Extracto
El Abelson (c-Abl) proto-oncogen codifica una proteína tirosina quinasa nonreceptor altamente conservada que juega un papel en la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis y la adhesión celular. c-Abl representa un objetivo anti-cáncer específico en el cáncer de próstata como actividad aberrante de esta quinasa se ha implicado en la estimulación del crecimiento del cáncer de próstata y la progresión. Sin embargo, el mecanismo de regulación de c-Abl no se conoce. Aquí mostramos que las quinasas Abl están regulados por una novela microARN, miR-4723, en el cáncer de próstata. Expresión de perfiles de expresión de miR-4723 en una cohorte de muestras clínicas de cáncer de próstata mostró que la expresión de miR-4723 es ampliamente atenuada en el cáncer de próstata. la expresión de miR-4723 baja se correlacionó significativamente con un peor pronóstico de supervivencia y nuestros análisis sugieren que el miR-4723 tiene un gran potencial como biomarcador de la enfermedad para el diagnóstico y el pronóstico en el cáncer de próstata. Para evaluar la importancia funcional de la disminución de la expresión de miR-4723 en el cáncer de próstata, el miR-4723 se sobreexpresa en líneas celulares de cáncer de próstata, seguido por ensayos funcionales. MIR-4723 sobreexpresión condujo a una disminución significativa en el crecimiento celular, clonability, la invasión y la migración. Es importante destacar que la expresión de miR-4723 condujo a la inducción dramática de la apoptosis en líneas celulares de cáncer de próstata que sugieren que miR-4723 es un carcinogénesis de próstata pro-apoptótica miRNA regulación. Análisis de los supuestos objetivos de miR-4723 mostró que el miR-4723 se dirige a la integrina alfa 3 y proteína de unión a metil CpG, además de ABL1 y Abl2 quinasas. Además, se encontró que la expresión de Abl quinasa se correlaciona inversamente con la expresión de miR-4723 en muestras clínicas de cáncer de próstata. Además, ABL1 caída phenocopies parcialmente miR-4723 reexpresión en células de cáncer de próstata que sugiere que Abl es un objetivo funcionalmente relevante de miR-4723 en el cáncer de próstata. En conclusión, hemos identificado un nuevo micro ARN que media la regulación de las quinasas Abl en el cáncer de próstata. Este estudio sugiere que el miR-4723 puede ser un objetivo atractivo para la intervención terapéutica en el cáncer de próstata
Visto:. Arora S, S Saini, Fukuhara S, S Majid, Shahryari V, Yamamura S, et al. (2013) microARN-4723 inhibe el crecimiento del cáncer de próstata a través de la inactivación de la familia de Abelson proteína tirosina quinasas nonreceptor. PLoS ONE 8 (11): e78023. doi: 10.1371 /journal.pone.0078023
Editor: P. Jin Cheng, H.Lee Moffitt Centro de Cáncer & amp; Research Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 28 de mayo de 2013; Aceptado: 7 Septiembre 2013; Publicado: 1 Noviembre 2013
Derechos de Autor © 2013 Arora et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Esta investigación fue apoyado por el Centro Nacional de Recursos para la investigación de los Institutos nacionales de Salud (NIH) a través de la subvención Número RO1CA 138642, RO1CA160079, T32DK007790 y VA Mérito de la opinión y el Proyecto de Programa VA. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna más común masculina y la segunda causa principal de muerte por cáncer entre los hombres en los Estados Unidos. De próstata metástasis ósea del cáncer es la principal causa de mortalidad en los pacientes afectados [1]. A pesar de muchos avances, la gestión clínica del cáncer de próstata es un reto y es una causa importante de morbilidad y mortalidad relacionada con el cáncer. Los principales desafíos son opciones terapéuticas para metastásico, enfermedad resistente a la castración y la incapacidad de las pruebas de diagnóstico actuales de distinguir fácilmente indolente de tumores agresivos [2] limitados. Por lo tanto, ha habido mucho interés en la identificación de nuevos biomarcadores de cáncer de próstata alternativos que podrían conducir al desarrollo de mejores intervenciones de pronóstico, diagnóstico y tratamiento de la enfermedad.
El Abelson (ABL) de la familia de nonreceptor altamente conservada proteína tirosina quinasas juegan un papel importante en diversos procesos biológicos incluyendo la supervivencia celular, la proliferación, la adhesión celular y la motilidad [3]. Las células de mamíferos tienen dos familias Abl kinases- ABL1 (c-Abl) y Abl2 (Abl-relacionado con el gen, Arg) - que se expresa de forma ubicua [3], [4]. Central para las funciones bioquímicas y fisiológicas de las quinasas Abl son su combinación de un regulado SH3-SH2-TK (homología Src 3-Src homología 2-tirosina quinasa) casete de dominio con en proteínas del citoesqueleto y dominios de unión al ADN, una combinación que confiere único capacidades de señalización a estas proteínas [5]. La actividad de las quinasas Abl está estrechamente regulada por un complejo conjunto de interacciones intramoleculares que inciden en el dominio quinasa Abl y dar lugar a efectivos de auto-inhibición de la actividad tirosina quinasa [6]. La interrupción de autoinhibition, como por la translocación de
ABL1
o
Abl2
junto a una variedad de genes diferentes (por ejemplo,
Bcr
,
Tel
,
ETV6
), conduce a la activación constitutiva, que impulsa tumores malignos, particularmente leucemias [4], [7], [8]. Las mutaciones en el
ABL1
gen se asocian comúnmente con leucemia mielógena crónica (LMC), donde el
ABL1
gen se activa al ser trasladadas dentro de la
Bcr gratis (breakpoint cluster region) gen en el cromosoma 22, la creación de un nuevo gen de fusión,
Bcr-Abl, que codifica una no regulada, la tirosina quinasa.
a pesar de ABL1 y Abl2 son bien conocidos para impulsar el desarrollo de la leucemia, su papel en la tumores sólidos ha sido apreciada sólo recientemente [4]. c-Abl y /o Abl2 se activan en algunas líneas celulares de tumores sólidos a través de mecanismos únicos que no implican la mutación del gen /translocación, y su activación promueve la proliferación, degradación de la matriz, la invasión, la tumorigénesis y /o metástasis, en función del tipo de tumor [4]. La evidencia acumulada sugiere que la activación de c-Abl /Abl2 promueve la progresión del cáncer de próstata [4]. c-Abl y /o expresión Abl2 se incrementó significativamente (evaluada por inmunohistoquímica [IHC]) en diversos tumores, incluyendo cáncer de próstata [4], [9], [10]. Significativamente, silenciando c-Abl inhibió la proliferación de osteoblastos y promueve la diferenciación de osteoblastos, lo que indica que la inhibición de c-Abl puede prevenir el crecimiento óseo metastásico [11]. Dasatinib (BMS-354825), una doble familia de quinasas Src (SFK) [12] y el inhibidor de quinasa Abl [13] está siendo probado clínicamente para el tratamiento de las metástasis óseas del cáncer de próstata y se encuentra actualmente en la Fase 3 de ensayos clínicos [14] - [ ,,,0],dieciséis]. Otro inhibidor bosutinib SFK /Abl (SKI-606) bloqueó la migración, invasión, crecimiento independiente de anclaje, y la proliferación de PC3 y 145 DU-células de cáncer de próstata acompañado de un descenso significativo en la fosforilación de moléculas de señalización (AKT, la proteína quinasa activada por mitógeno , la quinasa de adhesión focal) [17]. Por otra parte, bosutinib inhibida
in vivo
PC3 crecimiento del tumor mediante inyección o subcuteaneous intraskeletal [4], [17]. La activación de c-Abl por el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) promovió próstata supervivencia de células de cáncer [18]. quinasas Abl también juegan un papel en la regulación de la motilidad del cáncer de próstata /invasión y la progresión [19] - [21]. Por lo tanto, las quinasas Abl juegan un papel importante en el cáncer de próstata y representan objetivos importantes para la terapia específica contra el cáncer. Sin embargo, el mecanismo molecular de la sobre-expresión de las quinasas Abl en el cáncer de próstata no se conoce. Aquí mostramos que las quinasas Abl están regulados por una novela microARN, miR-4723, en el cáncer de próstata.
Los microARN (miARN) constituyen una clase conservado evolutivamente de los ARN no codificantes pequeñas que regulan negativamente la expresión de múltiples genes a través de secuencia- interacciones específicas con los extremos 3 'regiones no traducidas (UTRs) de mRNA objetivos afines [22]. Se ha establecido firmemente que los miRNAs controlan diversos procesos celulares fundamentales, como la proliferación, la apoptosis, la diferenciación, el desarrollo [23], y están implicados en enfermedades humanas, incluyendo el cáncer [24]. miRNAs se han identificado que funcionan como oncogenes clásicos o genes supresores de tumores [24]. La evidencia acumulada sugiere que existen correlaciones entre la expresión de los genes miARN y la recurrencia clínica, el desarrollo de metástasis y /o la supervivencia [25], [26]. Debido a sus tejidos y las enfermedades específicas de los patrones de expresión y el potencial de reglamentación, los miRNAs están siendo evaluados como potenciales biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de tumores malignos humanos [27].
MIR-4723 se descubrió un poco miARN [28], que no se ha estudiado. Se analizó la expresión de miR-4723-5p (principal forma de miR-4723, conocido como MIR-4723) expresión en una cohorte de muestras clínicas de cáncer de próstata y encontró que la expresión de miR-4723 es ampliamente atenuada en el cáncer de próstata y se correlacionó significativamente con un peor pronóstico de supervivencia y la progresión tumoral. Los estudios funcionales utilizando líneas celulares de cáncer de próstata mostró que la reconstitución de la expresión de miR-4723 condujo a una disminución significativa en el crecimiento celular, clonability, la invasión y la migración. Significativamente, miR-4723 reexpresión condujo a la inducción dramática de la apoptosis en líneas celulares de cáncer de próstata que sugieren que miR-4723 es un miARN pro-apoptóticos que regula la carcinogénesis de próstata. Además, nuestros datos sugieren que esta novela miRNA es un importante regulador de ABL1 y Abl2 quinasas que a su vez regula la carcinogénesis de próstata. A nuestro entender este es el primer informe que (i) define novela miARN mediada por la regulación de las quinasas Abl en cáncer de próstata y (ii) identifica una novela supresor de tumores de miARN en el cáncer de próstata. Este mecanismo de regulación será potencialmente útil para la intervención terapéutica en el cáncer de próstata.
Resultados
expresión de miR-4723 es ampliamente atenuada en el cáncer de próstata
Para evaluar el papel de miR 4723 en el cáncer de próstata, la expresión de miR-4723 se ensayó en muestras humanas clínicos humanos de próstata (fig. 1A). características clínico-patológicas de los pacientes se resumen en la Tabla S1. Se examinaron los niveles de expresión de miR-4723 de captura por láser microdissected tejidos (LCM) de cáncer de próstata (n = 57) y las regiones adyacentes normales emparejados por PCR en tiempo real. Mientras que la expresión de miR-4723 no fue modificado en 6/57 casos (10%) y mayor en 9/57 casos (16%), una fracción importante de muestras de tejido (42/57, ~74%) mostraron menor miR-4723 niveles relativos a los tejidos normales emparejados. Las diferencias fueron estadísticamente significativas con la prueba de Wilcoxon Signed Rank (p & lt; 0,0001). Esto sugiere que miR-4723 es ampliamente downregulated en cáncer de próstata y es un potencial supresor de tumor de cáncer de próstata
.
(A) Análisis de RT-PCR cuantitativa de niveles relativos de expresión de miR-4723 en microdissected captura por láser (LCM) PCa tejidos (n = 57) y el paciente corresponde regiones normales adyacentes. Los datos se normalizaron con el control RNU48. Tabla resume los niveles relativos de expresión de miR-4723 en estos especímenes. (B) Correlación de la expresión de miR-4723 con las características clínico-patológicas de los pacientes con cáncer de próstata, incluyendo el grado de Gleason, el estadio patológico y la recurrencia bioquímica.
La regulación por disminución de la expresión de miR-4723 se asocia con la progresión tumoral en el cáncer de próstata
se determinó si la expresión de miR-4723 en los tejidos clínicos se correlacionó con las características clínico-patológicas tales como el grado de Gleason, el estadio patológico y la recurrencia bioquímica del carcinoma (fig. 1B). Se observó disminución de la expresión de miR-4723 en el 66% de los casos de bajo grado de Gleason (4-6), el 74% de los casos de Gleason 7 y en el 75% de los casos de más alto grado de Gleason (8-10). Esta tendencia sugiere que la expresión de miR-4723 tiende a disminuir en el cáncer de próstata de grado superior. Del mismo modo, se observó una disminución de expresión de miR-4723 en el 68% de los casos de estadio pT2 patológica frente al 73% de los casos de pT3 mientras que no hubo correlación significativa con la recurrencia bioquímica.
MIR-4723 es un potencial de diagnóstico y pronóstico marcador en el cáncer de próstata
a la vista de la regulación a la baja generalizada observada de miR-4723 en muestras clínicas de cáncer de próstata, se evaluó el potencial importancia clínica de la expresión de miR-4723. Para determinar la capacidad potencial de miR-4723 como un biomarcador de diagnóstico para el cáncer de próstata, se realizó ROC (característica operativa del receptor) analiza en la cohorte de muestras clínicas (Fig. 2A). Los análisis de ROC mostró que la expresión de miR-4723 puede ser un único parámetro significativo para discriminar entre tejidos normales y tumorales, con un área bajo la curva ROC (AUC) de 0,727 (IC del 95%: 0,655 a 0,792, p & lt; 0,0001). Además, se estratificó nuestra cohorte clínica de cáncer de próstata basado en la expresión de miR-4723 y se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Este análisis mostró que la supervivencia se redujo significativamente en los pacientes con baja expresión de miR-4723 (Fig. 2B) (p = 0,0431). Estos análisis sugieren que miR-4723 tiene un potencial significativo para ser utilizado como un marcador de diagnóstico y pronóstico para cáncer de próstata.
(A) análisis de la curva ROC que muestra la capacidad de expresión de miR-4723 para discriminar entre malignos y no muestras de tejido de próstata malignos. Las curvas de supervivencia (B) de Kaplan-Meier para los pacientes con cáncer de próstata, estratificado basan en la expresión de miR-4723 (bajo y alto). valor de p basado en el test de rangos logarítmicos (* p & lt; 0,05).
MIR-4723 sobreexpresión suprime la tumorigenicidad de las células del cáncer de próstata
Para evaluar el potencial de un papel supresor tumoral de miR-4723, que sobreexpresa miR-4723 en líneas celulares de cáncer de próstata (PC3 y LNCaP) seguido por ensayos funcionales (Fig. 3). La transfección transitoria de miR-4723 precursora condujo a la sobreexpresión de miR-4723 según lo determinado por PCR en tiempo real (Fig. S1). La expresión de miR-4723 dio lugar a cambios morfológicos marcadas en ambas líneas celulares (Fig. 3A). Específicamente, una disminución pronunciada en la fracción de células alargadas, en forma de huso fue acompañado de un aumento de células redondeadas, apoptóticas. Las alteraciones morfológicas observadas con la sobreexpresión de miR-4723 sugieren un aumento de células apoptóticas. Se observó una disminución significativa de la viabilidad celular con el tiempo en PC3 /células LNCaP que sobreexpresan miR-4723 (Fig. 3B) en comparación con las células que expresan el control de miR (miR-CON). la sobreexpresión de miR-4723 también disminuyó clonogenicidad de las células PC3 /LNCaP en comparación con el miR-CON (Fig. 3C). migración Transwell y ensayos de invasión mostraron que la expresión de miR-4723 disminuyó la migración (Fig. 3D) y la invasión (Fig. 3E) de ambas líneas celulares. Estas observaciones sugieren que la sobreexpresión de miR-4723 suprime la tumorigenicidad de las células del cáncer de próstata.
Para evaluar la importancia funcional de MIR-4723 en el cáncer de próstata, el miR-4723 precursor se sobreexpresa en PC3 /LNCaP líneas celulares mediante transfección transitoria seguido por ensayos funcionales (realizada 72 horas después de la transfección). (A) Las alteraciones morfológicas en PC3 /células LNCaP partir de su expresión de miR-4723 evaluada por contraste de fase microsopy. (B) ensayo de viabilidad celular, invasión de ensayo (C) Ensayo de formación de colonias, (D) ensayo Transwell migración y (E) en las células PC3 /LNCaP transfectadas de forma simulada o transfectadas con el miR-CON o miR-4723 (* P & lt; 0,05 ).
La sobreexpresión de miR-4723 induce la apoptosis en células de cáncer de próstata
Nos medimos la apoptosis en el control (simulada o el miR-cON transfectadas) y células transfectadas-MIR-4723 por el flujo análisis de citometría de células PC3 teñidas con anexina-V-FITC-7-AAD (Fig. 4A-B). Se observó que las fracciones de células apoptóticas promedio (Early apoptótica + apoptóticas) se incrementaron significativamente en el miR-4723 reexpresión (12% + 5%) en comparación con el miR-CON o células transfectadas de manera simulada (3% + 1%), con una disminución concomitante en la población de células viable. Esto apunta a un papel pro-apoptótica de miR-4723 y sugiere que el miR-4723 afecta a las vías de apoptosis en la regulación de la tumorigenicidad.
ensayo (A) La apoptosis en las células PC3 después (paneles de la izquierda) de miR-CON o miR 4723 (paneles de la derecha) transfección durante 72 horas como se evaluó mediante tinción con anexina V-FITC /7-AAD. (B) Representación de fracciones medias de apoptosis temprana (+ finales de apoptosis) en cada grupo (* p & lt; 0,05) guía empresas
MIR-4723 Induce G2-M detención en células de cáncer de próstata
FACS (fluorescencia clasificación de células activadas) análisis mostró que la expresión de miR-4723 en células PC3 conducen a un aumento significativo en el número de células en la fase G2-M del ciclo celular en comparación con miR-cON (Fig. 5) . Esto sugiere que el miR-4723 de expresión induce la detención G2-M en las células del cáncer de próstata.
Análisis del ciclo celular después del simulacro (panel izquierdo) /miR-CON (panel central) o miR-4723 (panel de la derecha) que muestra tratamientos inducción de la G2 /M fase de la detención por miR-4723. 72 horas después de la transfección. Las células fueron teñidas con DAPI tinción nuclear para el análisis FACS.
Los objetivos de miR-4723 quinasas Abl en células de cáncer de próstata
Para identificar los efectores de miR-4723, una lista de posibles objetivos miARN fue creado mediante la combinación de objetivos previsto del algoritmo de predicción de destino miRDB [29], [30] y de perfiles de la expresión de genes relacionados con la apoptosis y el ciclo celular usando vía centró PCR Arrays. En consonancia con los efectos observados de miR-4723 sobre la apoptosis y el ciclo celular, encontramos varias moléculas clave de estos procesos celulares como posibles objetivos de miR-4723. Perfilado de genes relacionados con el ciclo de la apoptosis y de células mostró consistentemente regulación a la baja del gen ABL1 (Fig. 6A-B). Para validar estos resultados, se realizó un análisis de RT-PCR para examinar los niveles de expresión relativa de ARNm de ABL1 y encontramos que el miR-4723 sobreexpresión conduce a la disminución de la expresión ABL1 (Fig. 6C). Esto sugiere que el miR-4723 reprime ABL1 a través de la degradación del ARNm.
(A) de perfiles de genes de apoptosis y, los genes relacionados con el ciclo celular (B) después de la sobreexpresión de miR-4723 en células PC3 que muestran regulación a la baja de ABL1 por miR 4723. (C) la expresión de ARNm relativa del gen ABL1 como se evaluó mediante RT-PCR. (D) Representación esquemática de la ABL1 y Abl2 3'-UTRs que muestra las posiciones relativas de los sitios putativos de unión de miR-4723. (E) Las inmunotransferencias de endógeno ABL1, Abl2 y otros objetivos de miR-4723 en células PC3 transfectadas como se ha indicado. GAPDH se utilizó un control de carga. (F) ABL1 3 'UTR constructo que abarca los sitios de unión de miR-4723 o el constructo de control se cotransfectaron en células PC3 con miR-4723 o miR-CON y se ensayó la actividad de luciferasa relativa (* p & lt; 0,05)
Nuestro
in silico
análisis mostró que ABL1 posee cinco sitios potenciales de miR-4723 de destino dentro de su 3'-UTR (Fig. 6D). 2-5 sitios se conservan evolutivamente en los primates (chimpancés, gorilas, monos rhesus) (Fig. S2). Además, encontramos que la estrecha relación Abl2 posee un sitio potencial de miR-4723 de destino dentro de su 3'-UTR (Fig. 6D, panel inferior). Este sitio se conserva en el chimpancé y el gorila (Fig. S2).
Guiados por estos hallazgos, se realizó un análisis Western blot para putativo objetivos de miR-4723 en células PC3 que eran o transfectadas o transfectadas con miR-4723 simulacro /miR-CON (Fig. 6E). Curiosamente, la sobreexpresión de miR-4723 condujo a una disminución de los niveles de proteína de ABL1 y Abl2 que codifican la familia Abelson de las proteínas quinasas de tirosina nonreceptor. Además, se encontró que el miR-4723 reprime la proteína de unión a metil CpG (MeCP2) y la integrina alfa 3 (ITGA3). El 3'UTR de MeCP2 posee diez posibles sitios diana de miR-4723, mientras que la de ITGA3 tienen cuatro posibles sitios diana de miR-4723 (Fig. S3).
Hemos investigado si el protooncogén c-Abl es un funcional directa objetivo de miR-4723 en el cáncer de próstata. La transfección transitoria de células de cáncer PC3 humanos con el plásmido ABL1 3'UTR junto con miR-4723 precursor condujo a una disminución significativa en la actividad del promotor en comparación con el vector de control (Fig. 6E) lo que sugiere que miR-4723 reprime directamente este gen. Estas observaciones nos llevaron a concluir que el miR-4723 regula una cohorte de genes que desempeñan un papel importante en la supervivencia celular, la adhesión, invasión y metástasis quinasas Abl particular.
ABL1 Derribo parcialmente Fenocopias miR-4723 Reexpresión en el cáncer de próstata las células
para determinar si Abl es un objetivo funcionalmente relevante de miR-4723 en el cáncer de próstata, que inhibió la expresión ABL1 utilizando siRNA para ver si ABL1 caída funcionalmente imita los efectos de la sobreexpresión de miR-4723. Se han tratado las células PC3 con ABL1 siRNA seguido de
in vitro
ensayos funcionales (Fig. 7). Dos juegos de siRNA contra Abl1- ABL1 siRNA1 y siRNA2- se utilizaron para lograr knockdown eficiente tal como se evaluó mediante análisis de inmunotransferencia (Fig. 7A). siRNA no específica (NS) se utilizó como control. Una disminución significativa de la viabilidad celular se observó en células PC3 tratadas ABL1 siRNA en comparación con las células tratadas con ARNsi de control (Fig. 7B). ABL1 desmontables también condujo a la disminución de la clonogenicidad de células PC3 en comparación con el control (Fig. 7C). Análisis del ciclo celular mostró que ABL1 caída condujo a la detención fase G2-M similar a la sobreexpresión de miR-4723 (Fig. 7D). ensayo de apoptosis mostró que fracciones de células apoptóticas se incrementaron significativamente en ABL1 caída en comparación con las células de control tratadas con ARNsi, un efecto similar a la observada en miR-4723 reintroducción en células PC3 (Fig. 7E). Estos resultados sugieren que ABL1 es un determinante importante de las propiedades tumorigénicas de las células de cáncer de próstata y que la inhibición ABL1 phenocopies parcialmente los efectos anti-tumorigénicos de miR-4723 en el cáncer de próstata.
células PC3 fueron transfectadas con siRNA ABL1 /siRNA de control no específico (NS) durante 72 h seguido de diversos ensayos. Dos juegos de siRNA contra Abl1- ABL1 siRNA1 y siRNA2- se utilizaron para los ensayos funcionales. (A) Expresión relativa de proteínas después de transfecciones ABL1 siRNA como se evaluó por inmunotransferencia. GAPDH se utilizó como control de carga. (B) Ensayo de viabilidad celular, (C) Ensayo de formación de colonias, (D) Análisis del ciclo celular, ensayo (E) La apoptosis en las células PC3 después NS siRNA (panel izquierdo) /ABL1 siRNA1 (panel central) /ABL1 siRNA2 (panel derecho) tratamientos.
la expresión de la quinasa Abl es inversamente correlacionada con la expresión de miR-4723 en el cáncer de próstata
Para confirmar aún más Abl como diana patológicamente relevante de miR-4723
in vivo
, se analizó la correlación entre el miR-4723 y la expresión Abl en un subconjunto de nuestra cohorte clínica. Se realizó la tinción inmunohistoquímica para Abl en los tejidos PCA (n = 12) y se observó una correlación negativa entre Abl y la expresión de miR-4723 (Fig. 8). Las muestras clínicas con baja expresión de miR-4723 (en relación con el tejido normal adyacente) mostraron altos niveles de expresión Abl (Fig. 8).
Se examinó la correlación entre el miR-4723 y la expresión Abl en un subconjunto de nuestra clínica cohorte mediante la realización de la tinción inmunohistoquímica para Abl en los tejidos de CaP (n = 12). Niveles relativos de expresión de Abl (como se anotó por IHC) y miR-4723 (según lo determinado por RT-PCR) para las muestras analizadas se representan en el gráfico de barras.
Discusión
un cuerpo expansivo de la literatura muestra que los miRNAs son significativamente alteradas en el cáncer de próstata [31]. A medida que se están estudiando las interacciones moleculares de miRNAs con sus genes diana afines, el presente estudio tuvo como objetivo identificar nuevos miRNAs que regulan la carcinogénesis de próstata. En este estudio, hemos identificado un nuevo miARN-tumor supresor, miR-4723, en el cáncer de próstata. MIR-4723 es un miARN descubierto recientemente [28], que no se ha explorado todavía. Expresión de perfiles de expresión de miR-4723 en una cohorte de muestras clínicas de cáncer de próstata mostró que la expresión de miR-4723 es ampliamente regulado por disminución en el cáncer de próstata. En vista de su baja expresión, se evaluó el potencial de miR-4723 como un biomarcador del cáncer de próstata. Nuestros análisis sugieren que la expresión de miR-bajo 4723 puede ser un parámetro importante para discriminar entre los tejidos de la próstata y tumorales normales. Además, la baja expresión de miR-4723 se correlacionó significativamente con un peor pronóstico de supervivencia y la progresión tumoral en muestras clínicas. Estos hallazgos sugieren que esta novela miARN tiene un potencial significativo como un biomarcador para el diagnóstico de la enfermedad y el pronóstico del cáncer de próstata
.
La regulación a la baja observada de la expresión de miR-4723 en muestras clínicas CaP también sugirió que esta novela miARN puede poseer a un tumor supresor actividad. Para probar esto, hemos realizado estudios funcionales utilizando células de cáncer de próstata PC3 y las líneas de LNCaP. Overexpressed miR-4723 en estas líneas celulares de CaP seguido por ensayos funcionales. Nuestros datos sugieren que la sobreexpresión de miR-4723 en células de CaP suprime la tumorigenicidad, lo que confirma el papel supresor de tumor de miR-4723 en el cáncer de próstata. MIR-4723 sobreexpresión condujo a una disminución significativa en el crecimiento celular, clonability, la invasión y la migración. Es importante destacar que estos estudios indican que miR-4723 es un miARN pro-apoptóticos que regula la carcinogénesis de próstata. Este es el primer informe que implican un papel supresor de tumores para este miARN en el cáncer de próstata en el que mostrar que tiene un papel pro-apoptótica importante
.
En células de mamíferos, miRNAs causa de silenciamiento génico de sus genes diana a través tanto de traslación inhibición y la degradación del ARNm y un miARN individuo es capaz de regular docenas de mRNAs diferentes [22]. Para comprender el papel funcional de miR-4723 en la carcinogénesis de próstata, buscamos los genes diana putativos que juegan un papel importante en la supervivencia celular, la adhesión, invasión y metástasis. Nuestros datos sugieren que el protooncogén c-Abl y Abl2 /Arg son objetivos funcionales importantes de miR-4723 en el cáncer de próstata. ABL1 y Abl2 codifican la familia Abelson de las proteínas quinasas de tirosina nonreceptor que se expresa de forma ubicua y altamente conservada en la evolución metazoan [3]. Estas quinasas juegan un papel en la regulación de la proliferación celular, la diferenciación, la apoptosis, la adhesión celular y las respuestas al estrés [3]. la actividad aberrante de estas tirosina quinasas han sido implicados en la estimulación del crecimiento y progresión del cáncer en diversos tumores, particularmente leucemias. Los estudios sugieren que la activación de c-Abl /Abl2 promueve la progresión del cáncer de próstata [4]. En los tumores de próstata, c-Abl y /o expresión Abl2 fue significativamente mayor tal como se evaluó por inmunohistoquímica [IHC]) [4], [9], [10]. La activación de c-Abl por el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) promovió la supervivencia de células de cáncer de próstata mediante la inducción de la expresión de la proteína antiapoptótica, MCL-1, a través de una vía de señalización p68 /β-catenina [18]. quinasas Abl también juegan un papel en la motilidad /invasión de células de cáncer de próstata, como la fosforilación mediada por Arg c-Abl /de la galectina-3 impedido su escisión por PSA que aumenta de longitud completa extracelular galectina-3 y promoción de la migración y la invasión de células de CaP [19], [21]. Un papel de c-Abl en la progresión del cáncer de próstata se ha demostrado debido a su capacidad para fosforilar un Wiskott-Aldrich familia de proteínas síndrome, miembro 3 (WASF3), una proteína que controla la motilidad celular y la invasión y se regula positivamente en CaP avanzado metastásico [20 ]. Por lo tanto, estas quinasas son objetivos importantes para específico terapia contra el cáncer y los inhibidores de la quinasa Abl son actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de la metástasis ósea del cáncer de próstata. Dasatinib (BMS-354825), una familia de quinasas Src doble (SFK) [12] y Abl inhibidor de quinasa [13] se encuentra actualmente en la Fase 3 de ensayos clínicos [14] - [16]. El dasatinib suprime la proliferación y mejora la diferenciación de los osteoblastos, lo que indica que la inhibición de c-Abl puede prevenir el crecimiento óseo metastásico [11]. Bosutinib (SKI-606), otro inhibidor de la SFK /Abl, inhibe el crecimiento de células de cáncer de próstata
in vitro
y
in vivo
[17]. En general, estos estudios sugieren que las quinasas Abl juegan un papel importante en el cáncer de próstata. Sin embargo, los mecanismos de regulación de las actividades de quinasas Abl no se entienden completamente. Aquí mostramos una novela mediada por la regulación de los genes miARN de estas quinasas en el cáncer de próstata.
mediada por la regulación de microARN ABL1 y Bcr-Abl ha sido explorada en tumores malignos hematopoyéticos. Bueno
et al.
Mostró que ABL1 es un objetivo directo de miR-203 en tumores malignos hematopoyéticos. miR-203 es silenciada por mecanismos genéticos y epigenéticos en las neoplasias hematopoyéticas que expresan niveles ABL1 y BCR-ABL1 y inhibe la proliferación celular [32] ABL1 o Bcr-ABL1, y la restauración de miR-203 expresión reducida, [33]. En un estudio reciente, el miR-451 también se ha demostrado que regulan negativamente la expresión Bcr-Abl en la leucemia mieloide crónica [34], [35]. Sin embargo, estos estudios carecen de cáncer de próstata. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe para mostrar novela miARN mediada por la inactivación de las quinasas Abl en el cáncer de próstata. En vista de nuestros resultados actuales, se sugiere que los efectos observados de miR-4723 sobre la apoptosis, la proliferación, la invasión y la migración están mediados por su capacidad para reprimir las quinasas Abl.
Un miARN individuo es capaz de regular varios distinta mRNAs [36], [37], y se ha demostrado que la supresión pleiotrópico de múltiples objetivos de abajo puede explicar los cambios fenotípicos observados por niveles alterados de ciertos miRNAs [38] - [42]. Encontramos que el miR-4723 también reprime la proteína de unión a metil CpG (MeCP2) y la integrina alfa 3 (ITGA3). MeCP2 es una proteína multifuncional nuclear involucrado en varios procesos celulares, tales como la reorganización de la cromatina, la arquitectura y la regulación transcripcional [43]. En los últimos años, un papel para MeCP2 ha surgido en el crecimiento celular y la proliferación [44]. En el cáncer de próstata, los estudios sugieren que la MeCP2 se requiere para el crecimiento de células de cáncer de próstata [45], [46]. La inhibición de la expresión de MeCP2 por estable de ARN de horquilla corta detuvo el crecimiento de células tanto normales como de próstata humano cáncer mientras que la expresión ectópica MeCP2 confiere una ventaja de crecimiento a las células de cáncer de próstata humanos. células dependientes de andrógenos Es importante destacar que, su expresión se dejan crecer de forma independiente de la estimulación de andrógenos y para mantener las propiedades tumorigénicas en condiciones de andrógenos empobrecido en [45]. En otro estudio, el silenciamiento de MeCP2 en las células PC3 llevó a disminución de la proliferación y aumento de la apoptosis [46]. Integrina A3 (ITGA3), una molécula de adhesión celular de la familia de las integrinas, desempeña un número de funciones esenciales en procesos necesarios para la progresión del cáncer, incluyendo la proliferación, la supervivencia, la invasión y la metástasis [47]. Esta integrina de los receptores de formularios complejos con diversos membrana, citoesqueleto y moléculas de señalización que regulan la adhesión celular, la migración, la transducción de señal a través de las membranas celulares, y la organización del citoesqueleto [47], [48]. Las integrinas son objetivos atractivos para la terapéutica contra el cáncer y ha habido preclínica y desarrollo clínico de los antagonistas de las integrinas de orientación [49].
En conclusión, nuestro estudio identifica el miR-4723 como un miARN importante que regula el crecimiento del cáncer de próstata a través la inactivación de las quinasas Abl, MeCP2, ITGA3. Nuestro estudio establece que la baja expresión de miR-4723 se asocia a peor supervivencia y la progresión del cáncer de próstata. escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes y el estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Humana de la UCSF (Número de autorización: H9058-35751-01).