Extracto
microARN-449a se expresa en un nivel bajo en varios tumores y el cáncer de células líneas, e induce la detención en G1, la apoptosis y senescencia. Para identificar la función de miR-449a en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), discutimos la relevancia potencial de miR-449a con las características clínico-patológicos y el pronóstico en NSCLC. También se investigó el impacto de miR-449a sobre la migración y la invasión en las células NSCLC. La expresión de miR-449a en los tejidos y líneas celulares de NSCLC se detectó utilizando RT-qPCR.
in vitro
, con ganancia de función, los experimentos de pérdida de función, y se realizaron ensayos de fluorescencia para identificar el potencial objetivo de miR-449a y la función de miR-449a en las células NSCLC. MiR-449a se downregulated en ambos tejidos y líneas celulares de NSCLC. Por otra parte, un bajo nivel de expresión de miR-449a parecía estar correlacionado con metástasis en los ganglios linfáticos y la supervivencia de los pobres.
in vitro
, miR-449 migración celular y la invasión regulado en las células NSCLC como un supresor de tumores potencial, al menos en parte por la orientación de c-Met. Además, la expresión recíproca de miR-449a y c-Met se muestra en muestras de tejido de NSCLC. Este estudio indica que el miR-449a podría estar asociado con la progresión del NSCLC, y sugiere un papel crucial para el miR-449a en el CPNM
Visto:. Luo W, Huang B, Li Z, Li H, L Sun, Zhang Q, et al. (2013) microARN-449a es downregulated en células no pequeñas de cáncer de pulmón e inhibe la migración y la invasión por la orientación de c-Met. PLoS ONE 8 (5): e64759. doi: 10.1371 /journal.pone.0064759
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 9 de diciembre de 2012; Aceptado: April 17, 2013; Publicado: 29 de mayo de 2013
Derechos de Autor © 2013 Luo et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias de China (Nº 30972967) subvenciones, Fondo de Investigación Especializada para el Programa de Doctorado de Educación Superior (Nº 20092104110018), Programa de Liaoning talentos excelentes en la Universidad, Fundación de Liaoning Provincial de Ciencias Naturales (Nº 20102122) y el Programa de Tecnología de Shenyang Ciencia y (F10-149-9-41). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
Los microARN (miRNA) son una clase de pequeños ARN no codificantes, de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, que regulan la expresión de genes posttranscriptionally. Mediante la unión a una secuencia complementaria encuentra predominantemente en el 3'-UTR de los ARNm diana, ya sea miRNAs degradan estos ARNm o inhiben ellos de su traducción en proteínas. Casi el 50% de miRNAs humanos se encuentran en lugares frágiles y regiones genómicas implicadas en el cáncer [1]. Nuevas pruebas muestran que los miRNAs se correlacionan con varios cánceres humanos y funcionar como oncogenes y supresores de tumor [2], [3], [4].
desregulación de expresión de microARN en los cánceres humanos han mostrado que los miARN desregulación está asociada con muchos tipos de cáncer, incluyendo cáncer de pulmón [5], [6], [7], [8], [9]. Alta expresión de miR-155 y baja expresión de let-7, miR-126 se reportan para predecir mal pronóstico de adenocarcinoma de pulmón [6], [7], [10]. Raponi y colegas describen expresiones miARN distintas en pulmón carcinoma de células escamosas (SCC) en comparación con el tejido pulmonar normal [11]. Sobre la base de los genes miARN desregulación expresión, miRNAs podrían proporcionar un nuevo método para el diagnóstico del cáncer.
miR-449 se expresa en un nivel bajo en varias líneas celulares de cáncer y tumores sólidos, incluyendo cánceres de próstata [12], cáncer gástrico [13 ], los cánceres de vejiga [14] y el cáncer de pulmón [15]. Los objetivos biológicos de miR-449 han sido parcialmente identificados, y miR-449 induce la detención G1, la apoptosis y senescencia por la regulación de los factores clave en el ciclo celular y la apoptosis, tales como la histona deacetilasa 1 (HDAC1) [12], CDK6 [16] , [17], [18], CDC25A [16], [18], ciclina D1 (CCND1) [19], y SIRT1 [17]. Sin embargo, se sabe poco sobre el papel de miR-449a en la progresión del NSCLC. En este estudio, encontramos que el miR-449a se downregulated en los tejidos de NSCLC y se asocia con personajes clínico-patológicas y pronóstico. Hemos explorado el efecto de miR-449a en la migración celular y la invasión NSCLC y su regulación del gen diana c-Met. recíproco expresión de miR-449a y c-Met se observó en muestras de tejido de NSCLC y las posibles funciones de miR-449a y c-Met en la progresión del NSCLC se discuten.
Materiales y Métodos
Muestras
las muestras frescas de cáncer de pulmón y el tejido normal adyacente correspondiente (NAT, & gt; 5 cm del tejido canceroso) fueron obtenidas de pacientes en primer hospital Afiliado de la Universidad médica de china y el hospital del cáncer de Liaoning entre enero de 2008 y noviembre de 2009 con el consentimiento informado. (Comité de Ética del hospital dio su aprobación). Ninguno de los 84 pacientes en el estudio recibieron cualquier quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Diez muestras pulmonares normales se obtuvieron de consentir los pacientes durante la cirugía para la enfermedad pulmonar benigno. Para el análisis cuantitativo de miR-449, se seleccionaron los tejidos incluidos en parafina fijado en formol (FFPETs) de los casos de cáncer de pulmón al azar de los pacientes en Liaoning Hospital del Cáncer enero 2004 hasta diciembre 2005 con el consentimiento informado y aprobación. la información clínico-patológico estaba disponible y dos patólogos determinó de forma independiente los diagnósticos y el grado histológico basado en directrices de la Organización Mundial de la Salud. la información clínico-patológico y el seguimiento de los datos se resumen en la Tabla S1
.
Este estudio se llevó a cabo con la aprobación de la junta de revisión institucional local en el Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de China y el Hospital del Cáncer de Liaoning. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y se han llevado a cabo todas las investigaciones clínicas.
En tiempo real cuantitativa reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR) de miR-449a
ARN total fue extraído a partir de hortalizas frescas células y tejidos usando Trizol (Invitrogen, NY, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. ARN de FFPETs se separó usando un aislamiento de los genes miARN Kit Am1975 RecoverAllTM (Ambion, Austin, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante. MicroARN cuantificación del ARN extraído se realizó utilizando TaqMan ensayos microARN (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.). RT cebador y la sonda TaqMan de miR-449a (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.) fueron utilizados para el análisis de PCR en un ABI 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, EE.UU.), de acuerdo con el protocolo del fabricante. RNU6B, como control interno, se llevó a cabo de la misma manera que anteriormente. Cada análisis RT-qPCR se realizó en tres experimentos independientes, utilizando tres muestras independientes. La cantidad relativa de miR-449a en los tejidos y líneas celulares de cáncer se compararon con la expresión media de 10 muestras normales, usando la ecuación RQ = 2
-ΔΔCT [20], [21].
Cell
cultura y transfección
El cáncer de pulmón línea celular A549 humana y líneas celulares H1299 se obtuvieron de American Type Culture Collection. Otras líneas celulares de cáncer células BE1 y LH7 eran de papel publicado previa de nuestro equipo [8]. A549 se cultivaron en Dulbecco Modifed Medio Eagle (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). BE-1, LH-7 y H1299 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Gibco® Invitrogen, Carlsbad, EE.UU.). En cada caso, el medio se suplementó con 10% de suero bovino fetal (Hyclone, Logan, EE.UU.), 100 U /ml de penicilina, y 100 U /ml de estreptomicina. Las células fueron incubadas a 37 ° C en una incubadora humidificada que contiene 5% de CO
2
Un control negativo mímica, un imitador de miR-449a, un inhibidor de control negativo y un inhibidor de miR-449a, eran de RiboBio (Guangzhou, china). Las células A549 y H1299 se transfectaron usando el reactivo de transfección HiPerFect (Qiagen, Hilden, Alemania). Brevemente, se prepararon complejos que contienen los imita o inhibidores de acuerdo con el protocolo del fabricante. La mezcla se añadió a las células a una concentración final de 100 nM. Los cuatro grupos fueron: células transfectadas con un control negativo mímica, transfectada con un imitador miR-449a, transfectadas con un control inhibidor, transfectadas con un inhibidor de miR-449a. Además, un pequeño ARN c-Met de interferencia (siRNA) y un control negativo fueron diseñados y sintetizados por GenePharma (Shanghai, China) y se transfectaron en células A549. Las secuencias de la c-Met siRNA fueron 5'-GGA AUA GUC AGA GGG CAU UTT-3 '(sentido), y 5'-AAU GCC CUC NVND CUA UGA CTT-3' (antisentido).
la migración celular y la invasión ensayos
Transwell cámaras (Corning, NY, EE.UU.) con un tamaño de poro de 8 micras se utilizaron para los ensayos de migración celular y la invasión. Las células fueron cultivadas a 60% de confluencia y se transfectaron con el miARN o siRNA. Después de 24 horas, para el ensayo de migración, las células se tripsinizaron y 5 x 10
4 células se resuspendieron en medio libre de suero y se colocaron en la cámara superior. Como un quimioatrayente, la cámara inferior contenía FBS al 10%. Las células fueron incubadas a 37 ° C en 5% de CO
2 durante 16 horas, y las células no migratorios fueron removidos con un hisopo de algodón. Las células migradas se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en metanol al 100%, se tiñeron con hematoxilina. Las células teñidas se observaron bajo un microscopio (ampliación × 200), y el número de células migradas se contó en cinco campos aleatorios. Para los ensayos de invasión, la cámara superior se reviste previamente con Matrigel mezclado con medio libre de suero (diluido a 1:03, BD Biosciences, San Jose, EE.UU.). Después de la solidificación de la mezcla, 5 × 10
4 células en medio libre de suero se colocaron en la cámara superior. La cámara inferior contenía FBS al 10% como quimioatrayente. Las células se incubaron a 37 ° C en 5% de CO
2 para 18 horas, y las células no invasoras se eliminaron con un hisopo de algodón. Se fijaron las células invasoras, se tiñeron y se contaron. Las células teñidas se observaron bajo un microscopio (ampliación × 200), y el número de células migradas se contó en cinco campos aleatorios. Los ensayos se realizaron por duplicado en tres experimentos independientes.
Análisis de RT-qPCR de miR-449a Gen Objetivo
ARN total fue extraído de las células y la síntesis de ADNc se realizó con el kit de reactivos PrimerScript RT ( Takara, Dalian, china). El cDNA resultante se amplificó usando los cebadores c-Met con SYBR Premezcla Ex Taq II (Takara, Dalian, China) con los parámetros de 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 segundos, 60ºC durante 30 s . Los cebadores para c-Met eran F: 5'-GGCTGGTGGCACTTTACTTA-3 'y R': 5'-CTTGTCTCTCGGTTGGCTA-3 'y cebadores para endógeno β-actina F fueron: 5'-AGCACAGAGCCTCGCCTTTG-3', R: 5'-ACATGCCGGAGCCGTTGT -3 '. análisis de la curva de fusión se llevó a cabo al final de los ciclos para asegurar la especificidad del producto. La cantidad relativa de c-Met, normalizado a ß-actina, calculado en base a la ecuación RQ = 2
-ΔΔCT
Análisis Western Blot
Las muestras de tejido de 0,2 g se molieron. de polvo en nitrógeno líquido. polvo de tejidos y las células se extrajeron con tampón de lisis (NaCl 150 mM, 1% NP-40, 0,1% de SDS, 2 mg /ml de aprotinina y PMSF 1 mM) durante 30 min a 4 ° C. Una cantidad igual de proteína se separó el 10% de geles de SDS-PAGE. Anti-c-Met (21220, Signalway de anticuerpos, Maryland, EE.UU.), anti-MMP-2 (sc-13595, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti-MMP9 (sc-13520, Santa Cruz, CA, EE.UU.), anti- β-actina (sc-1616, Santa Cruz, CA, EE.UU.) se utilizaron siguió las instrucciones del fabricante. Image J software (Institutos Nacionales de Salud, MD, EE.UU.) se utilizó para medir la intensidad de las bandas de proteínas.
fluorescente reportero de ensayo
Con el fin de realizar el ensayo de indicador fluorescente, los siguientes cebadores fueron utilizados para amplificar el 3'UTR del gen c-Met a partir de ADNc humano (NM_000245):. cebador directo 5'-GATCCTGCTAGTACTATGTCAAAGCAACAGTCCACACTTTGTCCAATGGTTTTTTCACTGCCTGAG 3 ', el cebador inverso 5'-AATTCTCAGGCAGTGAAAAAACCATTGGACAAAGTGTGGACTGTTGCTTTGACATAGTACTAGCAG-3'
el plásmido que contiene c-Met 3'UTR a un indicador fluorescente se construyó (Sauer Biotecnología Inc, china). Las células A549 se sembraron en placas de 48 pocillos, cultivó durante la noche, luego cotransfectadas con el control sinóptico, miR-449a mímica, el control inhibidor, inhibidor de miR-449a seguido por el /EGFP-c-Met 3'UTR pcDNA3 vector informador después de 24 horas. La actividad de la proteína fluorescente (EGFP) verde mejorada se normalizó a la actividad de la proteína fluorescente roja (RFP). Después de 72 horas se extrajeron las proteínas, y se utilizó el F-4500 espectrofotómetro de fluorescencia (Hitachi, Japón) para determinar la intensidad de fluorescencia. Los ensayos se realizaron por duplicado en tres experimentos independientes.
Análisis estadístico
SPSS13.0 paquete de software estadístico (SPSS, Chicago, EE.UU.) se utilizó para el análisis estadístico. Por RT-qPCR, el nivel de expresión de miR-449a en el cáncer de pulmón y emparejado NAT se log2 transformado. Todos los valores se presentan como media con la desviación estándar (SD). Se utilizó una para muestras relacionadas T-test para analizar las diferencias en la expresión de miR-449a entre el cáncer de pulmón y NAT emparejados. Se utilizó una prueba de chi-cuadrado para analizar la relación entre los niveles de expresión de miR-449a y personajes clínico-patológicas. Se utilizó la prueba de Mann-Whitney para analizar los datos clasificados de grado histológico y el estadio patológico. Spearman determinó la correlación entre la expresión de miR-449a y el estadio patológico y el estado de los ganglios linfáticos. El método de Kaplan-Meier se utilizó para las curvas de supervivencia, y se utilizó una prueba de log-rank para la comparación. regresión de Cox se utilizó para examinar el efecto de covariables. Los resultados de los experimentos con células fueron analizadas por un muestras independientes t-test y ANOVA de una vía.
P Hotel & lt; 0,05 fue considerado estadísticamente significativo
Resultados
1.. MiR-449a se downregulated en NSCLC y los tejidos asociados con la metástasis de ganglios linfáticos
Se detectó la expresión de miR-449a por RT-qPCR en 84 muestras de tejidos frescos con NSCLC NAT pares. En comparación con el NAT, el nivel de expresión de miR-449a (77/84) fue significativamente downregulated en los tejidos de NSCLC (emparejado T-test,
P = 0,004
,
t = -2,997
, la figura 1A). Regulación a la baja de miR-449a detectado por RT-qPCR en los tejidos de NSCLC, también se muestra en el diagrama de caja (Figura 1B). RNU6B se utilizó como estándar interno.
A. gráfico de barras indica emparejado regulación a la baja de miR-449a en los tejidos de NSCLC. resultado de RT-qPCR de miR-449a en 84 tejidos de NSCLC frescas y NAT pares. experimentos por triplicado se completaron para cada muestra, la expresión relativa se calculó utilizando la ecuación de RQ = 2
-ΔΔCT. En comparación con el NAT, el miR-449a fue significativamente downregulated en muestras de NSCLC (emparejado T-test,
P = 0,004
,
t = -2,997
). B. Diagrama de caja indica regulación a la baja de miR-449a en los tejidos de NSCLC. C. Correlación entre el nivel de expresión de miR-449a y el estadio patológico, los ganglios linfáticos de 84 muestras apareadas fresca de pacientes con cáncer de pulmón. D. curva de Kaplan-Meier para las tasas de 5 años de supervivencia global (14,29%) de los 70 FFPET muestras de pacientes con cáncer de pulmón. E. En 70 FFPET muestras de pacientes con cáncer de pulmón, la curva de Kaplan-Meier para los pacientes con cáncer de pulmón clasificados como de alta o baja expresión de miR-449a, bajo nivel de expresión de miR-449a se correlacionó significativamente con la prueba de supervivencia de los pobres (log-rank paciente,
P
. & lt; 0,001) guía empresas
para determinar los efectos de la expresión de miR-449a en la iniciación y progresión del tumor, los pacientes con CPNM se dividieron en dos grupos, bajo y alto, de acuerdo con la expresión el nivel de expresión de miR-449a en los tejidos cancerosos (valor log2, mediana = 1,47) significa. Correlación entre la expresión de miR-449a y las variables clínico-patológicas de cáncer de pulmón se muestran en la Tabla 1. Se observaron correlaciones significativas entre la expresión de miR-449a y el estadio patológico (
P = 0,012
) (prueba de Mann-Whitney). En 17 casos se presentan con el estadio patológico III, 13 (76,47%) casos tenían una baja expresión de miR-449a, mientras que la tasa baja expresión fue 16/32 (50,00%) de stageII patológica y 13/35 (37,14%) de estadio patológico I (Figura 1C). Los cambios en la expresión de miR-449a también se asociaron significativamente con metástasis en los ganglios linfáticos. En 40 casos de cáncer de pulmón con metástasis en los ganglios linfáticos, 25 (62,5%) tuvieron una baja expresión de miR-449a. Por el contrario, en 44 casos sin metástasis en los ganglios linfáticos, sólo 17 casos (38,64%) tuvieron una baja expresión de miR-449a (
P = 0,029
, prueba de chi-cuadrado; Figura 1C). No se observó correlación entre la expresión de miR-449a y el género, la edad, el tipo histológico o el grado histológico.
Para entender mejor la correlación entre la expresión de miR-449a y el estadio patológico, la metástasis de los ganglios linfáticos, la correlación de Spearman se utilizó la prueba para el análisis adicional. Los resultados mostraron una correlación negativa entre la expresión de miR-449a y el estadio patológico (r = -0,276,
P = 0,011
), y metástasis en los ganglios linfáticos (r = -0,238,
P = 0,029
).
2. Correlación entre la expresión de miR-449a y el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón
miR-449a se detectó expresión en FFPETs de pacientes con cáncer de pulmón con 70 datos de seguimiento (Tabla S1). La curva de supervivencia global en la figura 1D muestra una tasa de supervivencia global a los 5 años del 14,29% para los 70 casos. De acuerdo con el análisis de supervivencia de Kaplan-Meier, los pacientes con CPNM con baja expresión de miR-449a tenían un pronóstico significativamente peor que aquellos con alta expresión de miR-449a (log-rank test,
P Hotel & lt; 0,001; Figura 1E). Además de la expresión de miR-449a, otros factores clínico-patológicas tales como el grado histológico (log-rank test,
P
= 0,004), el estadio patológico (log-rank test, P & lt; 0,001) y metástasis de ganglios linfáticos (log -rank prueba,
P Hotel & lt; 0,001) también se asociaron con el pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón de acuerdo con el análisis de supervivencia. Se realizó un análisis de regresión de riesgos proporcionales de Cox univariante para encontrar el factor más fuerte predictor de mal pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón. Hemos encontrado que la expresión de miR-449a (
P Hotel & lt; 0,001, hazard ratio [HR] = 0,345), el grado histológico (
P = 0,002
, HR = 1,725), el estadio patológico (
P Hotel & lt; 0,001, HR = 3,254), y la metástasis de los ganglios linfáticos (
P Hotel & lt; 0,001, HR = 6,535) fueron factores predictivos de mal pronóstico de los pacientes con cáncer de pulmón (Tabla 2) .
multivariante de Cox análisis de regresión de riesgos proporcionales mostró que el nivel de expresión de miR-449a (
P = 0,041
, HR = 0,558, 95% intervalo de confianza [IC]: 0.319- 0,976) fue un importante factor pronóstico favorable independientemente de otros factores clínico-patológicos, por ejemplo el estadio patológico (
P = 0,002
, HR = 2,162; IC del 95%: 1,338-3,491), los ganglios linfáticos (
P
= 0,001, HR = 3,104; IC del 95%:. 1,615-5,966; Tabla 2)
3. MiR-449a se downregulated en líneas celulares de NSCLC y afectados migración y la invasión
in vitro
Se examinó la expresión de miR-449a en líneas celulares de NSCLC 4: A549, BE-1, LH 7, H1299 mediante RT-qPCR. Como se muestra en la Figura 2, en comparación con la expresión media de 10 muestras de pulmón normales, todas las 4 líneas celulares mostraron regulación a la baja significativa de miR-449a. Adicionalmente, se encontró que la expresión de miR-449a ser disminuido considerablemente en la línea celular de NSCLC altamente invasiva BE1 en comparación con la línea celular LH7 menos invasiva
.
La cantidad relativa de miR-449a en líneas celulares de NSCLC 4 se compararon el nivel medio de expresión de 10 muestras de pulmón normales basados en la ecuación RQ = 2
-ΔΔCT.
expresión de miR-449a en ambos tejidos y líneas celulares de cáncer sugiere que el miR-449a se asoció con metástasis. Por lo tanto, hemos explorado los efectos potenciales de miR-449a sobre la migración y la invasión de células de cáncer de pulmón. De acuerdo con la expresión de miR-449a en líneas celulares de cáncer, se seleccionaron las células A549 y H1299 líneas, que tenían la expresión relativamente moderada de miR-449a, por transwell ensayos. Para determinar el efecto de miR-449a sobre la migración celular y la invasión, A549 y células H1299 fueron transfectadas con el control mímico, imitador de miR-449a, el control inhibidor y el inhibidor de miR-449a. Para asegurar efectos de transfección, RT-qPCR se realizó para identificar la expresión de miR-449a después de 24 horas (Figura S1). La expresión relativa de miR-449a en el A549 y H1299 células transfectadas con un mímico se incrementó significativamente.
Como se muestra en la Figura 3, en comparación con los controles, se redujeron las capacidades migratorias de las células transfectadas con el imitador de miR-449a en aproximadamente un 42,9% para las células A549 y 36,4% para las células H1299. Por el contrario, las células en el grupo inhibidor de miR-449a tuvieron mayor capacidad de migración que los controles, las células migradas se incrementó en 62,5% para A549 y 48,5% para las células H1299 (Figura 3). También se realizaron ensayos de la invasión de Matrigel, y el aumento de la expresión exógena miR-449 redujo el número de células invasoras significativamente por 44,8% para A549 y 38,2% para las células H1299 (Figura 3). El número de células invasoras se incrementó significativamente en 58,1% para el A549 y el 46,9% para las células H1299 cuando se transfectaron con el inhibidor de miR-449a (Figura 3)
A & amp;. B. MiR-449a regula la migración celular y la invasión. Las células A549 /H1299 se transfectaron con el control de Mimic, miR-449a Mimic, Control de inhibidor y el inhibidor de miR-449a, después se sometieron a ensayos de migración e invasión como se describe en la Sección 2. Migración /células invasoras se obtuvieron imágenes de fotografías representativas después de la tinción con hematoxilina. Ampliación original, x200. C & amp; D. Número medio migrado /invasiva de células a partir de tres experimentos independientes se muestra en la gráfica de barras, media ± SD. * P & lt;. 0,01
4. Mir-449a dirigida c-Met
Para determinar posibles genes diana de miR-449a en las células NSCLC, que utiliza tres algoritmos para analizar los posibles objetivos de miR-449a: TargetScan 5,2 (junio de 2011), Miranda (agosto de 2010 ), y Diana-microT (julio de 2011). En la lista de destino potencial, c-Met, que tiene dos sitios predichos con miR-449a de unión está implicada como un mediador clave de la migración celular, invasión y metástasis en la tumorigénesis y progresión tumoral en una variedad de tumores incluyendo NSCLC (Figura S2). Hemos examinado si c-Met estaba regulado por el miR-449a en muestras de tejido de NSCLC y
in vitro
. Para determinar la relevancia clínica de miR-449a y c-Met, se seleccionaron 27 pares de las 84 muestras de tejido de NSCLC frescas con NAT pares de acuerdo con el nivel de expresión medio de miR-449a en 84 tejidos muestras cancerosas, incluyendo 13 miR-449a baja expresadores y altos expresadores 14 miR-449a. Como se muestra en la Figura 4 A & amp; B, se realizaron transferencias de Western para examinar el nivel de expresión de c-Met en estas 27 muestras pares, c-Met expresión fue significativamente mayor en los tejidos de NSCLC en comparación con NAT (emparejado T-test,
P Hotel & lt; 0,001,
t
= 6.352), mientras que el miR-449a fue regulada hacia abajo en el mismo grupo de tejidos de NSCLC como se detectó en el Resultado 1 (Figura 4C). Además, los tumores con bajo nivel de expresión de miR-449a revelaron altas concentraciones de c-Met, mientras que los tumores con alto nivel de expresión de miR-449a realizaron bajas concentraciones de c-Met (
P
= 0,037, Figura 4D) . Estos resultados indican que una correlación inversa entre el miR-449a y la expresión de c-Met en muestras de tejido
A & amp;. B. La expresión de c-Met detectado por Western Blot en 27 pares de muestras de NSCLC frescas. β-actina se utilizó como control interno. La intensidad de las bandas de proteínas se midió, el eje de diagrama de caja se basó en OD. Los valores de Western Blot. C. Expresión relativa de miR-449a en el mismo panel de 27 muestras apareadas de NSCLC. D. Expresión de c-Met se muestra agrupados por el nivel de expresión media de miR-449a en 84 muestras de tejidos cancerosos. La expresión de c-Met en expresadores bajos de miR-449a fue superior a los altos expresadores miR-449a. La intensidad de las bandas de proteínas se midió, el eje de diagrama de caja se basó en OD. Los valores de Western Blot (
P = 0,037
).
Para determinar si miR-449a dirigida c-Met
in vitro
, transfectadas las células A549 y H1299 células con miR-449a imitan o inhibidor y detectan el nivel de c-Met ARNm mediante RT-PCR cuantitativa a las 48 h después de la transfección. La sobreexpresión de miR-449a disminuyó significativamente ARNm c-Met en comparación con los controles, mientras que la inhibición de miR-449a como resultado un aumento de c-Met mRNA (Figura 5A). Se realizó análisis de transferencia de Western para poner a prueba la expresión de la proteína de c-Met. Los resultados mostraron sobreexpresión de miR-449a dado lugar a una disminución dramática de la proteína c-Met, mientras que la reducción de miR-449a aumentó notablemente la proteína c-Met (Figura 5B). Estos resultados indicaron que el miR-449a regula la expresión de c-Met, tanto a nivel de ARNm y proteínas.
A. El efecto de miR-449a en c-Met mRNA en células de NSCLC. las células A549 /H1299 se transfectaron con un control Mimic, una miR-449a Mimic, un control inhibidor, y un inhibidor de miR-449a, a continuación, se extrajo el ARN y se sometió a RT-qPCR. La cantidad relativa de c-Met, normalizado a ß-actina, se comparó con el grupo Mock basado en la ecuación de RQ = 2
-ΔΔCT. * P & lt; 0,01. B. El efecto de miR-449a en la proteína c-Met en células de NSCLC. Las células A549 /H1299 se transfectaron con un control sinóptico, un imitador de miR-449a, un inhibidor de control y un inhibidor de miR-449a. Después de 48 horas, la proteína celular se extrajo y se sometió a análisis de Western Blot de c-Met. β-actina se utilizó como control interno. sitios de unión C. miR-449a en el 3'UTR del c-Met se evaluó mediante ensayos de reportero fluorescentes. Con un vector que contiene c-Met 3'-UTR, las células A549 se transfectaron con un control sinóptico, un imitador miR-449a, un control inhibidor, y un inhibidor de miR-449a, a continuación, la proteína se extrajo y se determinó la intensidad de fluorescencia. * P & lt;.
0,05
Para determinar si c-Met era un objetivo directo de miR-449a, se realizaron ensayos de reportero fluorescentes. El 3'-UTR de c-Met con dos sitios de unión para predijo miR-449a se clonó en un vector reportero fluorescente. Como se muestra en la Figura 5C, la regulación positiva de miR-449a redujo la intensidad de la fluorescencia de EGFP en las células transfectadas con un vector que contiene c-Met 3'-UTR en comparación con los controles, mientras que en el grupo inhibidor de miR-449a la intensidad de la fluorescencia EGFP aumentó significativamente . Estos resultados indican que el miR-449a se une a la región de c-Met 3'UTR directamente.
Para confirmar aún más si miR-449a regula la migración y la invasión a través de la orientación de c-Met, c-Met siRNA se utiliza para silenciar c expresión de Met. Se utilizó el análisis de Western blot para validar los resultados (Figura 6A). Con los cambios aguas abajo a MMP2 y MMP9 (Figura 6B), co-transfección de inhibidor de miR-449a y c-Met siRNA suprimido los efectos de miR-449a sobre la migración y la invasión en las células A549 (Figura 6C & amp; D). Estos resultados sugieren que el miR-449a podría ser crucial en la regulación de la migración celular, invasión y metástasis del tumor a través de la orientación del oncogén c-Met.
A. oligonucleótidos C-Met siRNA fueron utilizadas para inhibir la expresión de c-Met, y el efecto se verificó. Las células A549 se transfectaron con un control negativo y un siRNA c-Met, la proteína celular se extrajo y se sometió a análisis de Western Blot de c-Met. β-actina se utilizó como control interno. B. La co-transfección de un inhibidor de miR-449a y un siRNA c-Met se realizó en células A549. Las células fueron transfectadas con un control inhibidor, un inhibidor de miR-449a y un inhibidor de miR-449a más un c-Met siRNA, la proteína de estas células se extrajo y se sometió a análisis de Western Blot de c-Met. β-actina se utilizó como control interno. C. Los efectos de miR-449a sobre la migración y la invasión de las células A549 fueron abolidos después de la co-transfección. Las células A549 se transfectaron con un control, un inhibidor de miR-449a y un inhibidor de miR-449a más un c-Met siRNA, después se sometieron a ensayos de migración e invasión como se describe en la Sección 2. Migración /células invasoras se obtuvieron imágenes de fotografías representativas después la tinción con hematoxilina. Ampliación original, x200. D. Media migró /número de células invasoras a partir de tres experimentos independientes se muestran en la gráfica de barras, media ± DE. * P & lt;. 0,01
Discusión
Hemos encontrado que el miR-449a se downregulated significativamente en los tejidos y líneas celulares de NSCLC, en consonancia con el informe que el miR-449 se redujo en varios humana tumores y líneas celulares de cáncer [16]. Además, Liang y colegas encontraron que el miR-449 se detectó en el pulmón humano, testículos, y las trompas de Falopio, pero no en otros tejidos humanos normales [22], [23]. Por otra parte, se observó regulación a la baja de miR-449 en el cáncer gástrico. La expresión de miR-449 fue baja o indetectable en 8 de los 10 tejidos de cáncer gástrico, aunque no se observó correlación entre la reducción de la expresión de miR-449 y las características clínicas de cáncer gástrico en los 10 pares de tejidos [13]. Recientemente, Jeon y sus colegas encontraron que el miR-449a /b ha reducido la expresión en tejidos de cáncer de pulmón, con el objetivo de HDAC1 gen sobreexpresado en el nivel de ARNm [15]. Sin embargo, los datos de un gran conjunto de muestras en el estado de la expresión de miR-449 y su relevancia para características clínico no están claros. Aquí, se utilizó 154 muestras de NSCLC (incluyendo 84 muestras frescas y 70 FFPET muestras) para detectar la posible relación entre el estado de la expresión de miR-449a y varias características clínico, así como la supervivencia de los pacientes con NSCLC. De acuerdo con los resultados de RT-qPCR en 84 casos de NSCLC tejidos frescos y NAT pares, miR-449a se downregulated significativamente en comparación con NSCLC NAT pares. Se realizó un análisis estadístico, y un bajo nivel de miR-449a parecía estar correlacionado con el estadio patológico avanzado y metástasis en los ganglios linfáticos. Para nuestro conocimiento, nuestro análisis indica por primera vez que el miR-449a se asoció con metástasis en los ganglios linfáticos. Por otra parte, los datos de 70 FFPETs indicado que los pacientes con cáncer de pulmón con baja expresión de miR-449a tenían mal pronóstico. Análisis multivariado de regresión de Cox mostró que el bajo nivel de expresión de miR-449a se asoció de forma independiente con un peor pronóstico, así como la etapa y metástasis de ganglios linfáticos patológicos avanzados. Estos resultados sugieren que el miR-449a podría ser un predictor pronóstico útil independientemente de otros factores clínico-patológicos.
Los mecanismos moleculares precisos para la expresión alterada de miR-449 en los tumores siguen siendo desconocidos. La familia de miR-34 que comparte la misma secuencia de semilla con miR-449 es supresora de tumores y metilado en el cáncer de pulmón [24], [25], [26]. Por otra parte, la expresión de miR-449 es inactivada por la histona H3lys27 (H3K27mes) y revertido por fármacos epigenéticos de modificaciones de las histonas [16]. Tomados en conjunto, los eventos epigenéticos aberrantes pueden ser importantes en los mecanismos detrás de miR-449 desregulación. MiR-449a está situado en el primer intrón de CDC20B en el cromosoma 5q11 que a menudo es un sitio de la anormalidad en el cáncer de pulmón [27], [28].