Extracto
Antecedentes
El trabajo previo ha demostrado la reducción de los niveles de expresión de let -7 en tumores de pulmón. Sin embargo, se sabe poco sobre la expresión o mecanismos de let-7a en el cáncer de próstata. En este estudio, hemos utilizado in vitro e in vivo enfoques para investigar si E2F2 y CCND2 son blancos directos de let-7a, y si let-7a actúa como un supresor tumoral en el cáncer de próstata por E2F2 abajo de la regulación y CCND2.
Metodología /Principales
Los resultados en tiempo real RT-PCR demostró que la disminución de los niveles de let-7a están presentes en las muestras de cáncer de próstata resecados y líneas celulares de cáncer de próstata. La proliferación celular se inhibe en células PC3 y LNCaP células después de la transfección con let-7a. Análisis del ciclo celular demostró que 7a dejar inducida por la detención del ciclo celular en la fase /G1 S. Un ensayo indicador de luciferasa dual demostró que el 3'UTR de E2F2 y CCND2 se une directamente a let-7a y Western Blot análisis indicaron además que let-7a hacia abajo-regulada la expresión de E2F2 y CCND2. Nuestros modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata confirmaron la capacidad de let-7a para inhibir el desarrollo de tumores de próstata in vivo.
Conclusiones /Importancia
Estos resultados ayudan a desentrañar los mecanismos antiproliferativos de let-7a en el cáncer de próstata. Let-7a también puede ser nuevo candidato terapéutico para el cáncer de próstata debido a su capacidad de inducir la detención del ciclo celular e inhibir el crecimiento celular, especialmente en el cáncer de próstata refractario a las hormonas
Visto:. Dong Q, Meng P, Wang T , Qin W, W Qin, Wang F, et al. (2010) MicroARN Let-7a inhibe la proliferación de células de cáncer de próstata humano
in vitro
y
En Vivo fotos: por orientación E2F2 y CCND2. PLoS ONE 5 (4): e10147. doi: 10.1371 /journal.pone.0010147
Editor Syed A. Aziz, Health Canada, Canada |
Recibido: 9 Marzo, 2010; Aceptado: March 23, 2010; Publicado: 14 de abril 2010
Derechos de Autor © 2010 Dong et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyada por las subvenciones del Programa Nacional de Investigación básica de China, 2009CB521705; y la Fundación de Ciencia Natural de China, 30672097. Los donantes no participó en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión a publicar
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
los microARN (miRNA) son endógenas, no codificante ARN pequeños de 20-25 nucleótidos de longitud [1], que desempeñan un importante papel regulador a través de la unión de cortesía de las regiones 3 'no traducidas (UTRs) de destino genes. resultados de unión en la degradación del ARNm diana y la inhibición de la traducción [2]. Muchos miRNAs están asociados con el cáncer, y están implicados en el desarrollo celular, la diferenciación, la proliferación y la muerte celular [3]. Muchos informes han indicado que miRNAs pueden ser útiles para el diagnóstico y la terapia [4] cáncer. let-7 se identificó por primera vez en
Caenorhabditis elegans
[5]. Es casi indetectable en la etapa embrionaria de desarrollo, pero se hace más abundante en etapas posteriores del desarrollo [6]. Trabajos anteriores han demostrado la reducción de los niveles de expresión de let-7 en los tumores de pulmón en comparación con el tejido pulmonar normal. let-7 ralentiza la proliferación celular mediante la regulación negativa de los oncogenes RAS /c-myc y HMGA-2 a nivel de traducción [7], [8]. Las funciones supresoras tumorales misma también se ha informado de let-7 en el cáncer de colon [9].
in silico
análisis de los posibles objetivos de let-7a (www.targetscan.org andwww.microrna .org) revelan que tanto E2F2 y CCND2 son posibles objetivos de let-7a. E2F2 y CCND2 son los reguladores del ciclo celular y la expresión aberrante de ellos pueden conducir a la proliferación celular anormal. Nuestros experimentos preliminares indican que los niveles de proteína de ambos E2F2 y CCND2 están regulados en la línea celular de cáncer de próstata PC3. Poco se sabe sobre la expresión o mecanismos de let-7a en el cáncer de próstata. En este estudio, hemos utilizado
in vitro e
in vivo
enfoques para investigar si E2F2 y CCND2 son blancos directos de let-7a, y si let-7a actúa como un supresor de tumores en la próstata cáncer de E2F2 por abajo de la regulación y CCND2.
Materiales y Métodos
Declaración de Ética
Todas las muestras fueron obtenidas de pacientes que firmaron el consentimiento informado que se aprueba el uso de sus tejidos para la investigación uso después de esta operación. La clínica de factores patológicos del paciente 26 se muestran en la Tabla S1. La utilización de tejidos humanos en este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Cuarta Universidad Médica Militar y estaba de acuerdo con sus directrices (n 2008039085). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la Ley de Protección de los Animales y aprobados por Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Cuarta Universidad Médica Militar. (Número de autorización 200804052353).
Cultivo de células y tejidos colección
líneas celulares de cáncer de próstata humano LNCaP DU145, PC3, y PrEC (células epiteliales de la próstata) y células renales embrionarias humanas se obtuvieron a partir HEK293A American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EE.UU.). Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Gibco) suplementado con 10% fetal de la pantorrilla de suero y penicilina (100 U /ml). Los cultivos se mantuvieron en una atmósfera que contiene 5% de CO
2 (Forma Scientific). Veintiséis recién resecado especímenes de cáncer de próstata y sus muestras no tumorales adyacentes fueron recogidas del Departamento de Urología en el Hospital Xi'jing. Las muestras se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se mantuvieron allí hasta su uso.
Construcción del plásmido y transfección celular
Let-7a se amplificó y se purificó mediante kit de aislamiento de los genes miARN (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. cebadores de PCR para let-7a fueron:
5'-GAATTCTCACACAGGAAACCAGGA-3 'gratis (hacia adelante) y
5'-CTGCAGTCAGGCATTTAAGTGACCG-3' gratis (inversa). Let-7a productos de PCR fueron clonados en el
Eco RI
/
Pst I
sitio de clonación de un plásmido pcDNA3 que contiene la proteína fluorescente verde (GFP) para formar el plásmido pcDNA3-let-7a-GFP . Transfección de células se realizó con lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las células PC3 se sembraron en placas de seis pocillos y se dejaron crecer sin antibióticos a 70-90% de confluencia. Cada pocillo recibió 6 l de reactivo de lipofectamina que contiene 3 mg de ADN plásmido. Tres pocillos recibieron plásmido pcDNA3-let-7a-GFP, mientras que los otros pocillos recibieron el vector vacío, pcDNA3-GFP. Se añadió G418 (400 mg /ml) a las células 24 h después de la transfección. una mezcla de clones fueron seleccionados y se cultivaron durante 4 semanas adicionales. células PC3 transfectadas con let-7a se designaron como PC3-let-7a-GFP, el control negativo (células transfectadas con el vector vacío) fue designado como PC3-GFP. células PC3 también fueron transfectadas con 30 nM de sintético let-7a (imita), y miRNAs de control negativo sintéticos (NC). Por último, un sintético let-7a-inhibidor de la secuencia y el control negativo-let-7a inhibidor sintético (inhibidor de Carolina del Norte). Las secuencias de hsa-let-7a sintética, control negativo, inhibidor de hsa-let-7a y el inhibidor de control negativo se mostraron en el texto S1.
Total de la extracción de RNA y en tiempo real RT-PCR
Para let-7a, el ARN total fue extraído de las muestras usando un kit de miRNeasy Mini (Qiagen). cDNA se sintetizó usando TaqMan MicroARN Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems). Real-time RT-PCR se realizó con el kit TaqMan MicroARN de ensayo (Applied Biosystems). El cebador para let-7a fue
5'-GAGGTAGTAGGTTGTATA-3 '.
Para E2F2 y CCND2, la extracción de RNA total y en tiempo real de RT-PCR se realizaron usando el kit SYBR ™ más verde en dos pasos (Invitrogen, Carlsbad, CA). cebadores de PCR para E2F2 fueron:
5'-GAGCTCACTCAGACCCCAAG-3 'gratis (hacia adelante) y
5'-AACAGGCTGAAGCCAAAAGA-3' gratis (inversa). cebadores de PCR para CCND2 fueron:
5'-AAGAATTCCTCCTCAATAGCCTGCAGCAGTA-3 'gratis (hacia adelante) y
5'-GCGGGATATCGACCTGTGAGAATTCGAT-3' gratis (inversa). Todos los protocolos se llevaron a cabo según los protocolos del fabricante. El nivel de expresión de let7a se normalizó a RNU6B. El nivel de expresión de E2F2 y CCND2 se normalizaron a GAPDH. Real-time RT-PCR se realizó mediante el uso de 7500 Sistema de RT-PCR en tiempo real (Applied Biosystems). PCR se realizó en las siguientes condiciones: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 15 s, y 60 ° C durante 1 min. Cada muestra se realizó por triplicado.
Ensayo MTT
células PC3 y LNCaP células transfectadas con NC o let-7a (imita), o NC inhibidor y let-7a inhibidor se colocaron en placas de 96 -Bueno placas a 1 x 10
4 células /pocillo. Se midieron las células viables 1, 2, 3, 4, y 5 días después de la siembra. Después de la incubación con ácido 3- (4, 5-dimetiltiazol-2) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT), las células se lisaron en 150 ml de 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) y la absorbancia UV-visible se leyó a 490 nm usando el lector de placas de 96 pocillos. Cada muestra se realizó por triplicado.
Soft agar ensayo
En resumen, se añadieron 2 ml de agar al 0,5% a cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Independiente PC3-let-7a-GFP y células PC3-GFP se mezclaron con la suspensión topagarose (concentración final 0,3%), y luego se dispusieron en capas las células en la capa base de agarosa al 0,5%. El número de focos & gt; 100 micras se contaron después de 18 días. Cada experimento se realizó por triplicado.
Análisis del ciclo celular
células PC3 y LNCaP células transfectadas con NC o let-7a (imita), o un inhibidor de NC o let-7a inhibidor se cosecharon 72 h después de la transfección, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato fría (PBS), y se fija en 1 ml de 70% de etanol. Después de la incubación durante la noche a 4 ° C en etanol, las células se lavaron en PBS y se suspendieron en 500 l de yoduro de propidine (PI) 30 min antes de la citometría de flujo. Las poblaciones en G0-G1, S, G2 y la fase-M se midieron mediante citometría de flujo (EPICS XL, Coulter, Miami FL) y los datos se analizaron mediante el uso de Ciclo Celular multiciclo-DNA Software analizados. La medición se realizó por triplicado.
Dual-luciferasa reportero de ensayo
Para investigar si E2F2 y CCND2 expresión se regula por let-7a, se realizó un ensayo doble-informador de luciferasa. El 3'-UTR de CCND2 y E2F2 se amplificaron por PCR, respectivamente. La amplificación de CCND2 utiliza los siguientes cebadores:
5'-GAATTCATGAGTTCTTCGTACTGG-3 'gratis (hacia adelante) y
5'-GATATCCCATCATGAT GAGGATAC-3' gratis (inversa). Los productos de PCR fueron 398 pb y contenían dos sitios de unión para let-7a. El mutado 3'-UTR de CCND2 se sintetizó después de mutaciones puntuales se hicieron en varias bases dentro de los sitios de unión de estos productos de PCR. La amplificación de la 3'-UTR de E2F2 utiliza las siguientes secuencias de cebadores:
5'-GAATTCCTCTTCGACTCCTACGAC-3 'gratis (hacia adelante) y 5
' - GATATCTGTGCTTCTT GGTACGTCG-3 'gratis (inversa). Los productos de PCR fueron 415 pb y contenían dos sitios de unión para let-7a. Mutado 3'-UTR de E2F2 se sintetizaron después de varias mutaciones puntuales se hicieron en los sitios de unión de productos de PCR. Después de la digestión de restricción, los genes amplificados se clonaron en los sitios correspondientes de un vector de expresión pGL3 reconstruida. El vector de control pRL-TK que expresa luciferasa de Renilla (Promega) se utilizó para la normalización del número de células y la eficiencia de la transfección. Cotransfecciones de origen sintético let-7a secuencia (imita) y Carolina del Norte, o dejar 7a-inhibidor y el inhibidor de Carolina del Norte también se llevaron a cabo en células de riñón embrionario humano HEK293A utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). la actividad luciferasa de luciérnaga y de Renilla se determinó por el Sistema Dual Pikkagene de ensayo de luciferasa (Toyo-B-Net)
Western Blot análisis
Los siguientes anticuerpos fueron utilizados para el Western Blot:. ratón anti-E2F2 ( 1:200 dilución, Santa Cruz Biotech); ratón anti-CDK4 y el ratón anti-ciclina D2 (1:300 dilución; BD Biosciences, San Jose, CA); ratón anti-K-RAS (1:300 dilución; Cell Signaling Technology, Beverly, MA); conejo anti-β-actina (dilución 1:4000, Sigma). Veinticinco microgramos de muestras de cáncer de próstata y proteína sus especímenes adyacentes no tumoral ", así como PC3-let-7a-GFP y la proteína PC3-GFP se sometieron a electroforesis en 10% minigeles SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa Hybond C (Amersham Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido). Después de incubar con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche, las membranas de nitrocelulosa se lavaron tres veces con Tris-solución salina tamponada con Tween-20 (TBST) y luego incubadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) conjugado con, cabra anti-ratón o de cabra anti-conejo IgG (dilución 1:500, Sigma) durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar con TBST, manchas de transferencia se visualizaron usando el sistema de Odyssey Infrared Imaging (LI-COR Bioscience, Lincoln, Nebraska EE.UU.). Cada ensayo se repitió tres veces.
tumorigenicidad
Cinco ratones desnudos fueron inyectados por vía subcutánea con ~ 1 × 10
6 PC3-let-7a-GFP células PC3-GFP o en una sola sitio de la espalda. El peso del tumor y el peso del ratón se midieron en el momento del sacrificio (4 semanas después de la inyección). Western Blot se realizó para investigar si E2F2 y CCND2 se redujeron regulado en el modelo de xenoinjerto nude-ratón. suspensiones tumorales se trataron con tampón de lisis y el Western Blot fue realizado de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente.
El análisis estadístico
Las diferencias entre cada grupo se determinaron por la prueba T o Mann-Whitney
T
prueba utilizando SPSS Statistical paquete de software (SPSS Inc., Chicago) (
p Hotel & lt; 0,05 fue considerado significativo).
resultados
Let-7a es las reguladas en muestras de cáncer de próstata resecados y en células de cáncer de próstata
real-time RT-PCR reveló que los niveles de expresión de let-7a se redujeron en ~43% en resecados muestras de cáncer de próstata humano en comparación con los no adyacentes muestras cancerosa. Las líneas celulares de cáncer de próstata LNCap expresan únicamente ~ 70% como let-7a que las células epiteliales normales de la próstata PrEC. Además, la cantidad de expresión let-7a en células PC3 y DU-145 eran aproximadamente 50% de la observada en PrEC. Estos resultados indican que let-7a está disminuida en cáncer de próstata, incluyendo el independiente de andrógenos cáncer PC3 (Fig. 1, *
p
& lt; 0,05; **
p
& lt; 0,01) .
real-time RT-PCR muestran que la expresión relativa de let-7a en veintiséis muestras de cáncer de próstata, y en líneas celulares de cáncer de próstata LNCap, PC3, DU-145 es más alta que en su adyacente muestras no cancerosas y la normal de las células epiteliales de próstata PrEC. Los datos se muestran como porcentaje de las señales medias en tejidos y células de tres mediciones independientes. RNU6B se midió en paralelo y se usa para normalizar el nivel de expresión de let-7a en cada experimento. Los valores representan las medias y las barras de error representan el SEM. (*
p & lt; 0,01
, **
p & lt; 0,01
; prueba de Mann-Whitney-U).
Let-7a inhibe el crecimiento celular
in vitro e induce la detención del ciclo celular en la fase G0-G1
Después de la transfección, el nivel de expresión de let-7a en PC3-let-7a-GFP fue ~ 300% más alto que en PC3-GFP por tiempo real de RT-PCR; Se observó un aumento de diez veces en la expresión de let-7a en las células PC3 transfectadas con let-7a (imita) frente a las transfectadas con NC (Fig 2A,
p
. & lt; 0,01). Esto indicaba que la transfección se llevó a cabo de manera apropiada. análisis de formación de colonias indicaron que la capacidad de formación de colonias de células PC3-let-7a-GFP es ~ 40% menor que la de las células control (Figura 2B,
p & lt;.
0,01). curvas de crecimiento de MTT indicaron que desde el segundo día, la supervivencia de transfectada let-7a células PC3 y LNCaP células son significativamente menor que la del control negativo, y la supervivencia de las células PC3 inhibidor transfectadas let-7a y células LNCaP son significativamente más que eso de NC inhibidor células transfectadas (Fig 2C,
p & lt;.
0,05). La citometría de flujo mostró que el porcentaje de transfectada let-7a células PC3 y LNCaP células en la fase G0-G1 fue ~ 30% (PC3) y 16% (LNCaP) mayor que la del control negativo, que en paralelo con un ~ 50% ( PC3) y 20% (LNCaP) disminución de la fase S. el porcentaje de células PC3 transfectadas inhibidores de let-7a y células LNCaP en la fase G0-G1 fue ~ 23% (PC3) y 19% (LNCaP) menor que la de NC inhibidor células transfectadas, que en paralelo con un ~ 33% (PC3 ) y 25% () aumento LNCaP en la fase S (Fig 2D, *
p
. & lt; 0,05; **
p
& lt; 0,01). Estos datos indican que let-7a inhibe la proliferación PC3 mediante la inducción de la detención del ciclo celular en G1 /S fase.
(A) expresión relativa de let-7a en las células PC3 transfectadas con pcDNA3-GFP, pcDNA3-let- 7a-GFP, Carolina del Norte, y let-7a (imita). RNU6B se midió en paralelo y se usa para normalizar el nivel de expresión de let-7a en cada experimento. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan el SEM. (**
p Hotel & lt; 0,01; Mann-Whitney
T
prueba). (B) PC3-let-7a-GFP y células PC3-GFP se cultivaron en medio que contiene agar blando y se incubaron durante 18 días. se contaron 100 m; el número de focos & gt. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan el SEM. (*
p Hotel & lt; 0,01; Mann-Whitney
T
prueba). (C) La viabilidad de las células PC3 y LNCaP, que transfectadas con let-7a, Carolina del Norte o el inhibidor de let-7a, inhibidor de Carolina del Norte se midió mediante ensayos de MTT, respectivamente. absorbancia de UV-visible se midió a 490 nm. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan el SEM. (*
p Hotel & lt; 0,05; prueba T muestras pareadas). (D) Análisis de ciclo celular en células PC3 después transfectadas con NC y let-7a (imita) o un inhibidor de NC y let-7a inhibidor, así como el análisis de ciclo celular en células LNCaP después transfectadas con NC y let-7a (imita ) o un inhibidor de Carolina del Norte y el inhibidor de let-7a. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan el SEM. (*
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01; Mann-Whitney
T
prueba).
Vamos -7A objetivos 3'UTR de E2F2 y CCND2
Figura 3A muestra las secuencias de los 3 'UTRs de E2F2 y CCND2 que representan los sitios de unión para let-7a. Las correspondientes secuencias de los mutados 3 'UTRs de E2F2 y CCND2 se muestran también. No se observó reducción de la actividad de luciferasa en células transfectadas con HEK293A let-7a (imita) y CCND2 o E2F2 mutado. Pero se observó una reducción mayor que 30% de la actividad de la luciferasa se observó con de tipo salvaje CCND2 y la reducción de ~ 50% de la actividad de la luciferasa con el tipo salvaje E2F2 (Fig 3B, **
p
. & Lt; 0,01). En comparación con inhibidor de la NC, no hay diferencia significativa en la actividad luciferasa cuando se transfectaron células con el inhibidor de HEK293A let-7a y de tipo salvaje CCND2 o E2F2 (Fig. 3C). Estos datos apoyan que E2F2 y CCND2 son blancos directos de let-7a y endógena let-7a en HEK293A tiene ninguna interferencia a nuestra experiencia.
(A) los sitios de unión de E2F2 y CCND2 para let-7a con el correspondiente mutados secuencias de E2F2 y CCND2. (B) actividad de luciferasa relativa de células de riñón de embriones humanos HEK293A después de la transfección con NC o let-7a (imita) y luego también co-transfectadas con el vector de control pRL-TK, o vector de expresión que contiene ya sea pGL3 WT-CCND2-3'UTR o MUT-CCND2-3'UTR o WT-E2F2-3'UTR o MUT-E2F2-3'UTR. la actividad de luciferasa relativa de células de riñón de embriones humanos HEK293A después de la transfección con el inhibidor de NC o let-7a inhibidor y también co-transfectadas con el vector de control pRL-TK, o el vector de expresión pGL3 que contiene o bien WT-CCND2-3'UTR o (C) WT-E2F2-3'UTR. Los valores representan las medias de tres experimentos independientes y las barras de error representan el SEM. (**
p Hotel & lt; 0,01; Mann-Whitney
T
prueba).
Let-7a inhibe la expresión de E2F2, CCND2
real-time RT-PCR muestra que el ARNm expresión relativa de E2F2 y CCND2 en tejidos de cáncer de próstata y en LNCaP, PC3, y las células DU-145 están regulados en comparación con sus muestras no cancerosas adyacentes y células PrEC (Fig. 4A, B, *
p Hotel & lt; 0,05; **
p Hotel & lt; 0,01). Pero en comparación con PrEC, la expresión de ARNm de E2F2 y CCND2 se redujeron regulado después transfectadas con let-7a en PC3 y LNCaP (Figura 4C, D, *
p
. & Lt; 0,05; **
p
& lt; 0,01). resultados de transferencia Western mostraron ningún cambio de expresión de la proteína CDK4 entre los tejidos de cáncer de próstata y sus tejidos adyacentes no tumorales o entre Que 7a-GFP PC3-células y células PC3-GFP, los niveles de expresión de E2F2, CCND2 aumentaron en tejidos de cáncer de próstata en comparación con sus tejidos adyacentes no tumorales, pero los niveles de expresión de E2F2, CCND2, y K-ras disminuido dramáticamente en las células PC3-let-7a-GFP en comparación con la de las células PC3-GFP (Fig. 4E). K-ras, una diana molecular definido previamente de let-7a [7] se utilizó como control positivo para estos experimentos. Estos datos apoyan que let-7a abajo de la regulación de la expresión del ARNm de E2F2 y CCND2 y reprimir la traducción de proteínas de ellos.
(A) en tiempo real RT-PCR demuestran que el nivel relativo de expresión de E2F2 en tejidos de cáncer de próstata y en LNCaP, PC3, y las células DU-145 es mucho mayor que en sus muestras no cancerosas y las células adyacentes PrEC (*
p
& lt; 0,05, **
p
& lt; 0,01 ; Mann-Whitney
T
prueba). (B) Real-time RT-PCR muestran que el nivel de expresión relativa de CCND2 en los tejidos de cáncer de próstata y LNCaP, PC3, y las células DU-145 es mucho mayor que en sus muestras no cancerosas adyacentes y células PrEC (*
p Hotel & lt; 0,05; Mann-Whitney
T
prueba). (C) en tiempo real RT-PCR demuestran que el nivel relativo de expresión de E2F2 en células LNCaP y PC3 es menor que en las células transfectadas con PrEC después de let-7a (*
p Hotel & lt; 0,05, **
p Hotel & lt; 0,01; Mann-Whitney
T
prueba). (D) en tiempo real RT-PCR demuestran que el nivel de expresión relativa de CCND2 en las células LNCaP y PC3 es menor que en las células transfectadas con PrEC después de let-7a (*
p Hotel & lt; 0,05; Mann-Whitney
T
prueba). Todos los valores representan las medias de tres experimentos separados y las barras de error representan el SEM. GAPDH se midió en paralelo y se usa para normalizar los niveles de expresión de E2F2 y CCND2 en cada experimento. (E) Western Blot muestran que ningún cambio de expresión de CDK4 entre los tejidos de cáncer de próstata y sus muestras no cancerosas adyacentes, o entre PC3-let-7a-GFP células y células PC3-GFP. Los niveles de expresión de E2F2 y CCND2 es mayor en tejidos de cáncer de próstata que en sus muestras no cancerosas adyacentes. Después transfectadas con let-7a, los niveles de expresión de E2F2, CCND2, y k-ras disminuyeron dramáticamente en las células PC3-let-7a-GFP en comparación con la de las células PC3-GFP. β-actina se utilizó el control de carga.
Let-7a inhibe el crecimiento tumoral en el modelo de xenoinjerto de ratones desnudos
Los ratones desnudos que llevan xenoinjertos PC3-GFP PC3-let-7a-GFP o se sacrificaron 4 semanas después de la inoculación. Los tumores fueron extirpados y medidos (Fig. 5A). Western Blot mostró que los niveles de expresión de E2F2 y CCND2 disminuyeron drásticamente en los tumores PC3-let-7a-GFP en comparación con los tumores PC3-GFP (Fig. 5B). El peso de los tumores PC3-let-7a-GFP fue ~ 80% más ligero que los tumores PC3-GFP (Figura 5C,
p
. & Lt; 0,01). Además, la relación de peso del tumor /peso corporal en ratones con tumores PC3-let-7a-GFP fue sólo ~ 6% de la relación de los ratones portadores de tumores PC3-GFP (figura 5D,
p & lt
.; 0,01), lo que proporciona una fuerte evidencia de que el let-7a puede inhibir el crecimiento tumoral
in vivo
.
(a) Fotografía de tumores extirpados 4 semanas después de la implantación. La fila superior muestra los tumores extirpados de los ratones inyectados con células PC3-GFP. Cuanto más bajo son los tumores extirpados de los ratones inyectados con células PC3-let-7a-GFP. De los ratones inyectados con células PC3-let-7a-GFP, no se detectó tumor en un ratón y un ratón murió 2 días después de la inyección. (B) transferencia de Western demostró que la expresión de E2F2 y CCND2 se redujo drásticamente en los tumores extirpados de ratones PC3-let-7a-GFP-tumor-Bearin comparación con aquellos con tumores PC3-GFP. β-actina se utilizó como control interno. (C) El peso del tumor y la relación (D) de peso el peso del tumor /órgano se determinaron cuando se sacrificaron los ratones. Los valores representan las medias y las barras de error representan el SEM. (**
p Hotel & lt; 0,01; Mann-Whitney
T
prueba).
Discusión
La incapacidad de una célula para regular su crecimiento y proliferación es una característica distintiva del cáncer. Como moléculas críticos en la regulación del ciclo celular, las proteínas E2F están aguas abajo de las cascadas de señalización del factor de crecimiento. Influyen en el crecimiento y la proliferación celular a través de su capacidad para regular los genes implicados en la progresión del ciclo celular [10], [11]. E2F2 es un miembro de la familia E2F de factores de transcripción, y ha sido bien caracterizado como un regulador de la transición de la fase G1 a S [12]. Informes anteriores indican que E2F2 tiene una fuerte capacidad oncogénica y puede promover la progresión del ciclo celular. Las líneas celulares transfectadas con E2F2 proliferan al doble de la tasa de control de las células [13]. Para la correcta progresión a través del ciclo celular, la actividad de fosforilación de la quinasa dependiente de ciclina (CDK) es esencial. CCNDs se expresan en la fase G1 temprana y se unen Cdk4 y Cdk6 [14]. La activación de estas quinasas da como resultado la fosforilación de otros reguladores del ciclo celular críticos tales como pRb. PRB activa entonces E2Fs y permite la entrada en fase S. En consecuencia, la expresión aberrante de CCND2 y E2F2 dará lugar a la proliferación celular anormal. La sobreexpresión de CCND2 se informó en los tumores de ovario granulosas de células, cáncer gástrico y cáncer de colon [15] - [17]. Del mismo modo, se encontró la regulación positiva de E2F2 en los astrocitomas de diferentes grados [18].
miRNAs post-transcriptionally regular la expresión génica mediante la unión a la 3'UTR de ARNm diana. La unión conduce a la degradación de ARNm diana y la reducción de la traducción de proteínas diana. la actividad de los genes miARN también afecta a la expresión de los genes que se encuentran aguas abajo de los objetivos directos y pueden conducir a cambios en los perfiles de expresión de proteínas globales. Por lo tanto, potencialmente miRNAs juegan un papel crítico en la progresión del cáncer humano. Una gran cantidad de evidencia apoya que la expresión aberrante de miRNAs se produce en diversos tipos de cáncer humano, y en diferentes etapas de la progresión del cáncer [19], [20]. let-7 se ha informado de actuar como un supresor tumoral en algunos tipos de cáncer, como el de pulmón y el cáncer de colon [9], [21] - [23], y que la reducción de los niveles de expresión de let-7 se correlaciona con un mal pronóstico clínico [ ,,,0],24].
a pesar de esta correlación entre la expresión let-7 y la enfermedad es más fuerte en el tejido pulmonar, donde let-7 expresión es alta, nuestro estudio revela que el let-7 provoca defectos del ciclo celular en la línea celular de cáncer de próstata bien. Se encontró que el nivel de expresión let-7a está regulada hacia abajo de manera espectacular en las líneas de tejido de cáncer de próstata y células. Los niveles de proteína y mRNA expresión de E2F2 y CCND2 se redujeron regulado en las células PC3 y LNCaP después de la transfección con let-7a. Nuestros modelos de xenoinjertos de cáncer de próstata también confirman nuestros
in vitro
resultados y demostrar que let-7a tiene la capacidad de inhibir el desarrollo de tumores de próstata
in vivo
. Nuestro ensayo indicador de luciferasa dual se verifica que E2F2 y CCND2 son blancos directos de let-7a. Además, se han descrito otros genes asociados con la regulación del ciclo celular a ser reprimidos directa o indirectamente por let-7. Estos incluyen Cdc34, que promueve la degradación de la ciclina quinasa dependiente de ciclinas (CDK) 1B inhibidor y CCNA2, que promueve G2-M transiciones de fase [25] G1-S y. Nuestra fundación se expande la familia de let-7 objetivos, y la identificación de las vías moleculares afectadas en el cáncer podría revelar aún más los mecanismos por los cuales let-7a inhibe la división celular. Aunque todavía queda mucho por aprender sobre el papel de let-7a en la tumorigénesis del cáncer de próstata, let-7a nos proporciona una nueva forma de tratamiento para el cáncer de próstata a través de su capacidad para inducir la detención del ciclo celular y la inhibición del crecimiento celular.
Apoyo a la Información sobre Table S1.
Clínica factores patológicos de 26 pacientes utilizan actualmente
doi:. 10.1371 /journal.pone.0010147.s001 gratis (0.08 MB DOC)
Texto S1.
Secuencias de HSA-let-7a sintética, control negativo, HSA-let-7a inhibidor y control negativo inhibidor
doi:. 10.1371 /journal.pone.0010147.s002 gratis (DOC 0,02 MB)
Reconocimientos
Nos gustaría reconocer Lijie Él por su ayuda editorial excelente y sugerencias interesantes.