula el ciclo celular, la replicación del ADN celular y la proliferación (Fig. 3B).
miR-34a inhibe RhoA y suprime el montaje de c-Myc complejo transcripcional
El complejo transcripcional de c-Myc-Skp2-Miz1 se ha encontrado para activar RhoA gen y para ser crítica para la invasión de células y el cáncer de metástasis [22]. Como hemos constatado que c-Myc es un objetivo de miR-34a, por lo tanto la regulación negativa de la expresión de c-Myc, se examinó si la regulación a la baja de c-Myc por los resultados de miR-34a en la reducción de la expresión de RhoA por la supresión de montaje de la c- compleja myc-Skp2-Miz1. PCR en tiempo real mostró miR-34a disminución del nivel de RhoA mRNA (Fig. 4A) y Western blot reveló que el miR-34a reducida expresión de la proteína RhoA (Fig. 4B).
PC-3 células fueron transfectadas transitoriamente con pre -miR control negativo (NC) o pre-miR-34a durante 72 h. nivel (A) RhoA ARNm fue analizado por PCR en tiempo real. expresión de la proteína (B) RhoA se analizó por transferencia Western. (C) c-Myc tira hacia abajo endógena Miz1, Skp2 y Max en las células PC-3. las células PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a durante 72 h y los lisados de células totales se inmunoprecipitaron con anticuerpo c-Myc o IgG (control), seguido por análisis de transferencia Western. (D) de miR-34a disminuye el reclutamiento de c-Myc al promotor RhoA. PC-3 células fueron transfectadas transitoriamente con el control pre-MIR negativo (CN) o pre-miR-34a durante 72 horas y los ensayos de chip se realizaron. *, P & lt;. 0,05 en comparación con el control
Se realizó la inmunoprecipitación (IP) para estudiar ensamblaje del complejo de transcripción c-Myc-Skp2-Miz1 en las células transfectadas miR-34a. IP (Fig. 4C) reveló que los inmunoprecipitados anti-c-myc contenían Miz1, Skp2 y Max (carril 5), pero no anti-IgG (control) inmunoprecipitados (carril 3), lo que indica que el complejo de c-Myc-Skp2-Miz1 se formado en las células PC-3. IP también mostró que miR-34a disminuyó los niveles de estos componentes en los inmunoprecipitados c-Myc [carriles 4 (control) y 6], lo que indica que miR-34a ensamblaje del complejo transcripcional de c-Myc-Skp2-Miz1 suprimida en PC- 3 células. miR-34a no redujo significativamente la Skp2 en los inmunoprecipitados en comparación con los otros componentes.
Se realizó la inmunoprecipitación de la cromatina (CHIP) ensayos para examinar si el miR-34a reduce la unión de c-Myc a la región promotora que contiene E RhoA -boxes 5 y 6, que es un sitio de unión primario de c-Myc [22]. El chip de ensayo mostró que endógena c-Myc se une a E-cajas 5 y 6 y los experimentos de control demostraron que la ARN polimerasa II de unión al promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) no fue alterada (Fig. 4D). Estos resultados sugieren que el miR-34a reduce el reclutamiento del complejo de c-Myc-Skp2-Miz1 al promotor RhoA y reduce la expresión de RhoA.
La sobreexpresión de c-Myc invierte la inhibición de la invasión
para determinar si la inhibición de la invasión de miR-34a podría invertirse a través de la restauración de c-Myc, transfectadas las células PC-3 con un plásmido de expresión de c-Myc junto con pre-miR-34a. c-Myc sobreexpresión rescató parcialmente expresión RhoA (Fig. 5A, comparar el carril 4 con 3) y la supresión de la invasión (Fig. 5B) indujo-miR-34, lo que sugiere que miR-34a inhibe la invasión, al menos parcialmente, a través de la reducción de RhoA por la orientación c-Myc.
células (a) PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con pCMV6-ENTRADA solamente o pCMV6-ENTRADA-c-Myc durante 8 h, seguido de la transfección transitoria con el control negativo pre-MIR (NC) o pre-miR-34a durante 72 h. nivel de proteína se analizó por transferencia Western. expresión (B) c-Myc rescata parcialmente la inhibición de la invasión inducida por el miR-34a. células PC3 se transfectaron transitoriamente con pCMV6-ENTRADA solamente (control) o pCMV6-ENTRADA-c-Myc durante 8 h seguido por la transfección con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a para 48 h. Las células se recogieron y se sometieron a ensayo de invasión Transwell. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control. (C) Imágenes representativas de células invadidas.
miR-34a suprime el montaje de c-Myc-P-TEFb complejo
Lo positivo elongación de la transcripción del factor b (P-TEFb) juega un papel clave en el control de la fase de elongación de la transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II) [23]. Es una quinasa dependiente de ciclina compuesto por Cdk9 andcyclin. c-Myc se ha demostrado que la interacción con P-TEFb través CycT1 y regular la transcripción de elongación [25], [26], [27]. Ya que los objetivos de miR-34a c-Myc, se realizó la inmunoprecipitación (IP) para estudiar el ensamblaje del complejo de elongación de la transcripción c-Myc-pTEFb en células PC-3 miR-34a-transfectadas. IP (Fig. 6A) reveló que el anticuerpo anti-c-Myc se bajó CycT1, Cdk9 y Max (carril 5), pero IgG (control) no tire hacia abajo estas proteínas (carril 3), lo que indica que c-Myc interactuaron con P- TEFb. IP también mostró que el miR-34a disminuyó la cantidad de p-TEFb en los inmunoprecipitados de c-myc en células PC-3 [4 carriles (control) y 6], lo que indica que el miR-34a Asamblea de la c-Myc-P- suprimida TEFb complejo en las células PC-3.
(a) miR-34a suprime la formación de la endógeno complejo c-Myc-P-TEFb. las células PC-3 fueron transfectadas transitoriamente con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a durante 72 h y los lisados de células totales se inmunoprecipitaron con anticuerpo c-Myc o IgG (control), seguido por análisis de transferencia Western. (B) miR-34a suprime CAD y el ARNm NUC expresión y DRB revereses la supresión. Células PC-3 fueron tratados con 20 M de DRB durante 12 h y se transfectaron de forma transitoria con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a para 48 h. CAD y el nivel de ARNm NUC se analizó por PCR en tiempo real.
c-Myc se informó de activar la transcripción de CAD, sintasa /aspartato transcarbamilasa /dihidroorotasa carbamoil-fosfato, y NUC mediante la estimulación de liquidación promotor y elongación, a través de la contratación de la P-TEFb [25], [39], [40]. Se estudió si el miR-34a afectó el nivel de expresión de CAD y NUC mediante DRB (5,6-di-cloro-1-BD-ribofuranosil-bensimidazole) que suprime específicamente la expresión de c-Myc sensible CAD y NUC mediante la inhibición de P-TEFb [ ,,,0],40]. Encontramos que el miR-34a disminuyó CAD y la expresión del ARNm NUC en las células PC-3, mientras que DRB restauró la expresión (Fig. 6B). Estos resultados indican que miR-34a reprimida estos genes mediante la supresión del complejo c-Myc-pTEFb.
La sobreexpresión de c-Met invierte la inhibición de la invasión
Se ha sugerido que inhibe miR-34a la invasión de células de una manera c-Met dependiente de [41], [42]. Por lo tanto, se estudiaron los efectos de miR-34a en c-Met y la invasión ya que los objetivos de miR-34a c-Met (Fig. 1). PC-3 células fueron transfectadas con un plásmido de expresión de c-Met junto con pre-miR-34a. los niveles de expresión de c-Met fueron examinados por Western blot, que indicó que la expresión de c-Met se incrementó en las células c-Met transfectadas (Fig. 7A). c-Met promueve la invasión en los experimentos de control. c-Met invierte supresión inducida por miR-34 de la invasión, lo que indica que miR-34a inhibe la invasión, al menos parcialmente, por la orientación c-Met (Figs. 7B y C).
(A) PC-3 las células fueron transfectadas transitoriamente con solamente pCMV6-ENTRADA o pCMV6-ENTRADA-c-Met durante 8 h, seguido de la transfección transitoria con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a para 72 h. nivel de proteína se analizó por transferencia Western. expresión (B) c-Met rescata parcialmente la inhibición de la invasión inducida por el miR-34a. células PC3 se transfectaron transitoriamente con pCMV6-ENTRADA solamente (control) o pCMV6-ENTRADA-c-Met durante 8 h seguido por la transfección con el control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a para 48 h. Las células se recogieron y se sometieron a ensayo de invasión Transwell. *, P & lt; 0,05 en comparación con el control. (C) Imágenes representativas de células invadidas.
Discusión
En este estudio hemos demostrado por primera vez los efectos funcionales de miR-34a en los complejos de transcripción c-Myc en PC- 3 células de cáncer de próstata. Hemos encontrado que la expresión de miR-34a está regulado por disminución de tejido de cáncer de próstata y que el miR-34a reexpresión inhibe fuertemente la proliferación celular,
in vivo
el crecimiento de xenoinjertos y la invasión celular. Hemos demostrado que el miR-34a inhibió c-Myc mediante la unión a su 3'UTR en las células PC-3 y el ensamblaje de los complejos de transcripción c-Myc suprime. Las mutaciones de c-Myc se encuentran en varios tipos de cáncer y su expresión desregulada hace que la expresión incontrolada de muchos genes algunos de los cuales regulan la proliferación celular y los resultados en el desarrollo de tumores [43], [44]. Aunque c-Myc por sí sola no es capaz de transformar las células y requiere un co-funcionamiento oncogén ras tales como oncogén [45], c-Myc es un factor importante en el desarrollo de tumores. Por lo tanto, la inhibición de c-Myc se piensa que es una función importante de miR-34a. También puso de manifiesto que el miR-34a inhibió PC-3 células invasión por la orientación de c-Met.
Rho GTPasas, una familia de pequeñas proteínas G, regulan la dinámica de actina intracelular, incluyendo la polaridad celular, la migración, el tráfico de vesículas, etc. Estos moléculas también regulan la proliferación celular, la apoptosis, la expresión del gen [17]. RhoA, un miembro de la familia Rho de GTPasas, está implicado en la transformación y metástasis. RhoA ha demostrado ser un factor importante asociado con varios cánceres humanos [46].
El complejo transcripcional de c-Myc-Skp2-Miz1 se ha demostrado previamente para activar RhoA y que es esencial para la invasión de células y el cáncer metástasis [22]. Se encontró que el c-Myc es un objetivo de miR-34a en las células PC-3, y se estudió el efecto de miR-34a en la activación de RhoA a través del complejo de transcripción c-Myc-Skp2-Miz1. reducción de miR-34a RhoA expresión y la sobreexpresión de c-Myc revirtieron la reducción de RhoA y la inhibición de la invasión de células. chip de ensayo reveló miR-34a suprime el reclutamiento de c-Myc al promotor RhoA. Hemos demostrado que el miR-34a suprimida RhoA la transcripción mediante la reducción del complejo de transcripción c-Myc-Skp2-Miz1. Estos datos documentan el hecho de que el miR-34a suprime la activación de RhoA en la iniciación de la transcripción a través de la orientación de c-Myc. Nuestros resultados demuestran que el miR-34a suprime el montaje y la función del complejo c-Myc que activa la transcripción de RhoA.
Lo positivo elongación de la transcripción del factor b (P-TEFb) regula la liberación de pausa próxima al promotor de la elongación fase de la transcripción por Pol II [23]. c-Myc interactúa con CycT1, el componente regulador de P-TEFb, y controla la fase de elongación de la transcripción de Pol II [25], [26], [27]. P-TEFb es globalmente requiere para la generación de los ARNm y la expresión de genes [27], [47] y es reclutado para genes por una variedad de factores de transcripción [23], [48]. Nuestros resultados demuestran que miR-34a suprime el montaje y la función del complejo c-Myc que se alarga la transcripción. Se sabe que la P-TEFb está involucrado en elongación transcripcional aberrante en la leucemia de linaje mixto (MLL) [49], [50]. Varias líneas de células tumorales sobreexpresan P-TEFb y CycT1 sobreexpresión promueve la transformación y el crecimiento del tumor [51]. Nuestro estudio demuestra aquí que el miR-34a abroga el complejo c-Myc-P-TEFb por la orientación de c-Myc. Las pruebas acumuladas han mostrado la importancia de la P-TEFb de malignidad, vinculando así el miR-34a a P-TEFb es un hallazgo significativo en la biología del cáncer. Nuestro estudio da en parte, una cuenta de los efectos globales y profundas de miR-34a en los procesos celulares demostrado aquí y en los informes anteriores [4], [5], [7], [8].
En lo que respecta como sabemos, no se ha informado de los efectos de los microRNAs en el conjunto de complejos de proteínas. Aquí mostramos los efectos de miR-34a en el ensamblaje de complejos funcionales c-myc, c-Myc-Skp2-Miz1 y complejos de c-Myc-P-TEFb. c-Myc se activa una variedad de genes como parte de un complejo de proteínas, regula elongación transcripcional y funciona principalmente a través de diferentes complejos con otras proteínas. Los efectos de miR-34a en estos complejos funcionales c-Myc proporcionan evidencia directa de cómo funciona el miR-34a para suprimir c-Myc. Los complejos de c-Myc que se indujeron por miR-34a fueron heterogéneos ya que las relaciones de los componentes eran diferentes de los de los inmunocomplejos de control (Figs. 4C y 6A). Estos resultados indican que los complejos fueron alterados por miR-34a, lo que sugiere un nuevo montaje complejo. La alteración de los complejos de c-Myc por miR-34a también sugiere que la supresión de la asamblea de los complejos de c-Myc puede implicar mecanismos desconocidos, además de la simple reducción de la cantidad de la proteína c-Myc por miR-34a desde miR 34a tiene efectos dramáticos sobre los procesos celulares
.
En conclusión, hemos demostrado por primera vez que el miR-34a suprime el montaje y la función del complejo c-Myc-Skp2-Miz1 que activa RhoA y el c-Myc complejo pTEFb que alarga la transcripción de diversos genes. Por lo tanto, nuestro estudio revela un nuevo papel de miR-34a en la regulación de la transcripción de c-Myc.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
fijado en formalina
, parafina -embedded muestras de cáncer (FFPE) de próstata se obtuvieron de los Asuntos de Veteranos de San Francisco (VA) Medical Center. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la UCSF (Número de autorización: H9058-35751-01). Todo el cuidado de los animales estaba en conformidad con las directrices del Centro Médico de Veteranos de San Francisco y el estudio fue aprobado por el San Francisco VA IACUC (Número de protocolo: 08-003-01).
Cultivo de células y transfección
líneas celulares de carcinoma de próstata humano, PC-3, LNCaP y DU145 y una línea celular epitelial de próstata no maligno, RWPE-1, fueron adquiridos de la American Type Culture Collection (Manassas, VA). Las líneas celulares de cáncer de próstata se cultivaron en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS). RWPE-1 línea celular fue cultivada en medio de crecimiento de queratinocitos suplementado con 5 ng /ml de factor de crecimiento epidérmico humano recombinante y 0,05 mg /ml de extracto de pituitaria bovina (Invitrogen, Carlsbad, CA):
Las células en placas de 6 pocillos se transfectadas con 30 nM de control pre-MIR negativo (NC) o pre-miR-34a (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
muestras de tejido
fijados con formalina, las muestras de cáncer (FFPE) de próstata incluidos en parafina se obtuvieron del Centro Médico de Veteranos de San Francisco. Todas las diapositivas fueron revisados por un patólogo certificado por el consejo para la identificación de los focos de cáncer de próstata, así como el epitelio glandular normal adyacente.
basada VIH-Generación de líneas celulares estables de miR-34a
Los embalajes lentiviral sistema que incluye un plásmido que expresa miR-34a o el control de vectores se adquirió de GeneCopoeia (Rockville, MD). partículas de lentivirus se produjeron mediante la transfección de plásmido de expresión lentiviral en células 293T. las células PC-3 se infectaron con el lentivirus basado en VIH expresando miR-34a o el control de vector (1,5 × 10
se seleccionaron 6 unidades infecciosas de virus (IFU) (en 20 l), y las células PC-3 infectadas con puromicina (0,5 ug /ml).
formación de colonias en agar blando ensayo
ensayo de formación de colonias en agar blando se realizó mediante la siembra de células en una capa de 0,35% de agar /medio RPMI /FBS sobre una capa de 0,5% de agar /medio RPMI /FBS. RPMI /FBS se añadió cada 5 días para suministrar continuamente suplementos de crecimiento a las células. los cultivos se mantuvieron en un humidificado 37 ° C incubadora. en el día 14 después de la siembra, la eficiencia de formación de colonias se cuantificó por microscopía de luz .
In vivo tumor crecimiento
suspensiones de los estable miR-34a células o las células de control que expresan (1 × 10
7 células en 100 l de medio RPMI) se inyectaron por vía subcutánea en la hembra ratones desnudos (cepa BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, 4-5 semanas de edad) el volumen del tumor se calculó sobre la base de la anchura (x) y la longitud (y): x
2y /2, donde x & lt;. y
se aisló
extracción de RNA y cuantitativa en tiempo real PCR
ARN utilizando el RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante . reacciones de transcripción inversa se realizaron utilizando un kit de sistema de transcripción inversa (Promega, Madison, WI). Los datos son la media ± S. D.