Extracto
Antecedentes
La angiogénesis es considerada como un sello distintivo en el desarrollo del cáncer y el tratamiento antiangiogénico se utiliza actualmente en el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC). Los microARN (MIR) son pequeños no codificante, endógena, ARN de cadena simple que regulan la expresión génica. En este estudio se tuvo como objetivo identificar miRs alterados significativamente relacionados con la angiogénesis en el CPNM.
Métodos
A partir de una gran cohorte de 335 pacientes con CPNM, muestras en parafina procedentes de 10 pacientes con una corta enfermedad específica se analizó la supervivencia (DSS), 10 con un largo DSS y 10 controles normales. Los MIR se cuantificaron mediante hibridación de microarrays y MIR seleccionados fueron validados por qPCR en tiempo real. Los impactos de las diferentes vías, incluyendo la angiogénesis, se evaluaron mediante análisis de enriquecimiento conjunto de genes (GSEA) derivados del análisis de proteínas a través de la relación evolutiva (Panther). Uno de los marcadores candidatos más interesantes, miR-155, fue validado por
In situ
hibridación (ISH) en la cohorte total (n = 335) y los análisis de correlación con varios marcadores angiogénicos conocidos fueron realizados.
resultados
128 MIR fueron significativamente arriba o hacia abajo-regulada; normales frente a largo DSS (n = 68) y /o normales frente a corto DSS (n = 63) y /o de larga duración versus corto DSS (n = 37). El análisis indica vía MIR relacionados con la angiogénesis para que participen en el CPNM. Hubo fuertes correlaciones significativas entre los datos de validación qPCR hibridación matriz y. Los MIR relacionados con la angiogénesis alterados significativamente alta de interés fueron el miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 y miR-424. miR-155 se correlacionó significativamente con el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2) en la cohorte total (r = 0,17, p = 0,002), aunque más prominente en el subgrupo con metástasis ganglionar (r = 0.34, P & lt; 0,001).
Varios miRs relacionados con la angiogénesis se alteran de manera significativa en el CPNM. Más estudios para comprender sus funciones biológicas y explorar su relevancia clínica están garantizados
Visto:. Donnem T, Fenton CG, Lonvik K, T Berg, Eklo K, Andersen S, et al. (2012) MicroARN Firmas en el tumor de tejidos relacionados con la angiogénesis en células no pequeñas de cáncer de pulmón. PLoS ONE 7 (1): e29671. doi: 10.1371 /journal.pone.0029671
Editor: William C. S. Cho, Hospital Queen Elizabeth, Hong Kong
Recibido: 30 de junio de 2011; Aceptó 2 de diciembre de 2011; Publicado: 25 Enero 2012
Derechos de Autor © 2012 Donnem et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. El estudio fue financiada exclusivamente por la Autoridad Noruega de Salud regional del Norte (Nord Helse RHF), que es responsable de los hospitales públicos en el norte de Noruega. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer en hombres y mujeres, y aproximadamente el 80% son el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) [1]. A pesar de las mejoras emergentes en los primeros modalidades de diagnóstico y tratamiento, la supervivencia global a los 5 años es al escaso 15%. TNM (tumor, nódulos, metástasis) etapa ha sido considerada la variable de pronóstico más importante como enfermedad en estadio temprano es un requisito previo para la resección quirúrgica completa necesaria para la cura potencial. la respuesta al tratamiento y los efectos secundarios de nuevas opciones de tratamiento han estado estrechamente relacionado con diferentes entidades histológicas de NSCLC [2] - [4]. Sin embargo, las terapias dirigidas dirigidos contra las alteraciones celulares específicos requieren una precisión sub-clasificación de NSCLC que es en gran medida más allá de las técnicas de diagnóstico histopatológico de rutina [5] Una clasificación de hoy y.
Los microARN (MIR) son pequeños no codificante, endógeno, ARN de cadena simple que regulan la expresión de genes [6] - [9]. Mediante la regulación de la expresión génica a nivel postranscripcional, miRs tienen un gran impacto en una amplia variedad de vías, incluyendo diferentes vías relacionadas con el desarrollo del cáncer. Varios estudios han explorado la desregulación de los diferentes MIR en NSCLC y su potencial oncogénico y funciones supresoras de tumores, así como su impacto pronóstico [10] - [20].
Algunas miRs parecen estar implicados en la angiogénesis [21] - [24]. La angiogénesis es un proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos a partir de los preexistentes, y desempeña un papel clave en el desarrollo de tumores [25]. inhibidores angiogénicos se utilizan en el tratamiento de NSCLC. El anticuerpo monoclonal bevacizumab en combinación con quimioterapia es aprobado por la FDA como una opción de tratamiento en pacientes con CPNM no escamoso metastásico, y muchos inhibidores de tirosina quinasa dirigidos vías angiogénicos son prometedores [3], [26].
La primera evidencia miRs muestran en la regulación de la angiogénesis procedían de ratones knockout Dicer. Dicer es una enzima crítica en la síntesis de MIR. Los ratones con déficit de Dicer murieron durante el desarrollo temprano debido al adelgazamiento de las paredes vasculares y la desorganización grave de la red de vasos sanguíneos [27]. Además, otro estudio murino mostró que un subconjunto de miRs alterados durante el cambio angiogénico se convirtió en oposición regulada en respuesta al tratamiento anti-angiogénico [23].
En una gran cohorte NSCLC no seleccionado que hemos estudiado previamente el impacto pronóstico de varios factores angiogénicos clave de crecimiento y receptores, así como el papel pronóstico de miR-155 y miR-126 por
In situ
la hibridación [28] - [38]. En este documento, se evaluaron los perfiles de expresión de miR en NSCLC mediante el uso de tejidos de pacientes seleccionados de esta cohorte. El objetivo fue identificar candidatos interesantes miR relacionados con la angiogénesis para mayor potencial a gran escala y estudios en profundidad.
Resultados
Los pacientes
demográficos, clínicos, y las variables histopatológicas en los grupos de pacientes (a largo DSS, DSS corta y controles) se muestran en la Tabla 1. la mediana de DSS fueron 8,0 (rango 6.5-9.9) y 160,5 meses (rango de 60,5 a 184,3) meses en el grupo de bajo y alto DSS, respectivamente. Había cuatro adenocarcinomas y carcinomas de células escamosas seis en cada grupo.
Micro expresión de ARN análisis
Fuera de 281 MIR, la Figura 1 muestra el número y la distribución de 128 miRs expresados diferencialmente significativos a través de diferentes comparaciones en el estudio (P & lt; 0,1 ajustados por la tasa de falso descubrimiento, FDR). El -up respectiva y las reguladas (-1,1) MIR se presentan en la Tabla S1. miR-182 fue el único de miR alterada en las tres combinaciones; normales frente a corto DSS, normales frente a largo DSS y de duración corta versus larga DSS. Un análisis de componentes principales (PCA) (Figura 2A) en todo el conjunto de muestra de valores de expresión reveló que el principal componente principal de la variación separa las muestras normales a partir de muestras de NSCLC. Para poner de relieve la diferencia entre los grupos de muestras de tumores de NSCLC se utilizó un modelo de mínimos cuadrados parciales (PLS) de puente para extraer un subespacio donde las diferencias entre los grupos son más evidentes que en la PCA (Figura 2B). La Tabla 2 muestra los diez MIR con alto factor de cambio estratificado en los grupos de supervivencia a largo versus control normal y la supervivencia a corto en comparación con el control normal. La Tabla 3 muestra los MIR con alto factor de cambio en el corto frente a los grupos de supervivencia a largo
El diagrama de Venn muestra el número de todos los miRNAs expresados diferencialmente a través de diferentes comparaciones:. El tejido de pacientes con CPNM corta supervivencia frente a los tejidos de pacientes con CPNM la supervivencia a largo, tejido de pulmón normales frente a tejidos de pacientes con CPNM con la supervivencia a largo y tejido del pulmón normales frente a tejidos de pacientes con CPNM con la supervivencia a corto. Fuera de 281 miRs evaluadas, el número de diferencial expresó miRs con FDR ajustados P. & Lt; 0,1 (n total = 128) de cada comparación se indica
(A) bidimensional PCA del MIR, deriva de 20 pacientes con NSCLC y 10 muestras de tejido de tejido pulmonar normal, que muestra la separación de los dos grupos de la muestra. (B) La trama representa los componentes 1 y 2 del modelo de PLS que se usa el tiempo de supervivencia como criterio de puntuación. El análisis separa claramente los grupos de la muestra de tejido para la supervivencia a corto y largo pacientes con CPNM. Todas las muestras son codificadas por colores según el grupo: Negro: muestras de pacientes normales; verdes: Las muestras de pacientes con supervivencia a corto; rojo:. Las muestras de pacientes con supervivencia a largo
Pathway análisis
La Tabla 4 muestra los resultados de la GSEA. El conjunto de genes conectados a 31 miRs relacionados con la angiogénesis revela la más alta puntuación de conjunto de genes de enriquecimiento nominal (NES = -1,17, p-valor nominal de 0,28, FDR 0). La Figura 3 muestra el mapa de calor que representa 31miRs conectados al conjunto de genes angiogénicos.
La diferencia en la expresión de miR entre muestras tumorales de pacientes con CPNM largo (L) y la supervivencia a corto (S) se muestra. los valores de expresión de miR se muestran en un espectro donde el regulado es de color azul y hasta regulado es de color rojo.
validación de PCR
Los diagramas de dispersión que comparan la hibridación de microarrays y qPCR datos de 28 miRs seleccionados se muestran en la Figura 4. El incluidos miRs, y los datos de las tres combinaciones (tanto de hibridación y qPCR) se enumeran en la Tabla S2. Hubo fuerte y significativa correlación entre la hibridación y qPCR datos: corta duración versus normal de r = 0,81, P & lt; 0,001; de largo frente a la normalidad r = 0.85, P & lt; 0,001; corto frente a largo r = 0.85, P & lt;. 0.001
Comparación entre la hibridación de microarrays (dLMR, la diferencia en los niveles de expresión promedio entre los grupos de la muestra, escala log 2) y qPCR (DDPC, la diferencia en los niveles de expresión promedio entre los grupos de la muestra, log2 escala) de datos, el coeficiente de correlación r = (Pearson): (A) baja versus normal de r = 0,81, P & lt; 0,001; (B) de altura frente a la normalidad r = 0.85, P & lt; 0,001; (C) de alta versus baja r = 0.85, P & lt; 0,001. En rojo; miR-150.
El análisis de correlación entre los marcadores angiogénicos y miR-155
Hemos publicado anteriormente sobre el impacto pronóstico de miR-155 en nuestros grandes (335 pacientes) Población NSCLC [ ,,,0],37]. En este estudio se analizó la correlación entre el miR-155 y varios marcadores angiogénicos conocidos. Los mismos valores de corte como la publicada anteriormente se utilizaron para FGF2 y miR-155 [33], [37]. muestra la Figura S1
El análisis in situ
hibridación (ISH) de NSCLC que representan intensidades fuertes y débiles de las células tumorales de miR-155 expresión, así como controles negativos y positivos. Tabla 5 muestra la correlación entre los marcadores angiogénicos [factor de crecimiento endotelial vascular - A (VEGF-A), de plaquetas factor derivado - B (PDGF-B), HIF-1α y factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2)] y miR-155. miR-155 se correlacionó significativamente con FGF2 en la cohorte total (r = 0,17, p = 0,002), aunque más prominente en el subgrupo con metástasis ganglionar (r = 0.34, P & lt; 0,001). Las tablas de referencias cruzadas en la Tabla 6 y Tabla 7 muestran la correlación y la distribución de alta y baja expresión de FGF2 y miR-155.
Discusión
Para nuestro conocimiento , este es el primer estudio del perfil de expresión de miR NSCLC que muestra un conjunto de genes conectados a miRs relacionados con la angiogénesis con el mayor impacto en el análisis de la vía. De acuerdo con estudios previamente publicados observamos diferencias significativas en los perfiles de miR entre tejido normal y tumoral y entre muestras de pacientes con una pobre frente a un DSS favorable. Varios de estos miRs alterados importantes están asociados con la angiogénesis y son marcadores candidatos interesantes para su posterior evaluación. Mediante la validación de uno de estos marcadores, el miR-155, en una cohorte de 335 pacientes con CPNM, nos encontramos con esta MIR por primera vez que se asocia significativamente con la conocida FGF2 marcador angiogénico.
Las principales debilidades de el estudio en la búsqueda de nuevos marcadores candidatos son la población de estudio relativamente heterogénea y el escaso número de pacientes incluidos en el análisis. Por lo tanto, muchos de los resultados presentados en este documento son solamente significación marginal (o algunos sólo muestra una tendencia) y una validación adicional de un conjunto de NSCLC más grande, como lo hizo para el miR-155, es un requisito previo para establecer conclusiones firmes. Este es especialmente el caso cuando la comparación de diferencias significativas entre los tejidos tumorales (larga frente a la supervivencia a corto), ya que, en general, son las diferencias más grandes entre los tejidos tumorales y los controles normales. Los cambios a veces son en promedio más altos y los valores de p más fuertes en la Tabla 2 (tejido tumoral en comparación con los controles normales) en comparación con la Tabla 3 (tiempo frente a la supervivencia a corto). Desde un punto de vista clínico, al menos cuando se trata de MIR como posibles marcadores de pronóstico o predictivos, miRs con expresión alterada entre el corto frente al grupo supervivencia a largo son de especial interés. Por tanto, hemos explorado la literatura sobre cuatro miRs relacionados con la angiogénesis de la Tabla 3 (miR-106a, miR-155, miR-182 y miR-424) y validado miR-155 en un gran conjunto de pacientes con CPNM. Además hemos querido destacar el impacto potencial de miR-21, miR-126 y miR-210 de la Tabla 2, ya que hay informes que indican que convencen estos MIR para tener un impacto potencial en la angiogénesis. Además, hemos demostrado anteriormente miR-126 para tener impacto pronóstico en nuestra cohorte NSCLC [38].
El fortalecimiento de nuestros resultados son correlaciones fuertes y significativas entre los datos de microarrays de hibridación y las mismas miRs validados por qPCR. Además, los alterados expresiones de miR en el tumor en comparación con el tejido normal son, en gran medida consistentes con estudios NSCLC miR publicados anteriormente [15] - [17], [20] y como se explica en el siguiente, se añaden constantemente nueva literatura, el apoyo a nuestro candidato mIR de estar implicado en la angiogénesis.
pocos estudios han explorado el impacto de las vías relacionadas con los genes diana de miR en el CPNM. La interpretación de este tipo de análisis no es sencillo ya que los resultados dependen de la cual se dirigen los genes están ligados a los MIR y que miRs están conectados a las diferentes vías altamente. Además MIR son a menudo múltiples funciones y el mismo MIR se pueden orientar a diversos genes en diferentes vías, y un gen pueden ser el blanco de varios MIR. Aunque no es estadísticamente significativo, el GSEA varió la angiogénesis como la vía más importante de nuestras muestras de NSCLC. Hay varios nuevos informes de conexión miRs específicas para apoyar la angiogénesis nuestros resultados [23], [24], [39] - [42]. Además, Raponi et al. han demostrado que la vía del factor de crecimiento de fibroblastos relacionados con la angiogénesis (FGF) tenía un enriquecimiento de genes importantes en escamosas NSCLC [17].
En un estudio murino integral, Olson et al. específicos identificados firmas de expresión de miR asociados con pasos en la tumorigénesis y diferentes características del cáncer, incluyendo la angiogénesis [23]. miRs firma inhibidores de la angiogénesis se evaluó por la técnica de qPCR y definen como aquellos miRs alterado de manera significativa en normales frente a tumores primarios tratados con sunitinib por & gt; 1,3 veces el cambio [23]. Sunitinib es un inhibidor de la tirosina quinasa de orientación vascular del receptor del factor de crecimiento endotelial (VEGFR), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR) y c-Kit. De acuerdo con nuestros resultados de la validación de qPCR, los datos de PCR en general a menudo muestran un mayor cambio veces en comparación con los datos de la hibridación. Muchos de los miRs relacionados con la angiogénesis observadas por Olson y compañeros de trabajo también se alteran significativamente en nuestro material [23]. Entre los MIR relacionados con la angiogénesis más interesantes alterado de manera significativa en ambos estudios nos encontramos con el miR-126, miR-155 y miR-21 y miR-424.
miR-126 ha sido recientemente revisado como un jugador importante en el la angiogénesis [43] y Wang et al. mostró en un modelo murino que mejora las acciones proangiogénicos de VEGF y FGF por la represión de la expresión de Spred-1, un inhibidor de la señalización intracelular angiogénico [44]. miR-126 también ha sido localizado dentro del dominio similar al factor de crecimiento epidérmico 7 gen (EGFL7). EGFL7 puede tener un papel importante en la angiogénesis mediante la promoción de la señalización de VEGF y la integridad vascular [45]. Por otra parte, hemos informado anteriormente que la expresión de miR-126 se asoció significativamente con el VEGF-A en NSCLC [38]. Además, se observó que el impacto pronóstico de miR-126 se relaciona con subtipos histológicos y el estado ganglionar. Además, la expresión y papeles de miR-126 pueden ser diferentes en diversos tumores malignos [23].
miR-155 es uno de los MIR que participan más consistente en la enfermedad neoplásica [46], pero hasta donde sabemos, no se ha relacionado con la angiogénesis antes del estudio por Olson y compañeros de trabajo [23]. Se ha informado de que hasta reguladas en varios estudios de NSCLC humanos [15], [17], [20], y las reguladas en un modelo murino cuando se utiliza el sunitinib inhibidor angiogénico [23]. En nuestra gama de datos, el miR-155 tendía a ser alterado de manera significativa entre los grupos de supervivencia a corto y largo (Tabla 3) y fue significativamente sobre-expresados en el tumor en comparación con el tejido normal en el conjunto de validación qPCR. Hemos informado el impacto pronóstico de miR-155 que se asocia con los subtipos histológicos y el estado ganglionar, pero no vincular estos resultados con los marcadores angiogénicos [37]. Sobre la base de estos nuevos datos que ahora examinamos si el miR-155 en correlación con parámetros de hipoxia /angiogénicos conocidos como el VEGF-A, PDGF-B, HIF-1α y FGF2. Curiosamente, se observó, por primera vez, el miR-155 que se asoció significativamente con FGF2 con el mayor impacto en el subgrupo N + NSCLC. Aunque FGF2 tiene varias funciones, es un jugador importante en la angiogénesis. De hecho, miR-155 también tendió a correlacionarse con VEGF-A en el subgrupo N +. miR-155 fue uno de los primeros MIR de estar asociado con el desarrollo de NSCLC y más estudios serán importantes con el fin de explorar su potencial función angiogénico.
En este estudio, el miR-21 es significativamente hasta reguladas en el tumor en comparación con el tejido normal (Tabla 2), el apoyo a los informes anteriores de NSCLC [15], [17], [20] y lo observado regulación a la baja después del tratamiento anti-angiogénico [23]. miR-21 también se ha encontrado para ser altamente expresado en las células endoteliales [24]. En un estudio reciente realizado por Liu et al., MiR-21 se sobreexpresa mediante la transfección de pre-miR-21 en células de cáncer de próstata humano y la angiogénesis tumoral fue ensayada mediante membrana corioalantoidea de pollo [47]. Ellos encontraron que la sobreexpresión de miR-21 en las células DU145 aumentó la expresión de HIF-1α y VEGF y la angiogénesis inducida por tumor. Concluyen que miR-21 induce la angiogénesis tumoral a través de la orientación PTEN, lo que lleva a la activación de la AKT y vías de señalización ERK1 /2, y mejorando de este modo HIF-1α y la expresión del VEGF. Las mismas vías se describen como importante en el desarrollo de NSCLC, así [48], y otros estudios para abordar esta relación con el miR-21 en el cáncer de pulmón sería de interés.
El estudio indica Olson miR-424 para ser involucrados en la angiogénesis, ya que el miR fue regulada hacia abajo después del tratamiento con sunitinib [23]. Además, Ghosh et al. han estudiado este MIR y se describe que la expresión de miR-424 inducida por hipoxia en las células endoteliales humanas regula isoformas HIF-α y promueve la angiogénesis [49]. Además, sugieren miR-424 a desempeñar un importante papel fisiológico en la angiogénesis post-isquémica. Por el contrario, Nakshima et al. informó la baja regulación de miR-424 para contribuir a la angiogénesis anormal a través de MEK1 y ciclina E1 en el hemangioma senil, lo que demuestra el potencial del tejido y la etapa del impacto específico de la misma MIR [50]. En nuestro estudio, el miR-424 no se alteró cuando se comparan tumor con el tejido normal, pero fue significativamente hasta reguladas en el tejido de pacientes con mal pronóstico en comparación con los tejidos de pacientes con un pronóstico favorable (Tabla 3). Hay a nuestro conocimiento ningún estudio publicado que ha explorado el impacto pronóstico de miR-424 en el cáncer. Sin embargo, ya que hay una significativa miR-424 sobre regulación en el grupo de mal pronóstico, sería de interés para evaluar más a fondo este marcador en un estudio a gran escala NSCLC.
Otro marcador hasta reguladas significativa en nuestro material es miR-210 (Tabla 2), que previamente se ha relacionado con la angiogénesis [41], [51], [52]. miR-210 se cree que es un elemento crucial de la respuesta de las células endoteliales a la hipoxia y por lo tanto potencialmente importante en la angiogénesis tumoral regulación. Este MIR ha sido recientemente revisado por Devlin et al. [51], concluyendo que miR-210 es un blanco sólido del factor inducible por hipoxia y que su sobreexpresión se ha detectado en una variedad de enfermedades cardiovasculares y los tumores sólidos. En líneas celulares de cáncer, miR-210 se informó de mediar alteraciones mitocondrial asociada con la modulación de la actividad de HIF-1 [52]. Sin embargo, gran parte del impacto funcional y pronóstico de miR-210 en el CPNM aún sigue sin resolverse.
miR-182 se incluye en la vía de la angiogénesis en el GSEA, en parte porque el sustrato del receptor del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FRS2) es uno de sus genes diana. FRS2 es un regulador importante de la vía del factor de crecimiento de fibroblastos que nosotros y otros han demostrado ser importantes en la progresión del NSCLC, potencialmente mediante la estimulación de la angiogénesis [33], [53]. Curiosamente, miR-182 fue el único de miR alterado de manera significativa en las tres combinaciones como se muestra en el diagrama de Venn (Figura 1). Su regulación en tumor (tanto pobres y favorable grupo de pronóstico, Tabla 2) en comparación con el tejido normal, es consistente con el estudio anterior de Raponi et al. [17]. Por otra parte, el miR-182 es significativamente hasta reguladas en corto DSS frente a los pacientes DSS largos (Tabla 3). Sin embargo, Barchack et al. observado una mayor expresión de miR-182 en tumores primarios que en los tumores pulmonares metastásicos, lo que indica que el miR-182 expresión puede alcanzar un máximo en la etapa temprana CPNM.
Se observa la misma tendencia para el miR-106a, que ha sido demostrado ser hasta reguladas durante la hipoxia en líneas celulares de cáncer de colon y de mama [40]. Como se informó anteriormente, el miR-106a fue hasta reguladas en NSCLC [16], [17], [20]. También observamos su expresión a ser aumentado de manera significativa en los tumores en comparación con los controles normales (Tabla 2). En cuanto a miR-182, miR-106a se incrementó aún más en el tejido de pacientes con una corta supervivencia más que la supervivencia a largo (Tabla 3).
Como era de esperar, muchos miRs conocidos por estar asociados con la angiogénesis no fueron alterados significativamente en nuestro estudio. Cluster de miR-17-92 (miR-17-5p, miR-17-3p, miR-18a, miR-19a, 19b-MIR, MIR-20a y miR92-1), let-7, let-7F, miR 27b, miR-15b, miR-16, miR-92a, miR-99a, miR-130, miR-214, miR-221, miR-222 y miR-296, así como algunos de los MIR que se presentan en el mapa de calor ( La Figura 3), no se alteraron de manera significativa o que exhibieron sólo cambios menores de plegado [24], [39], [41], [42]. Esta falta de alteraciones significativas puede ser debido a los resultados falsos negativos, ya que hay pocos pacientes en cada grupo. Además, como muchos miRs parecen ser tejido y etapa específica, algunos de estos miRs pueden ejercer alternativamente un impacto limitado a subgrupos de NSCLC resecado o puede ser importante en otras enfermedades malignas
.
se establecen inhibidores angiogénicos en combinación con quimioterapia como tratamiento de NSCLC, sino un conocimiento más lejos en la biología, los mecanismos efectores y marcadores pronósticos y predictivos están garantizados. miRs son estables y potencialmente medible tanto en el tejido y suero. Varios miRs están relacionados con la angiogénesis y este estudio apoya la hipótesis de que un número de miRs relacionados con la angiogénesis son potencialmente importantes en la progresión del NSCLC. Proponemos el miR-21, miR-106a, miR-126, miR-155, miR-182, miR-210 y miR-424 para estar entre los candidatos más interesantes. Desde MIR son a menudo escenario y tejido específico, se requieren estudios a gran escala para explorar aún más su impacto pronóstico y predictivo. Además de la misma MIR menudo tiene múltiples genes diana y diferentes funciones. Por lo tanto, los estudios funcionales son muy necesarias para tener un mejor conocimiento de sus funciones biológicas.
Materiales y Métodos
Ética declaración
El estudio se aprobó por el Consejo Nacional de Inspección de Datos, El Comité regional de Ética de la Investigación y Colección Junta Biobanco de Tejidos. se consideró la información y posterior consentimiento por escrito de los pacientes o los familiares, pero como este fue un estudio retrospectivo, con más de la mitad de los pacientes ha fallecido, hace algunas con más de diez años, el Comité Regional de Ética de la Investigación renunciado precisamente a la necesidad de consentimiento.
pacientes y muestras de tejidos
a partir de una amplia cohorte CPNM previamente bien descrito [30], veinte fijados en formalina y (FFPE) muestras de tejidos tumorales incluidas en parafina fueron obtenidas de pacientes diagnosticados en estadio I -IIIA en el hospital de la Universidad del Norte de Noruega (UNN) y el hospital central de Nordland (NLCH). Estos fueron diez pacientes con una supervivencia específica de la enfermedad corta (DSS) (NSCLC_01 - NSCLC_10), y diez pacientes con larga DSS (NSCLC_11 - NSCLC_20). Además, las muestras de los sitios de tejido pulmonar normal en diez pacientes con CPNM (NSCLC_01, NSCLC_02, NSCLC_06, NSCLC_11, NSCLC_12, NSCLC_13, NSCLC_15, NSCLC_16, NSCLC_18 y NSCLC_19) fueron incluidos en el estudio (NORM_01 - NORM_10). Se tomaron cuatro núcleos de muestra, cada una de 0,6 mm de diámetro, de las zonas tumorales viables de cada tumor y muestra normales y se agruparon antes de aislar el ARN con el fin de obtener una muestra representativa de cada paciente. grupos DSS largas y cortas fueron estratificados con el fin de conseguir una distribución equitativa de género y la histología. Las muestras tumorales fueron almacenadas a los departamentos de patología de la UNN y NLCH, organizaron de acuerdo a la clasificación TNM de la Unión Internacional Contra el Cáncer (UICC), e histológicamente en subtipos de acuerdo con las directrices de la Organización Mundial de la Salud [54], [55]. Todo el material del paciente fue revisado por dos patólogos independientes y especializados (SAS) y la KAS. Ninguno de los pacientes recibió quimioterapia o radioterapia antes de la cirugía. Los datos completos del paciente se obtuvo de los registros médicos, incluyendo datos demográficos, clínicos, tratamiento y evolución.
aislamiento de ARN
RNA fue aislado de las muestras de testigos recogidos mediante el uso de la Recuperación All ™ total de ácidos nucleicos Kit de aislamiento para FFPE tejidos (Ambion, Austin, TX), de acuerdo con las instrucciones del fabricante, con algunos ajustes de menor importancia. tratamiento xileno se incrementó de 3 min a 8 min, y el tratamiento de la proteasa se incrementó de 3 horas a aproximadamente 20 horas. calidad y cantidad de ARN se evaluó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) y además verificado por un perfil de Agilent 2100 Bioanalyzer.
Microarray procedimientos
El ARN total (700 ng ) de la muestra y la referencia se marcó con HY3 ™ y la etiqueta fluorescente hY5 ™ usando el miRCURY
Tm LNA matriz kit de marcaje de potencia (Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) siguiendo el procedimiento descrito por el fabricante. El HY3 ™ marcado con las muestras y un hy5 ™ llevan la etiqueta de muestra de ARN de referencia (que contiene una alícuota igual de todas las especies de ARN incluidas en este estudio) se mezclaron por pares y se hibrida a la miCURY
Tm LNA matriz de la versión 5
ª generación (Exiqon, Dinamarca), que contiene sondas de captura dirigidas a todos los miRNAs humanos registrados en la versión 14.0 miRBase en el Instituto Sanger. La hibridación se realizó de acuerdo con el manual de array miRCURY ™ LNA utilizando una estación de hibridación Tecan HS4800 (Tecan, Austria). Después de la hibridación, los microarrays diapositivas fueron escaneados y almacenados en un ambiente libre de ozono (nivel de ozono por debajo de 2,0 ppb) con el fin de evitar la posible blanqueo de los tintes fluorescentes. Las diapositivas de microarrays de matriz miCURY ™ LNA fueron escaneados utilizando el escáner G2565BA Microarray Sistema Agilent (Agilent Technologies Inc., EE.UU.) y el análisis de imágenes se llevó a cabo utilizando el software ImaGene 8,0 (BioDiscovery Inc., EE.UU.). Las señales cuantificadas con corrección de fondo con el valor de desplazamiento 10 y normalizado utilizando el Lowess mundial (Diagrama de dispersión localmente ponderado Smoothing) algoritmo de regresión [56].
Base de datos presentación de los datos de microarrays
Se prepararon los datos de microarrays de acuerdo con la información mínima alrededor de un experimento de microarrays (MIAME) recomendaciones [57] y depositados en la base de datos GEO (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). El número de acceso GEO para la plataforma es GSE27705 y el estudio puede ser visto en:. Http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE27705
Cuantificación de miRNAs maduros por qPCR en tiempo real
Uno o varios de los siguientes criterios fueron utilizados en la selección MIR para la validación de PCR; significativa de valor P, alto factor de cambio y /o miRs relacionados con la angiogénesis. Cinco muestras de cada grupo con suficiente tumor de miR queda después de la matriz de análisis se utilizaron en la validación de PCR. De los 41 miRs probados, se detectaron 28 MIR en 7 o más muestras y se analizaron. La estabilidad de los miRNAs detectado en todas las muestras se ensayó por EXdel usando el software NormFinder. miR-423-5p fue uno de los miRNAs de referencia recomendados junto con el miR-150, miR-423-5p y miR-300. miR-300 fue excluido debido a niveles muy bajos detectados. Además NormFinder encontró gran variación en miR 150, sin embargo miR-423-5p se encontró que el miARN más estable en el conjunto de datos y se utilizan en consecuencia como referencia. Todos en tiempo real qPCR experimentos se realizaron por Exiqon, Vedbaek, Dinamarca. 10 ng de ARN transcrito fue invertir en 10 l reacciones utilizando el miRCURY LNA ™ universal RT PCR MIR, poliadenilación y kit de síntesis de ADNc (Exiqon); cada muestra se procesó por triplicado. cDNA se diluyó 100 × y se utilizó 4 ul en 10 reacciones de PCR UL de acuerdo con el protocolo para miRCURY LNA ™ universal RT de miR PCR; cada uno de miR se ensayó una vez por qPCR en ADNc por triplicado. La amplificación se realizó en un 480 Sistema de PCR en tiempo real LightCycler® (Roche) en placas de 384 pocillos. (11,5 versión) software LinRegPCR se utilizó para determinar la eficiencia de amplificación qPCR. La eficiencia media de amplificación se utilizó para corregir los valores brutos de Cp.
Pathway análisis
Los impactos de las diferentes vías fueron evaluados por Gene Conjunto de Análisis de enriquecimiento (GSEA) derivados del análisis de proteínas a través de la relación evolutiva (PANTERA). El sistema de clasificación PANTHER es un recurso único que clasifica los genes de sus funciones, el uso de evidencia experimental científica publicada y relaciones evolutivas para predecir la función, incluso en ausencia de evidencia experimental directa. El conjunto de genes fue tomado de la base de datos MirDB (http://www.mirdb.org) (http://rnajournal.cshlp.org/content/14/6/1012.full) que ha compilado listas de genes de las vías curada en la base de datos PANTHER.
Una lista completa está disponible en http://mirdb.org/cgi-bin/pathway.cgi. miARN anotación se basa en la versión 13 miRBase (http://www.mirbase.org/). GSEA análisis se llevó a cabo utilizando el lenguaje estadístico R (www.r-project.org) y el paquete de R GSEA disponible en http://www.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp.
Datos