Se han propuesto
Extracto
miRNAs a ser los principales reguladores de la progresión y la metástasis en el cáncer. Sin embargo, se necesita una comprensión de sus funciones y mecanismos moleculares para proporcionar una visión más profunda de mejores oportunidades terapéuticas. En este estudio se investigó el papel y el mecanismo de miR-493 en el desarrollo y progresión del cáncer de pulmón no microcítico (CPNM). Nuestros datos indican que la expresión de miR-493 se redujo notablemente en el carcinoma pulmonar. La expresión ectópica de miR-493 retraso del crecimiento celular y la invasión in vitro e in vivo. Mecánicamente, miR-493 dirigido comúnmente directamente E2F1, que resultó en un robusto reducción de la expresión de mRNA y proteína. Este efecto, a su vez, disminuye el crecimiento, invasión y metástasis de células de cáncer de pulmón. Nuestros resultados destacan la importancia de la disfunción de miR-493 en la promoción de la progresión del tumor, e implicar a miR-493 como una posible diana terapéutica en el cáncer de pulmón
Visto:. Gu Y, Cheng Y, Canción Y, Z Zhang, Deng M, Wang C, et al. (2014) microARN-493 suprime el crecimiento tumoral, invasión y metástasis de cáncer de pulmón mediante el control de E2F1. PLoS ONE 9 (8): e102602. doi: 10.1371 /journal.pone.0102602
Editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, India
Recibido: 28 Marzo, 2014; Aceptado 19 de junio de 2014; Publicado: 8 Agosto 2014
Derechos de Autor © 2014 Gu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Disponibilidad de datos:. La autores confirman que todos los datos que se basan los resultados son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información en papel y
Financiación:. El estudio fue apoyado financieramente por becas de la Fundación de Ciencias de China Postdoctoral (Código Proyecto: 2012M521588), http://jj.chinapostdoctor.org .cn /V1 /Program1 /Default.aspx. La fuente de financiación no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es el subtipo de cáncer histológico más frecuente en todo el mundo [1]. Debido a que la mayoría de los pacientes se presentan con enfermedad invasiva, metastásica [2], la comprensión de la base de la progresión del cáncer de pulmón es de vital importancia. Muchos factores, incluyendo los supresores de tumores y oncogenes, están implicados en la tumorigénesis pulmonar o progresión. [3], [4]. Recientemente, los miembros clásicos de genes que codifican proteínas se han ampliado para incluir un tipo de molécula de ARN no codificante de la proteína conocida como microRNA (miRNA) [5], [6], [7]. miRNAs son 19-24 nucleótidos de longitud, y que regulan la expresión de genes a través imperfecta de apareamiento de bases con secuencias complementarias localizadas principalmente, pero no exclusivamente, en las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de ARNm diana. Por lo tanto, los miRNAs representan una de las principales familias reguladoras de los genes en las células eucariotas, y funcionan mediante la inducción de la traducción y la transcripción represión degradación [8], [9]. pruebas rápidamente emergente sugiere fuertemente que los miRNAs juegan un papel crucial en la tumorigénesis y la progresión [10], [11], [12]. Por ejemplo, miR-34 según se informa impide la iniciación y progresión del cáncer en adenocarcinoma de pulmón [13]. miRNA-218, un nuevo regulador de HMGB1, según los informes, suprime la migración celular y la invasión en el cáncer de pulmón de células no pequeñas [14]. Sin embargo, se necesita más conocimiento de los mecanismos moleculares de los genes miARN permite examinar más a desarrollar mejores oportunidades terapéuticas para los pacientes con cáncer de pulmón.
En nuestro estudio reciente (Chen, et, al. Documento no publicado), se utilizó un microarray de miARN para encontrar que la expresión de miR-493 se redujo notablemente en las células 95D, una línea celular de cáncer de pulmón metastásico altamente, en comparación con HBE, una línea celular inmortalizada epiteliales bronquiales humanas. Por lo tanto, la hipótesis de que el miR-493 podría desempeñar un papel importante en la tumorigénesis y la progresión del cáncer de pulmón.
Para probar esta hipótesis, hemos examinado la expresión de miR-493 usando QRT-PCR en líneas celulares de cáncer de pulmón y 6 65 de tejido de cáncer de pulmón especímenes en el presente estudio. Los datos mostraron que la expresión de miR-493 se redujo notablemente en las células de cáncer de pulmón y tejidos. Funcional in vitro y en ensayos in vivo indicaron que miR-493 inhibió la proliferación de células de cáncer de pulmón, invasión y metástasis por la orientación directamente la 3'-UTR de E2F1 para provocar una caída específica y robusta de la proteína. Nuestros resultados destacan la importancia de la disfunción de miR-493 en la promoción de la progresión del tumor y la tumorigénesis; e implicar el miR-493 como una posible diana terapéutica en el cáncer de pulmón.
Resultados
miR-493 se regulados a la baja en el cáncer de pulmón y negativamente relacionado con la supervivencia
Para identificar la desregulación de miRNA-493 en el cáncer de pulmón, hemos examinado la expresión de miR-493 usando PCR en tiempo real en las líneas 6 celulares derivadas de cáncer de pulmón y una línea de fibroblastos de pulmón (MRC5); así como una célula inmortalizada epiteliales bronquiales humanas (HBE). Los datos indicaron que miR-493 expresión se redujo significativamente en células de cáncer de pulmón, especialmente en 95D, una línea celular de cáncer de pulmón altamente metastásico (figura 1A). Además, se compararon los niveles de expresión de miRNA-493 en 65 frescos tejidos de cáncer de pulmón por PCR en tiempo real. Del mismo modo, la expresión de miR-493 fue significativamente menor en los tejidos de cáncer de pulmón que en los correspondientes tejidos pulmonares normales (figura 1B). Para determinar si la regulación a la baja de miR-493 impactos de los fenotipos de cáncer de pulmón o signos patológicos clínicos, se empleó un análisis de correlación y se encontró que el nivel de expresión de miR-493 se correlaciona inversamente con la metástasis tumoral (p = 0,038), pero no otros parámetros patológicos tales que la etapa clínica (tabla 1). Además, un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier se llevó a cabo utilizando la supervivencia del paciente global (OS, figura 1C) y la supervivencia libre de enfermedad (DFS; figura 1D) para analizar la importancia de miR-493 adicional en términos de pronóstico clínico. Los resultados mostraron que los pacientes con baja expresión de miR-493 tenían una más corta y media OS DFS que los pacientes con alta expresión de miR-493 (P = 0,006 para el sistema operativo, P = 0,000 para la DFS; figura 1C y D). Estos datos sugieren que la regulación a la baja de miR-493 contribuye a la carcinogénesis del cáncer de pulmón y el pronóstico
.
(A) Los niveles relativos de expresión de miR-493 en las líneas 6 celulares derivadas de cáncer de pulmón y la línea de fibroblastos de pulmón (uno MRC5 ), así como una célula epitelial bronquial humana inmortalizada (HBE) se determinaron mediante qRT-PCR. Los datos se presentan como medias ± SEM de al menos 3 experimentos separados * p & lt;. 0.05, ** p & lt; 0,01. (B) Los miR-493 niveles de expresión en 65 emparejado NSLCC humana y los tejidos normales correspondientes fueron examinados por PCR en tiempo real, usando GAPDH como control interno. El valor de la expresión (Ct (N) - Ct (T)) representa la diferencia de en los niveles de miR-493 entre el tejido normal y tumoral. Un valor de expresión & gt; 1 indica que los niveles de miR-493 se incrementa en los tumores. Un valor de la expresión & lt; 1 indica que los niveles de miR-493 se reduce en los tumores. Una prueba t pareada (univariado) se utilizó para comparar la diferencia de entre el grupo normal y el grupo de cáncer. (C) Los bajos niveles de miR-493 se correlaciona con la supervivencia más corta. Las curvas OS y DFS para todos los pacientes estudiados con alta o lowmiR-493 expresión.
La sobreexpresión de miR-493 afecta la proliferación celular y la invasión
Para evaluar los efectos biológicos de la sobreexpresión de miR-493 en células de cáncer de pulmón, subconjuntos de células sobreexpresión ectópica estables 95D se construyeron /miR-493 y sus células de control emparejados H1975 /miR-493 y. Un análisis de QRT-PCR mostró que la transfección tuvieron éxito (Figura 2A). Se determinó que la sobreexpresión de miR-493 en células 95D y H1975 marcadamente con discapacidad la proliferación celular en comparación con los controles utilizando un ensayo de tasa de crecimiento celular (figura 2B), la distribución del ciclo celular (figura 2C) y un ensayo de formación de colonias (figura 2D) . Además, hemos probado si el miR-493 podría desempeñar un papel en el crecimiento del tumor usando modelos de xenoinjertos de ratones desnudos (seis ratones por grupo). 95D células transfectadas ya sea con miR-493 o un control mezclado fueron trasplantadas en ratones desnudos y se desarrollaron en tumores sólidos en 25 días. Sin embargo, el crecimiento tumoral se redujo significativamente cuando miR-493 se expresó de forma estable en células (Figura 95D 2 E). Estos resultados implicaron que el miR-493 puede suprimir fuertemente el crecimiento de células tumorales.
A, la sobreexpresión ectópica estable de miR-493 fue generada en subconjuntos de células 95D /miR-493 y H1975 /miR-493. QRT-PCR se utilizó para verificar la transfección. ** Significa P & lt; 0,001 (t-test). B, las curvas de crecimiento demostró que las células pulmonares eran capaces de proliferación. Las células se sembraron en placas de 12 pocillos a las concentraciones de células deseadas y se mantienen en medio que contiene 10% de FBS. El valor de absorción de las células se midió a los puntos de tiempo indicados por triplicado y sus tasas de crecimiento se registraron. * Significa P & lt; 0,05 (t-test). C, la distribución de las células del ciclo de las células de cáncer de pulmón se analizó con un citómetro de flujo FACScan. se utilizó el índice de proliferación (IP) para describir la potencialidad de la proliferación celular. PI = G2 + fracción S) /(G1 + G2 + S) × 100%. Izquierda, la imagen representativa del ciclo celular cambio porcentual. Derecha, el análisis estadístico del porcentaje de ciclo celular, los datos se presentan como media ± SEM de 3 experimentos independientes * significa P & lt; 0,05 (t-test). D, se utilizaron ensayos de formación de colonias para determinar el efecto de miR-493 en la supervivencia celular a largo plazo. Izquierda, se midió el área cubierta en cada placa por las colonias usando un sistema de imagen y se representa como el porcentaje de la superficie total de la placa. Derecha, el efecto de miR-493 en la sobreexpresión de la formación de colonias de células de cáncer de pulmón: cada columna representa un valor medio de los experimentos por triplicado en cada grupo. Los datos son la media ± SEM. * Significa P & lt; 0,05 (t-test). E, miR-493 inhibió el crecimiento del tumor pulmonar en modelos de xenoinjertos de ratones (12 animales). A la izquierda, los tumores representativos aislados de ratones 25 días después de la inyección subcutánea de 95D células que fueron transfectadas establemente con el vector de miR-493 que expresan o control. Derecha, los datos son la media ± SEM. * P & lt;. 0,05, (prueba t) guía empresas
Además de la inhibición del crecimiento celular, el efecto de miR-493 en la invasión tumoral y la metástasis también se trató en este estudio. Un ensayo de cicatrización de heridas mostró que miR-493 podría suprimir dramáticamente la movilidad de células tumorales en células 95D en comparación con las células transfectadas con el vector vacío (Figura 3A). Además, también se realizó un ensayo de invasión. El resultado demostró que miR-493 podría suprimir la capacidad invasiva de las células de cáncer de pulmón (figura 3B). Un modelo animal experimental se utilizó para investigar más a fondo el efecto supresor de miR-493 en la metástasis del tumor, se inyectaron 95D /miR-493 células en las venas de la cola de ratones desnudos (cinco ratones por grupo). Se utilizaron células vacías transfectadas con vector (95D /control) como controles. Los ratones se sacrificaron y se extirparon los pulmones, y las lesiones metastásicas del pulmón se detectan a continuación utilizando un sistema Bruker Pequeños Animales Imaging (Alemania) después de 28 días. Los campos de la formación de las lesiones metastásicas en el pulmón se redujeron significativamente en comparación con el grupo de control (Figura 3C). Aunque nódulos metastásicos visibles no se observaron en la superficie del pulmón, se detectaron lesiones metastásicas en el pulmón por hematoxilina y eosina (figura 4D). Estos resultados indicaron que miR-493 podría reprimir eficazmente la metástasis tumoral in vitro e in vivo.
A, ensayos de herida arañazos se llevaron a cabo en 95D células transfectadas con miR-493 y su control emparejado. Los resultados de 3 ensayos separados se promediaron juntos y se representan. *, P & lt; 0,05 (izquierda). se muestran imágenes representativas de los ensayos. Aumento original: × 200 (derecha). B, las propiedades invasivas de la H1975 y 95D Las células se analizaron con un ensayo Transwell usando una cámara recubierta con Matrigel. Las células migradas se representaron gráficamente como el número medio de células por campo de visión de 3 experimentos diferentes, como se describe en los Materiales y Métodos. * P & lt; 0,01 (izquierda). se muestran imágenes representativas de los ensayos. Aumento original: × 200 (derecha). C, se utilizaron en ensayos de metástasis in vivo para examinar la capacidad metastásica de pulmón de 95D /miR-493 células marcadas con la proteína verde fluorescente (GFP) y su célula de control emparejado 95D /control. Se inyectaron células de cáncer de pulmón en las venas de la cola de cinco ratones viejos de semana. En el día-28, todos los animales se sacrificaron y se extirparon los pulmones. Las imágenes de metástasis pulmonares se obtuvieron con un sistema de imágenes de Animales Pequeños Bruker. Después se retiró el tejido pulmonar, fijado, embebido en parafina, seccionado en serie, y se sometió a hematoxilina y eosina (H & amp; E) tinción. A la izquierda, representación de la señal de GFP detectado en cada uno de los cinco animales (las imágenes se cubrieron con fluorescencia verde y la luz blanca). Derecha, la intensidad del campo y fluorescencia metastásico difirió significativamente entre el grupo 95D /miR-493 y el grupo control. D, El examen histológico de metástasis pulmonares de células 95D /95D de control /miR-493 y por hematoxilina y eosina.
A, la alineación de secuencias de microRNAs del miR-493 y el E2F1 3'- UTR. El E2F1 3'-UTR contiene una predijo sitio de miR-493-unión. Las regiones de semillas de miR-493 y los sitios de reconocimiento de semillas en el E2F1 3'-UTR se indican en rojo. B y C, el ensayo de luciferasa de las células 95D (lado izquierdo) y H1975 células (lado derecho), que fueron co-transfectadas con el miR-493 y un indicador de luciferasa que contiene longitud completa E2F1 3'-UTR (Luc-en peso ) o un mutante (mut-Luc) en el que se mutaron los nucleótidos del sitio de miR-493 de unión. Un constructo indicador de luciferasa vacío se utilizó como un control negativo (Luc-ctrl). Las actividades de luciferasa se midieron 48 horas después de la transfección. miR-493 suprime notablemente la actividad luciferasa en construcciones de reportero Luc-wt. Los datos son las medias ± E.E.M. Para las transfecciones separadas (n = 4). * P & lt; 0,05 frente a scramble. D y E, el miR-493 transfección estable reduce la proteína E2F1 y los niveles de ARNm. F y G, El nivel de miR-493 inversamente correlacionada con la expresión de E2F1. F, Los niveles de expresión de E2F1 se midieron mediante técnicas de inmunohistoquímica en tejidos tumorales. Estos tejidos incluidos en parafina especímenes eran la misma fuente de tejido de cáncer de pulmón 65fresh antes mencionados en la figura 1. Una imagen representativa de los niveles de expresión de E2F1 en los tejidos tumorales de pulmón humano (200 ×) se muestra. G, los datos son medias ± s.e.m. * Significa P. & Lt; 0,05
miR-493 se dirige directamente a e inhibe E2F1
En base a la observación de que el miR-493 afecta a la proliferación celular, invasión y metástasis, se realizaron búsquedas de los genes diana de miR-493 en relación con la movilidad y la migración utilizando dos objetivo algoritmo de exploración (TargetScan y microRNA.org). Se predijo un gran número de diferentes genes diana. Entre estos genes candidatos objetivo, E2F1 fue seleccionado para su posterior validación experimental, no sólo porque fue identificado como objetivo de miR-493 por las dos bases de datos (figura 4A), sino también debido a su desregulación frecuente en los tejidos tumorales [15], [16 ], [17]. Un análisis de doble informador de luciferasa mostró que la co-expresión de miR-493 inhibió significativamente la actividad de la luciferasa de luciérnaga que lleva de tipo salvaje pero no mutante 3'-UTR de E2F1 (Figura 4B, C) en las células 95D y H1975, lo que indica que miR-493 puede suprimir la expresión de genes a través de su secuencia de unión al 3'-UTR de E2F1. Por otra parte, la introducción de miR-493 disminuyó la expresión de mRNA E2F1 celular y la proteína (figura 4D, E). Sin embargo, cuando la inhibición de oligonucleótidos contra miR-493 se transfectaron en células de cáncer de pulmón 95D o H1975, un patrón de expresión inversa no se observó entre miR-493 y la proteína E2F1 (datos no mostrados). Nos presume que este tratamiento miARN contribuyó a la expresión endógena mínima en ambas células de cáncer de pulmón. Además, el fenómeno fue validado por una correlación inversa entre el nivel de proteína E2F1, indicado por tinción inmunohistoquímica, y el nivel de expresión de miR-493 evaluado por Q-PCR en los tejidos de cáncer de pulmón frescos utilizados en los análisis anteriores (figura 4F , G y figura 1B).
E2F1 contribuye al efecto de la proliferación e invasión de supresión inducida por el miR-493
Además, se construyeron fragmentos de siRNA dirigidos E2F1 para reducir la expresión de E2F1 para investigar la contribución de E2F1 al efecto de miR-493 en estos fenotipos. Se encontró que la caída E2F1 podría simulación en parte, el crecimiento de las células (Figura 5 B) y la invasión de células (figura 5C y D) fenotipo inducido por la sobreexpresión de miR-493. Posteriormente, se realizaron experimentos de rescate mediante la sobreexpresión del vector E2F1-Δ3'- UTR (sin endógena 3'-UTR) en la célula que expresa el miR-493. La regulación a la baja inducida por el miR-493 de E2F1 fue rescatado después de la introducción de E2F1. Por otra parte, la sobreexpresión de E2F1 atenúa la inhibición del crecimiento celular (figura 5A) y la invasión (figura 5C y E) causada por miR-493. Estas observaciones sugieren que miR-493 se dirige específicamente a la especificidad E2F1 para contribuir al efecto de sobre el crecimiento celular y la invasión.
A, El derribo de E2F1 en parte simula la supresión de pulmón de crecimiento las células cancerosas inducida por la sobreexpresión de miR-493 en células 95D y H1975. Las curvas de crecimiento demostraron la capacidad de proliferación de las células del pulmón. El valor de absorción de las células se midió a los puntos de tiempo indicados por triplicado y sus tasas de crecimiento se registraron. B, La sobreexpresión de E2F1 exógena (sin 3'-UTR de E2F1) rescatado de la supresión de la proliferación inducida por el miR-493 en células 95D y H1975. C, T Las propiedades invasivas de H1975 y 95D células que eran o knock-down o sobreexpresión de E2F1were analizó con un ensayo Transwell usando una cámara recubierta con Matrigel. Las células migradas se representaron gráficamente como el número medio de células por campo de visión de 3 experimentos diferentes, como se describe en los Materiales y Métodos. Los datos son la media ± SD * significa p. & Lt; 0,05. D y E, se muestran imágenes representativas de los ensayos. Aumento original:. × 200
regulaciones E2F1 vía ERK y PI3K-AKT en las células H1975 y 95D
E2F1 juega un papel fundamental en la progresión del ciclo celular, que a su vez promueve las células la proliferación y la metástasis. Sin embargo, el mecanismo exacto de la función E2F1 es complejo y depende del contexto celular [18]. Un estudio reciente indica que la progresión del tumor E2F1 dependiente fue provocada por la activación de los citoplasmáticos cascadas de señalización Ras /Raf, tales como las vías PI3K-AKT [16] y MEK-ERK [19], la mayoría de los cuales regulan la proliferación celular, la supervivencia y la invasión [20], [21]. Por lo tanto, se investigó si t miR-493 regula estas vías por la orientación de E2F1. La regulación al alza de miR-493, a través de la transfección de miR-493, en las células 95D y H1975 disminuyó los niveles de fosforilación de AKT y su posterior destino GSK3 (figura 6A). Del mismo modo, miR-493 también suprimió los niveles de ERK fosforilado (figura 6A). También se observó que la caída de miR-493 a través de la transfección con anti-miR-493 en HBE, A549 y células H1299, en el que el nivel relativo de expresión de miR-493 fue mayor, el aumento de los niveles de AKT fosforilada, GSK3b y ERK ( figura 6B). Estos resultados demostraron que el Western Blot de miR-493 es regulador negativo de la AKT y ERK. Posteriormente, se realizaron experimentos de rescate mediante la sobreexpresión del vector E2F1-Δ3'- UTR (sin endógena 3'-UTR) en las células tratadas-miR-493. La regulación a la baja inducida por miR-493 de E2F1 fue rescatado de la introducción de E2F1 (figura 6C), y los niveles de fosforilación de AKT y ERK se alteró de una manera similar. Estas observaciones sugieren que el miR-493 inhibe la AKT y ERK por la orientación de E2F1.
(A) de miR-493 sobreexpresión reduce la actividad de la Akt y ERK en células H1975 y 95D. (B) La caída de miR-493 por con anti-miR 493 aumentó la actividad de AKT y la señalización de ERK en HBE, A549 y células H1299. (C) de miR-493 (o el control de codificación) que la transfección seguido de E2F1 (o vector maqueta) transfección 24 horas después en células 95D afecta AKT y ERK señalización. La actividad de la vía AKT se midió mediante el examen de la expresión de la AKT fosforilada (pAKT), mientras que la actividad de la vía EKR se midió mediante el examen de la expresión de ERK fosforilado (pERK).
Discusión
Aunque un puñado de estudios han identificado miRNAs específicos implicados en la tumorigénesis y la progresión humana [10], [11], [12]. También creemos que debe hacerse un mayor esfuerzo para identificar miRNAs pertinentes, así como los mecanismos específicos por los que cumplen sus funciones específicas, en particular con respecto a la oncogénesis y la progresión de los diferentes tipos de tumores. Aquí, hemos identificado que el miR-493, un potencial supresor tumoral candidato miARN [22], [23], se redujo notablemente en el cáncer de pulmón y que una menor expresión de miR-493 se asoció con metástasis tumoral y mal pronóstico (figura 1C, D y Tabla 1). La expresión ectópica de miR-493 atenuó marcadamente la capacidad de las células para proliferar e invadir en células de cáncer de pulmón y 95D H1975 in vitro e in vivo
.
Hasta la fecha, la caracterización de la función de miR-493 no ha sido extensa , aunque varios objetivos se han identificado con un papel clave en la migración celular y la metástasis vías, incluyendo FZD4, RhoC, MKK7 y IGF1R [22], [23], [24]. Aquí, hemos identificado una nueva diana de miR-493, E2F1. E2F1 es un importante factor de transcripción que juega un papel crítico en la progresión del ciclo celular y está estrechamente regulada por la proteína de retinoblastoma (Rb) [25]. La inactivación de Rb libera E2F1 del complejo de supresión, lo que, a su vez, induce la expresión continua de genes diana cuyos productos promover ciclo celular progresión [26]. La expresión ectópica de los resultados de E2F1 en la transformación neoplásica de las células de roedores [27], [28], y los resultados de modelos transgénicos indican que el aumento de la actividad E2F1 se asocia con el desarrollo de tumores en varios tejidos [29], [30], [31] . Las anormalidades en la expresión del gen E2F1 y /o amplificación del gen E2F1 se han descrito en varias líneas celulares de cáncer y tipos de tumores, incluyendo cáncer de pulmón [32], [33]. Es de destacar que la sobreexpresión de E2F1 se asocia frecuentemente con tumores de alto grado y supervivencia mal pronóstico de los pacientes [29], [31], [34], lo que sugiere que sus propiedades oncogénicas se extienden más allá de la capacidad de estimular el crecimiento aberrante de las células neoplásicas. De acuerdo con estos hallazgos, la evidencia más reciente ha descubierto que E2F1 es más relevante para la metástasis del cáncer y quimio-resistencia [18], [19], [35]. Aquí, mostramos que la expresión de E2F1 es alta en el cáncer de pulmón. Mientras tanto, se determinó que el miR-493 se dirige directamente a e inhibe la expresión E2F1protein. Un análisis reportero de doble luciferasa indicó que miR-493 podría unirse a la secuencia en el 3'-UTR de E2F1 (figura 4B). Además, la introducción de miR-493 disminuyó la expresión de ARNm celular E2F1 y de la proteína (Figura 5C, D) .Whereas, cuando la inhibición de oligonucleótidos contra miR-493 se fueron transfectadas en HBE, A549 y H1277 células, un patrón de expresión era inversa observada entre el miR-493 y la proteína E2F1 (Figura 6 B). Debido E2F1 juega un papel importante en la regulación de la proliferación celular, la supervivencia y la invasión, se investigó si E2F1 contribuye al efecto de miR-493 en estos fenotipos de células de cáncer de pulmón. Hemos construido fragmentos siRNA dirigidos E2F1 para reducir la expresión de E2F1, y encontramos que el derribo de E2F1 podría simular en parte el crecimiento de las células (Figura 5 A) y la invasión de células (Figura 5 D, E) fenotipo inducido por la sobreexpresión de miR-493. Además, la sobreexpresión de E2F1 (sin un endógena 3'-UTR) rescató la inhibición del crecimiento celular y la invasión causada por miR-493 (figura 5B, D y E).
Un estudio reciente indica que E2F1- la progresión del tumor dependiente estaba mediada por la activación de los citoplasmáticos Ras /Raf cascadas de señalización [19], tales como la MEK-ERK y la vía PI3K /AKT, la mayoría de los cuales regulan la proliferación celular, la supervivencia y la invasión. En este estudio, hemos demostrado que el miR-493 puede inhibir la actividad constitutiva de Akt y ERK vías por la orientación de E2F1. Posteriormente, los experimentos de rescate indicaron que la regulación a la baja inducida por miR-493 de E2F1 fue rescatado de la introducción de E2F1 (figura 3B), y los niveles de fosforilación de AKT y ERK se alteró de una manera similar. Estas observaciones sugieren que miR-493 inhibe las vías de Akt y ERK por la orientación E2F1.
En conjunto, los datos de nuestro estudio sugieren que miR-493 puede ser un potencial miARN supresora tumoral que inhibe la invasión de células y la proliferación de el bloqueo de E2F1 en el cáncer de pulmón, y posteriormente se suprime la AKT aguas abajo y las vías de señalización de ERK, para controlar la proliferación celular, la invasión y la tumorigénesis. Sin embargo, los estudios futuros tendrán que detectar más candidato objetivos en los tipos de cáncer adicionales para aclarar completamente la función de miR-493 en la tumorigénesis.
Materiales y Métodos
líneas y cultivo de células
líneas celulares de cáncer de pulmón humano (H1975, A549, H1299, H446), MRC5, una línea celular humana diploide normal de fibroblastos de pulmón, e inmortalizado células epiteliales bronquiales humanas HBE se obtuvieron de y opera según las recomendaciones de la American Type Culture Collection ( ATCC, Manassas, VA, EE.UU.) .La línea celular de cáncer de pulmón humano 95D se obtuvo del Banco de células de la Academia de Ciencias de china (Shanghai, china). El H1975, A549, H1299, H446, HBE y 95D células se mantuvieron en medio RPMI-1640 (Hyclone, EE.UU.), suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone, EE.UU.). Las células MRC5 se mantuvieron en medio DMEM (Hyclone, EE.UU.), suplementado con 10% de suero bovino fetal. (FBS; Hyclone, EE.UU.) .Las células se incubaron en una atmósfera de 5% de CO2 a 37 ° C
las muestras de pacientes
Todas las muestras de tejido fueron recogidos a través de la resección quirúrgica de pacientes diagnosticados entre marzo de 2009 y marzo de 2012 en el tumor hospital Afiliado de la Universidad médica de Guangzhou (Guangzhou, Guangdong, china). escrito el consentimiento informado se obtuvo de todos los participantes del estudio. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Guangzhou.
La transcriptasa inversa (RT)-PCR y QRT-PCR
El ARN total fue extraído a partir de células o tejidos utilizando el reactivo Trizol ( Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.), y las reacciones de RT se realizaron utilizando un cebador específico de miR-493. Los cebadores específicos de tallo-bucle RT para miR-493 y U6 se adquirieron de Ribobio co., Ltd (Guangzhou, China). El primer secuencias de E2F1 se definieron como sigue: Cebador directo: 5'-CCCATCCCAGGAGGTCACTT-3 '; cebador inverso: 5-CTGCAGGCTCACTGCTCTC-3 '. El primer secuencias de GAPDH se definieron como sigue: Cebador directo: 5'-CCACATCGCTCAGACACCAT-3 '; Cebador inverso: 5'-TGACAAGCTTCCCGTTCTCA-3 '. PCR en tiempo real se realizó utilizando un protocolo estándar para el kit SYBR Green PCR (Toyobo, Osaka, Japón). U6 y GAPDH se utilizaron como referencia para los miRNAs y mRNAs, respectivamente. Se utilizó el método 2
-ΔΔCt para determinar las cantidades relativas de la expresión génica. Cada muestra se analizó por triplicado.
análisis de transferencia de Western
La concentración de proteína en los lisados se midió con el BCA Protein Assay Kit (Bio-Rad), y 30 ug de proteína mezcla con 2 × tampón de carga SDS fue cargado por carril. Las proteínas de los lisados se separaron por 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). A continuación, las membranas se incubaron durante 12 horas a 4 ° C con un antisuero que contiene anticuerpos contra E2F1, p-ERK, andβ-actina comprado de señalización Tecnología, Akt, p-Akt, GSK3 y p-GSK3 y ERK teléfono adquirido de Sigma Tecnología -Aldrich. Un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa y ECL Western Blot reactivos de detección se utilizaron para visualisethe proteínas diana (ECL New England Biolabs), que se cuantificaron con una imagen Bio cuantificador Intelligent 1-D (Versión 2.2.1, Nihon-BioImage Ltd.). Un anticuerpo anti-β-actina se utilizó como control de carga de proteínas.
La inmunohistoquímica
Las diapositivas de tejidos incluyen 65 muestras de pulmón primario y los correspondientes tejidos epiteliales de pulmón normales. La inmunohistoquímica se realizó sobre el tejido embebido en parafina fijado con formalina usando el anticuerpo anti-E2F1 (Cell tecnología de señalización) y el método de tinción con estreptavidina-peroxidasa estándar (kits de detección de biotina-estreptavidina (ABC) de IHC, Abcam Inc, USA). Los resultados de inmunohistoquímica fue evaluado de acuerdo a la intensidad (0-4) y el porcentaje de células positivas y marcó el 0: sin manchas; 1: 10% de células positivas; 2: 11-50% de células positivas; 3: 51-75% de células positivas; 4: 0,75% cells.The positivo expresión relativa se obtiene multiplicando la intensidad por el porcentaje
reportero de luciferasa ensayo
Un pmirGLO Dual-Luciferase miARN vector de expresión diana que se utilizó para el 3. 'ensayos de luciferasa-UTR (Promega). Se seleccionaron los genes diana de miRNA-493 basado en los algoritmos de escaneo de destino [microRNA.org (http://www.microrna.org/microrna/home.do) y TargetScan (http://www.targetscan.org/) ]. Las secuencias de los cebadores utilizados fueron definidos de la siguiente manera: E2F1 cebador directo: GCCTCGAGGAGATGCTCACCTTGTCTCTG, el cebador inverso: CTAGCGGCCGCTGGATCTGCTTTTGAGTT. E2F1 mutante cebador directo: GAGGTGAGTGGGG
ACAAGG
CTGATGTGGGCAGGAGGGGTG, mutante E2F1 invierte imprimación: CCTGCCCACATCAGCCTTGTCCCCACTCACCTCTCCCATCTC. La negrita indica la XhoI (CTCGAG), y subrayado indica el sitio NotI interno. Cursiva (salvaje: GACCTTCA, mutante: ACAAGG) indica la secuencia diana. Para el ensayo de luciferasa 3'-UTR, las células 293T se cotransfectaron con hsa-miR-493 y pmirGLO Dual-Luciferase miARN objetivo con vectores de expresión de tipo salvaje o mutante secuencia diana usando un ensayo de luciferasa Lipofectamine 2000.El se llevó a cabo utilizando el Dual-Luciferase reportero sistema de ensayo (Promega) 48 horas después de la transfección. Los datos se presentan como el valor medio ± SD de tres experimentos y se comparan con el nivel de vectores de secuencia de tipo salvaje obtenidos en las células transfectadas de tipo mutante secuencia del vector que se normalizan al 100%.
producción y la infección por lentivirus
Para construir un vector que expresa miR-493, la secuencia de precursor de miR-493 (MI0003132) se sintetizó, recocido y luego insertado en el fragmento BamHI-HindIII del vector PGCI-L3 (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD EE.UU.) .Los plásmidos lentivirus fueron co-transfectadas con pLP1, PLP2 y pLP /VSVG (GeneCopoeia, Inc., Rockville, MD EE.UU.) en células 293T (Invitrogen), y los sobrenadantes que contienen virus se prepararon según Instrucciones del fabricante. Para la infección lentivirus, las células se incubaron con sobrenadantes que contienen virus en presencia de 6 mg /ml de polibreno. Se seleccionaron las células infectadas en presencia de 2 g /ml de puromicina para generar dos líneas de células monoclonales estables pareadas (una línea celular estable que expresa el miR-493, 95D-miR-493, H1975-miR-493 y su línea celular estable de control, 95D -control o control H1975-). Todas las pruebas estadísticas fueron de dos caras.