Extracto
Antecedentes
Los microARN (miRNA) son importantes reguladores que juegan un papel clave en la tumorigénesis y la progresión tumoral. Un informe anterior ha demostrado que los miembros de la familia let-7 pueden actuar como supresores de tumores en muchos tipos de cáncer. A través de miARN gama, encontramos que let-7f se downregulated en las líneas celulares de cáncer gástrico potenciales altamente metastásicas GC9811-P y SGC7901-M, cuando se compara con sus líneas celulares de sus padres, GC9811 y SGC7901-NM; Sin embargo, el mecanismo no está claro. En este estudio, investigamos si los actos let-7f como un supresor tumoral para inhibir la invasión y la metástasis en el cáncer gástrico.
Metodología /Principales
-PCR en tiempo real mostró disminución de los niveles de let-7f expresión en tejidos de cáncer gástrico metastásico y líneas celulares que son potencialmente altamente metastásico. la invasión celular y la migración fueron perjudicados de manera significativa en las líneas celulares SGC7901 GC9811-M-P y después de la transfección con let-7F-imita. ratones desnudos con modelos de xenoinjertos de cáncer gástrico confirmó que let-7f podría inhibir la metástasis del cáncer gástrico en vivo después de la transfección por el lentivirus pGCsil-GFP-let-7f. los ensayos de reportero de luciferasa demostraron que let-7F se une directamente a la 3'UTR de MYH9, que codifica para la miosina IIA, y PCR en tiempo real y Western Blot indicaron además que let-7f downregulated la expresión de la miosina IIA en el mRNA y los niveles de proteína .
Conclusiones /Importancia
Nuestro estudio demostró que la sobreexpresión de let-7f en el cáncer gástrico podría inhibir la invasión y la migración de células de cáncer gástrico a través de dirigirse directamente al MYH9 gen asociado a la metástasis tumoral. Estos datos sugieren que el let-7f puede ser un candidato terapéutico para el cáncer gástrico, dada su capacidad para reducir la invasión celular y la metástasis
Visto:. Liang S, L Él, Zhao X, Y Miao, Gu Y, Guo C, et al. (2011) MicroARN Let-7f inhibe la invasión tumoral y metástasis por la orientación MYH9 en el cáncer gástrico humano. PLoS ONE 6 (4): e18409. doi: 10.1371 /journal.pone.0018409
Editor: Donald Gullberg, Universidad de Bergen, Noruega
Recibido: 27 de septiembre de 2010; Aceptado: 7 Marzo 2011; Publicado: 18 de abril 2011
Derechos de Autor © 2011 Liang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 30801330, Nº 30871143, Nº 81030044)) y el Programa Nacional de Investigación básica de China (Nº 2010CB529300, Nº 2010CB529306). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer gástrico (CG) es la neoplasia gastrointestinal más común en Asia oriental, Europa del Este, y partes de América central y del Sur, y es la segunda causa principal de muertes relacionadas con el cáncer [1]. metástasis generalizada ha sido una de las principales razones para el triste resultado de pacientes con cáncer gástrico. La metástasis es un proceso complejo, multi-paso por el cual las células cancerosas migran de la neoplasia primaria a una ubicación distante [2]. El proceso se inicia cuando las células tumorales primarias invaden tejido adyacente, seguido por las células que entran en el torrente sanguíneo (intravasación), la translocación a través de la vasculatura, que sale de los vasos sanguíneos (extravasación) en el parénquima tejido circundante, iniciando micrometástasis y finalmente la proliferación para formar macroscópica secundaria tumores [3]. Uno de los reguladores críticos que participan en este proceso es un microARN (miARN) [4].
Los microARN (miRNA) son una clase de ARN endógenos y pequeños no codificantes de regulación, que regulan los genes en el post- nivel transcripcional [5]. miRNAs maduro puede ser transcrito por la ARN polimerasa II y se genera a partir del procesamiento secuencial de los transcritos primarios miARN por Drosha y Dicer; A continuación, sirven como reguladores de la expresión génica posttranscriptional a través de apareamiento de bases complementarias a los ARN mensajeros [6]. Muchos informes demuestran que miRNAs juegan un papel clave en diversos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación celular, la proliferación, la apoptosis, la resistencia al estrés, metabolismo de las grasas, la tumorigénesis y la metástasis de tumores [7], [8], [9].
la familia let-7 es una familia conservada de miRNAs. Let-7 se observó originalmente en las nematodo Caenorhabditis elegans [10], y catorce miembros se han encontrado hasta la fecha [11]. Recientemente, se encontró que los niveles de expresión de muchos miembros de let-7-familiares a reducirse en una variedad de cánceres. Por ejemplo, vamos-7 es downregulated en el cáncer de pulmón, melanoma y carcinoma de cabeza y escamosas del cuello, mientras que la sobreexpresión de let-7 puede inhibir el crecimiento de células de cáncer [12], [13], [14], [15], [16 ], [17], [18]. Varios oncogenes, tales como ras, myc, y HMGA2, son blancos directos de let-7 [19], [20], [21]. Let-7F es un miembro de la familia let-7. Estudios anteriores han demostrado que let-7f está regulado en el cáncer de mama primario y promueve la angiogénesis [22]; regulación a la baja en la HAP [23] fue causada por la hipoxia crónica o monocrotaline en ratas, y el nivel se redujo en vesículas en plasma de pacientes con NSCLC [24]. Además, let-7f puede afectar a la proliferación celular por la orientación peptidasas relacionadas con calicreína (KLKs), una familia de serina proteasas que se han demostrado para ser dysregulated en varios tumores malignos, incluyendo el cáncer de ovario [25].
Nuestra laboratorio han identificado previamente un grupo de miRNAs expresados diferencialmente entre GC9811 y GC9811 células-P a través de chips de microARN de alto perfil de análisis que contiene let-7f [26]. Durante la caracterización adicional de let-7f en varias líneas celulares de cáncer, encontramos que las funciones de let-7f como un supresor de la metástasis. La mayor expresión de let-7f puede suprimir la invasión de células GC y la migración in vitro e in vivo. Por análisis de la bioinformática, identificamos que MYH9, que codifica una cadena pesada de la miosina II involucrados en la promoción de la migración de células de cáncer o invasión, como un objetivo let-7f putativo. Experimentos posteriores confirmaron que let-7f puede regular a la baja la expresión de la miosina IIA apuntando el 3'UTR de MYH9, que proporciona una posible diana para el tratamiento de GC.
Materiales y Métodos
Colección de tejidos
tejidos tumorales primarios gástricos, tejidos gástricos no tumorales adyacentes y los tejidos gástricos metastásicos distantes fueron obtenidas de pacientes que se sometieron a cirugía en el hospital Xijing de Enfermedades digestivas en Xi'an, china. Todas las muestras fueron clínica y patológicamente muestran que ser etiquetados correctamente. Los pacientes que ofrecen muestras para el estudio firmaron formularios de consentimiento informado.
Cultivo de células
Las líneas celulares de cáncer gástrico humano GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, SGC7901-M se conserva en nuestro propio laboratorio y se cultivaron en RPMI1640 (Hyclone), suplementado con 10% de suero bovino fetal. (FBS; GIBCO), 100 unidades /ml de penicilina, y 0,1 mg /ml de estreptomicina a 37 ° C en un incubador de dióxido de carbono al 5% humidificada
extracción de RNA y PCR en tiempo real
QRT-PCR se realizó para determinar los niveles de expresión de los genes diana potenciales let-7f. ARN total fue extraído a partir de tejidos o células cultivadas usando el reactivo TRIZOL (Invitrogen Life Technologies). ADN complementario (ADNc) se generó mediante el uso de un kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems). análisis de PCR en tiempo real se realizaron con un kit TaqMan Micro-RNA de ensayo (Applied Biosystems). Imprimación de let-7f fue adquirido de Ambion (MI0000437). Imprimación de la secuencia MYH9 fue diseñado utilizando software Primer Express (versión 1.5). La secuencia del cebador-MYH9: (Forward) 5'AGAGCTCACGTGCCTCAACG3 'protocolos (inversa) 5'TGACCACACAGAACAGGCCTG3'.All se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El nivel de expresión de let-7f se normalizó a las 5S (Forward: 5'GATTGAATCGAGCACCAGTTAC3 ';
Invertir: 5'GTCTACGGCCATACCACCCTGAAC3'). El nivel de expresión de MYH9 era to18S normalizados (Forward: 5'CGGCTACCACATCCAAGGAA3 ';
Invertir: 5'GCTGGAATATCCGCGGCT3') PCR y la recogida de datos se realizaron en un iCycler (Bio-Rad).. Cada muestra se realizó por triplicado
constructos de vectores y Lentivirus Producción
La secuencia-let-7f PRI se construyó como sigue:. (Adelante) hsa-let-7F-1-XhoI SI GGGCCCGCTCTAGACTCGAGATATTTGCATGTCGCTATGTG , (marcha atrás) hsa-let-7F-1- BamH IR CGCGGCCGCCTAATGGATCCAAAAAAGGCACAGTCGAGGCTGATC. La secuencia se amplificó y se clonó en el pGCsil-GFP vectorial (GENECHEM) para generar pGCsil-GFP-let-7f. El control negativo fue PGC FU-RNAi-NC-LV. embalaje virus se realizó en las células HEK 293T después de la cotransfección de 20 g vector pGCsil-GFP-let-7f con 15 g del plásmido embalaje pHelper 1.0 Vector y 10 g del plásmido sobre pHelper 2.0 Vector usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Los virus se cosecharon 48 h después de la transfección, y se determinaron los títulos virales.
construcción de oligonucleótidos
let-7f imita, permiten 7f-inhibidor y siRNA oligonucleótidos de control negativo se chemosynthesized (Shanghai GenePhama Co., Limitado). Los oligonucleótidos utilizados en estos estudios fueron imita ha-let-7F: 5'UGAGGUAGUAGAUUGUAUAGUU3'and 5'CUAUACAAUCUACCUCAUU3 ';
control negativo
Imita: 5'UUCUCCGAACGUGUCACGUT3'and5'ACGUGACACGUUCGGAGAATT3', cuenta-let-7f inhibidor: 5'AACUAUACAAUCUACUACCUCA3 '. MircoRNA inhibidor control negativo: 5'CAGUACUUUUGUGUAGUACAA3 '
Transfección de células
Las células fueron cultivadas a 80% a 90% de confluencia después de ser sembradas en placas de 6 pocillos y se transfectaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen. , Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Para la transfección transitoria, las células en cada pocillo de una placa de 6 pocillos se transfectaron con 12,5 l inhibidor de miARN o 7,5 l miARN oligonucleótidos imitan. Después de 48 h de la transfección, se recogieron las células para la experimentación adicional. Para las células transfectadas de manera estable, las células fueron transfectadas con lentivirus en 30% -50% de confluencia. Las células diana (1 × 10
4), incluyendo GC 9811-P y las células SGC7901-M, se infectaron con 1 x 10
6 unidades de lentivirus de transducción de recombinantes en presencia de 6 mg /ml de polibreno (GENECHEM) .
ensayo de invasión
La capacidad invasiva de las células fue ensayada mediante Transwells (tamaño de poro de 8 micras, Corning Costar Corp). Los Transwells se pusieron en las placas de 24 pocillos. En primer lugar, se añadieron 0,1 ml de Matrigel (50 mg /ml, BD Biosciences) en la superficie de la placa y se incubaron durante 2 h, y después se eliminó el sobrenadante. Recién tratadas con tripsina y se lavaron las células (GC9811, GC9811-p, SGC7901-NM, SGC7901-M) se suspendieron en RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 1%. A continuación, se añadieron 100 l de la suspensión de células (1 x 10
5 células) a la cámara superior de cada inserto que fue recubierta con Matrigel. A continuación, se añadieron 450 l de RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 10% en el compartimento inferior, y se dejó que las células para invadir para 24 h-48 h a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado. Después de la incubación, las células se fijaron con alcohol absoluto 95% y se tiñeron con cristal violeta. Las células en la superficie superior del filtro se retiraron con el hisopo de algodón y las células que habían invadido en la superficie inferior del filtro se contaron y la imagen en un microscopio invertido (Olympus Corp. de Tokio, Japón) a 200 × magnificación más de diez azar campos en cada pocillo. Cada experimento se realizó por triplicado.
La migración celular
La capacidad de GC9811, GC9811-P, SGC7901-NM, y las células SGC7901-M para migrar se detectó utilizando Transwells [poro 8-micras tamaño, Corning Costar Corp]. Los Transwells se pusieron en las placas de 24 pocillos. Recién con tripsina y se suspendieron células lavadas en RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 1%. 5 × 10
4 células /pocillo se colocaron en la cámara superior de cada inserto (BD Biosciences, NJ), con la membrana no recubierta. Se añadieron 450 l de RPMI1640 que contenía suero bovino fetal al 10% en las cámaras inferiores. Después de incubar durante 24 h-48 h a 37 ° C en un 5% CO
2 incubador humidificado, las células se fijaron con alcohol absoluto 95% y se tiñeron con cristal violeta. Las células en la cámara interior se eliminaron con un hisopo de algodón y las células unidas a la parte inferior de la membrana se contaron y la imagen en un microscopio invertido (Olympus Corp. de Tokio, Japón) a 200 × magnificación más de diez campos al azar en cada pocillo . Cada experimento se realizó por triplicado.
En Vivo metástasis ensayo
Para los ensayos de metástasis in vivo, las líneas celulares estables GC9811-P y SGC7901-M se recogieron de los matraces de cultivo de tejidos después de la transfección con el lentivirus pGCsil-GFP-let-7f y controlar pGCsil-GFP usando tripsina y se lavó tres veces con PBS. A continuación, 2 × 10
6 células se suspendieron en 0,2 ml RPMI1640 libre de suero para cada ratón (seis en cada grupo, Fale BALB /c-nu /nu, de 6-8 semanas de edad), y se inyectaron las células en el vena de la cola. Después de cuatro semanas de la inyección, se sacrificaron los ratones. se observó el tejido de hígado con el ojo desnudo, y se contó el número de tumores visibles en la superficie del hígado. Los tejidos del hígado se dividieron en secciones en serie, fijadas con formalina neutra tamponada con fosfato, se tiñeron con hematoxilina y eosina y se examinaron histológicamente. Los ratones desnudos fueron manipulados y atendidos según las directrices de NIH de Cuidado de Animales y el empleo en el experimento Centro Animal de la Cuarta Universidad Médica Militar (Xi'an, provincia de Shanxi, República Popular China).
luciferasa reportero de ensayo
Para investigar si la expresión MYH9 estaba regulado por let-7f, se realizó un ensayo doble-informador de luciferasa. La 3 'UTR de MYH9 que contiene sitio de unión let-7f se amplificó por PCR. La amplificación de MYH9 utiliza los siguientes cebadores: (adelante) XhoIF: 5'CCGctcgagGCCTCTTCTCCTGCAGCCTG 3 '(marcha atrás) NotIR: 5'ATAAGAATgcggccgcTCGTAGCACATGGTTCTCTTTATTG 3'
Como control negativo, el sitio de unión mutada de la secuencia 3'-UTR (utilizando el complemento inverso del sitio de unión) se amplificó usando los cebadores: (Forward) mutlet7MYH9F: 5'TTGCAATCACACGTGGTGTGGAGTCACACCTCTGCCCCTTGG3 '(inversa) mutlet7MYH9R: 5'CCAAGGGGCAGAGGTGTGACTCCACACCACGTGTGATTGCAA 3'. Los productos fueron recuperados a través de electroforesis en gel de agarosa, y se clonaron en el vector informador de luciferasa PsiCHECK (Promega, Madison, WI). Todas las construcciones fueron verificadas por secuenciacion. La fase logarítmica células GC9811-P fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se cotransfectaron con inhibidores Let-7F o control, y reporteros de luciferasa utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen), siguiendo las instrucciones. Después de 48 h de incubación, luciérnaga y luciferasa de Renilla actividad se midió con el sistema de ensayo indicador de luciferasa dual (Promega).
Western Blot
Las células fueron lavadas dos veces con helado de PBS y se rasparon en tampón RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% (v /v) de Triton X-100, EDTA 1 mM, leupeptina 1 mM, 1 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo, mM NaF 10 mM, Na3VO4 1) con recién añadió cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) durante 15 min en hielo, después se centrifugó a 13.000 rpm durante 10 min y se recogieron los sobrenadantes. Diez microgramos de cada muestra se resuelven utilizando 6% de SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad, Hercules, CA). Las bandas se incubaron con leche descremada en polvo 10% en Tris-solución salina tamponada-0,1% de Tween-20 para bloquear los sitios de unión no específicos y se incubaron con un anticuerpo primario: policlonal de conejo anti-miosina humana IIA (diluyeron 1:500; Cell Signaling Technology ) durante la noche a 4 ° C. Después de recalentamiento y el lavado repetido tres veces, 15 min para cada uno, las membranas se incubaron con anti-anticuerpo secundario de conejo con peroxidasa de rábano conjugada (Santa Cruz Biotechnology), se diluyó 1:2000 durante dos horas a temperatura ambiente. Las bandas se detectaron utilizando un sistema de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences).
La inmunohistoquímica
Dos matrices tisulares fueron adquiridos de Shanxi Chaoying BIOTECNOLOGÍA CO., LTD. Uno de ellos era el tejido de cáncer gástrico y tejido del estómago normal adyacente emparejado, el otro fue de tejido de cáncer gástrico y emparejado de metástasis de ganglios linfáticos arrays .Tissue se dewaxed en 60 ° C durante 2 h, la recuperación de antígenos de alta temperatura durante 10 minutos, rehidratada, incubadas en 10% suero normal de cabra durante 1 h, después se incubaron con anticuerpo policlonal de conejo anti-humano miosina II a (diluida 1:100; Cell Signaling Technology) durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron en PBS tres veces durante 5 min cada uno. Los tejidos se incubaron en suero de cabra anti-conejo (DAKO) durante 1 h, se enjuagaron con PBS. Las secciones fueron detectados utilizando DAB y de contraste con hematoxilina. La intensidad de la tinción se puntuó en una escala de cuatro pasos (0, 1+, 2+, 3+ o) y el porcentaje de células positivas se estimó por tres patólogos diferentes (0 = ninguno, 1 = & lt; 1%, 2 = 1 -10%, 3 = 10 a 30%, 4 = 30 a 70%, 5 = & gt; 70% de las células tumorales). las puntuaciones medias totales fueron agrupados en cuatro categorías: negativo (sin tinción detectable cuando se evaluó en comparación con la tinción de fondo no específica, débil (+), moderada (++) o fuerte (+++) y se compararon mediante la prueba de Mann-Whitney
Análisis estadístico
t de Student (dos colas), ANOVA de una vía y la prueba de Mann-Whitney se utilizó para analizar la in vitro e in vivo en el uso del software SPSS 12.0 (Chicago, IL , EE.UU.) valor P. & lt; 0,05 se define como estadísticamente significativa *
P
. & lt; 0,05; **
P
. & lt; 0,01
resultados
El nivel de expresión let-7f se redujo con frecuencia en las líneas celulares metastásico GC humana y tejidos
Hemos examinado los niveles de expresión de ARNm de let-7f en dos pares de líneas celulares de cáncer gástrico humano, GC9811, GC9811 -P y SGC7901-NM, SGC7901-M. Como se muestra en la Figura 1A, la expresión de let-7f fue menor en las células de GC, GC9811-P y SGC7901-M, con un alto potencial metastásico, mientras que let-7f fue más altamente expresado en las células de GC, GC9811 y SGC7901-NM, con bajo potencial metastásico. A fin de validar el papel de let-7f en gástrica células de cáncer de metástasis, se compararon los niveles de expresión de let-7f en las muestras gástricas humanas frescas de tejido de cáncer con metástasis a partir de ocho individuos (Tabla S1), a los tejidos gástricos normales (NG), primaria tejidos de cáncer gástrico (GC) y tejidos distantes metastásicas de cáncer gástrico (MC), respectivamente, por PCR en tiempo real. Curiosamente, no fue notable regulación a la baja de let-7f en MC y GC, en comparación con let-7f expresión en MAL (Figura 1B). Hemos observado que, o bien la pérdida o disminución de la expresión de let-7f en tumores metastásicos y sus tejidos resultó en una mayor metástasis en tejidos de cáncer gástrico. Los resultados sugirieron que todos la expresión de let-7f se correlacionó negativamente muy estrechamente con metástasis GC disminuido y podría desempeñar un papel fundamental en los procesos patológicos. Hemos proporcionado pruebas de este modo conceptual clínica y celular de un interruptor en el desarrollo del cáncer metastásico que sugiere un papel clave para la expresión de let-7f en el desarrollo del cáncer.
(A) La media de los factores de cambio de let-7f la expresión génica en GC9811 y GC9811-P (a la derecha). La media de los factores de cambio de la expresión génica 7f dejar-en-NM SGC7901 y SGC7901-M (izquierda). La prueba t de Student, n = 3. (B) La expresión relativa de let-7f de 5S. *
P Hotel & lt; 0,05. **
P Hotel & lt; 0,01. ANOVA de una vía, n = 8.-PCR en tiempo real muestran que la expresión relativa de let-7f en ocho muestras de tejido gástrico no cancerosas adyacentes, y en líneas celulares de cáncer gástrico GC9811, SGC7901-NM es mayor que en su primaria cáncer gástrico y muestras de metástasis distantes gástrica y el alto potencial de las células del cáncer gástrico metástasis GC9811-P y muestra SGC7901-M.Each se analizó por triplicado y se normalizó a las 5S. cambio veces se calculó 2-
ΔΔ Ct
.
Let-7f inhibe la capacidad invasiva y metastásica de las células in vitro GC
Debido a los actos let-7F como un agitador en la invasión y procesos metastásicos, se investigaron los efectos de la disminución de let-7f sobre líneas de células metastásicas menos y el aumento de let-7f sobre las líneas celulares más metastásicos. Para lograr esto, ARN corto de interferencia (siRNA) oligonucleótidos de let-7f fueron construidos e introducidos en las células y las células GC9811 SGC7901 -nm para ensayos de metástasis in vitro, como las células-7F-siRNA GC9811-let, SGC7901-NM-let-7f células -siRNA y las células de control. Al mismo tiempo, mímica-dejar-7F oligonucleótidos de control y negativas También se construyeron y se introducen en las células GC9811-P y células SGC7901-M para ensayos de metástasis in vitro, como células GC9811-p-7F-mímica dejó, SGC7901-N-ha dejado las células y las células de control -7f-mímica. El agotamiento de let-7F significativamente afectada la capacidad de las células GC9811 migrar e invadir a través de las membranas de Matrigel recubierto o las membranas no matrigel recubierto hacia en un ensayo de cámara de Boyden modificada medio que contiene suero (Figura 2A). El aumento de expresión de let-7F suprimió significativamente la capacidad de las células GC9811-P para migrar e invadir a través de membranas de Matrigel recubierto o membranas no matrigel recubierto hacia medio que contiene suero en un ensayo de cámara de Boyden modificada (Figura 2B), en comparación con las células de control. Se encontraron resultados similares en células SGC7901-nm (Figura 3A) y células SGC7901-M (Figura 3B), mientras que let-7f nocaut en líneas celulares de GC dio lugar a mayores tasas de invasión y migración.
(A) Invasión y ensayo de migración. campos representativos de invasiva (arriba) o células de migración (hacia abajo) en la membrana (izquierda). (Aumento de × 200). número de células invasoras o la migración promedio por campo (a la derecha). El número de células invasoras o migración de células transfectadas con GC9811 LET-7F-inhibidores se incrementa drásticamente que transfectadas con control negativo. * P & lt; 0,05, prueba t de Student, n = 10. (B). El número de células invasoras o migración de células GC9811-P transfectadas con LET-7F-imita es drásticamente disminuida que transfectadas con control negativo. * P & lt; 0,05, prueba t de Student, n = 10.
(A) La invasión y la migración de ensayo. campos representativos de invasiva (arriba) o células de migración (hacia abajo) en la membrana (izquierda). (Aumento de × 200). número de células invasoras o la migración promedio por campo (a la derecha). El número de células invasoras o migración de SGC7901-NM transfectadas con let-7F-inhibidores se incrementa drásticamente que transfectadas con el control negativo. * P & lt; 0,05, prueba t de Student, n = 10. (B) El número de células invasoras o migración de células SGC7901 M-transfectadas con let-7F-imita disminuye drásticamente que transfectadas con el control negativo. * P & lt; 0,05, prueba t de Student, n = 10.
Let-7f inhibe la invasión tumoral y la metástasis en un modelo de xenoinjerto en ratones desnudos
GC9811-P o M-SGC7901 las células tumorales transfectadas con el lentivirus pGCsil-GFP de control let-7f o negativo pGCsil-GFP se inyectaron en ratones desnudos y los ratones fueron sacrificados cuatro semanas después de las inoculaciones. El número de nodi metastásico se redujo drásticamente en los ratones desnudos inyectados con las células transfectadas dejar-7F pGCsil-GFP, en comparación con los controles negativos (Figura 4A, 4B). Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que deje-7f puede inhibir la invasión tumoral y la metástasis in vivo.
Células
GC9811-P y SGC7901-M fueron transfectadas con lentivirus pGCsil-GFP-let-7f lentivirus o control negativo pGCsil- GFP, y luego se inyecta en ratones desnudos a través de la vena de la cola, como se describe en Materiales y Métodos. Los animales se sacrificaron 4 semanas después de la inyección. (A) fotos anatómicas representativos de la vida de los ratones inyectados con GC9811-P-GFP o pGCsil GC9811-P- pGCsil-GFP-let-7F (izquierda). La media del número de nódulos tumorales visibles en el hígado (a la derecha). P & lt; 0,01. La prueba t de Student, n = 6. (B) fotos anatómicas representativos de la vida de los ratones inyectados con SGC7901-M - pGCsil-GFP o SGC7901-M - pGCsil-GFP-let-7F (izquierda). La media del número de nódulos tumorales visibles en el hígado (a la derecha). P & lt; 0,01. La prueba t de Student, n = 6.
Let-7f regula a la baja la miosina IIA expresión atacando directamente a su extremo 3 'UTR
Para profundizar en el mecanismo por el cual let-7f suprime GC invasión y metástasis, se analizaron los potenciales relacionados con metástasis tumorales genes diana aguas abajo in silico. Nos centramos en los genes diana let-7F, especialmente aquellos genes que son la migración y /o relacionados invasión, y encontramos que la miosina IIA, que participan en la promoción de la migración de células de cáncer o invasión, podría ser el gen diana de let-7f. En un esfuerzo para determinar si la miosina IIA está regulada por let-7f a través de la unión directa a su 3 'UTR, se construyó de longitud completa de tipo salvaje y fragmentos mutantes de MYH9 mRNA 3' UTR, y los inserta en la región inmediatamente aguas abajo de un gen indicador de luciferasa (Figura 5A). Posteriormente, oligos imitan dejar-7F fueron co-transfectadas con diferente luciferasa 3 'UTR construcciones en células GC9811-P. Se encontró que el let-7f disminuyó la actividad de luciferasa relativa en la naturaleza de tipo 3 'UTR de MYH9 (Figura 5B). Sin embargo, la actividad de la luciferasa no cayó drásticamente en los UTRs con sitios de unión de mutantes, en comparación con los homólogos de tipo mut (Figura 5C). Estos datos apoyan que MYH9 es blanco directo de let-7f.
(A) pronosticó la formación de dúplex entre el ser humano MYH9 3'UTR (arriba) y tiene-let-7F (parte inferior) y la secuencia de la let- sitio dentro de la 3'UTR MYH9 y mutante (mut) MYH9 3'UTR 7f vinculante. La actividad de luciferasa de la MYH9 3'UTR (B) o MYH9 mut gen (C) 3'UTR informador en células infectadas con el GC9811 let-7F, let-7F-inhibidor, oligo mímica en blanco o vacío. Los ensayos mostraron que las actividades de luciferasa en el grupo significativamente se disminuyeron en comparación con los de los grupos de control mutantes y negativos. * P & lt; 0,05. (D) La expresión de MYH9 se analizó mediante qRT-PCR. MYH9 se redujo en las células GC9811 y SGC7901 células transfectadas con let-7F-imita comparación con las células GC9811 y SGC7901 células transfectadas con el control -negativo let-7f. (E) let-7f suprime los niveles de proteína endógenos de MYH9, tal como se detectó por Western blot. Estable SGC7901-NM transducidas y las células que expresan GC9811 ectópica let-7f se utilizaron para el análisis de transferencia Western. Efecto de let-7f en MYH9 en las células GC9811 (arriba). Efecto de let-7f en MYH9 en las células SGC7901-NM (parte inferior).
RT-PCR mostró que la expresión de MYH9 en las células y las células GC9811 SGC7901-NM transfectadas con let-7F-imita es downregulated en comparación con las células transfectadas con construcciones de control (Figura 5D). resultados de transferencia Western mostraron expresión de la miosina IIA en GC9811 y células SGC7901-NM transfectadas con let-7F-imita son las reguladas en comparación con las transfectadas con el control negativo (Figura 5E). Furthmore, PCR en tiempo real que muestra la expresión del ARNm relativa de MYH9 en los tejidos GC y tejidos con metástasis a distancia son el regulado en comparación con sus muestras no cancerosas adyacentes normales (Figura 6A). La inmunohistoquímica mostró que la expresión de la IIA miosina en GC metástasis en los ganglios linfáticos es hasta reguladas en comparación con su tejido primario GC (Tabla 2, Figura 6C; Figura S1 B), y es hasta reguladas en el tejido GC en comparación con su estómago normal adyacente emparejado tejidos (Tabla 1; Figura 6B; Figura S1 A) .Estos datos demuestran que let-7f puede regular a la baja la expresión de ARNm de MYH9 y puede reprimir la traducción de la proteína de la misma
(A) en tiempo real PCR espectáculo. que la expresión relativa de MYH9 en ocho muestras de metástasis distantes gástrico es más alta que en su cáncer gástrico primario y muestras de tejido gástrico no cancerosas adyacentes. Cada muestra se analizó por triplicado y se normalizaron a 18S. (B) Expresión de MYH9 en cáncer primario gástrico (Ca) y su adyacente tejido del estómago normal (N) por IHC. (C) Expresión de MYH9 en el cáncer gástrico primario (Ca) y sus ganglios linfáticos metástasis emparejado tejido (M) por IHC.
Discusión
En el presente estudio, hemos demostrado que la expresión let-7f en líneas celulares de GC metastásico fue regulado por disminución en comparación con let-7f expresión en células de GC no metastásicos. La expresión ectópica y siRNA desmontables de let-7f confirmaron su actividad supresora de la invasión in vitro e in vivo. Por otra parte, nos muestran que MYH9 es un objetivo directo de let-7F y dejar que esta supresión mediada-7f de MYH9 depende de su 3'-UTR. Por lo tanto, estos resultados ponen de manifiesto la importancia de let-7f como un supresor tumoral en células invasión y metástasis por la orientación MYH9 en el cáncer gástrico
.
Estudios recientes muestran que los miRNAs pueden actuar como activadores o inhibidores de la metástasis del tumor [27] . Por ejemplo, el microARN-10b [28], el miR-373 y miR-520c [29], [30] estimulan la migración celular y la invasión del cáncer en el cáncer de mama. Además, miR-155 puede promover la invasión tumoral y la metástasis en el cáncer de mama por la regulación negativa de su objetivo, RhoA [31] y promover la invasión tumoral y metástasis en el carcinoma de conducto de páncreas mediante la represión de la expresión de TP53INP1 [32]. La familia de miRNA-200 (miRNA-200a, 200b-miARN, miARN-200c, miRNA-141 y miRNA-429) puede inhibir la invasión tumoral y la metástasis mediante la regulación de la EMT [33]. MiR-126 se encontró que inhibe la adhesión celular, la migración y la invasión parcialmente a través de la supresión de la CRK en un modelo in vitro de carcinoma de pulmón de células no pequeñas [34]. Se ha demostrado que el miR-29c se reduce significativamente en el carcinoma nasofaríngeo altamente invasivo y metastásico [35]. MIR-218 inhibe la invasión y la metástasis de cáncer gástrico por diana es el receptor Robo1 [26]. Aunque muchos estudios se han realizado para investigar el mecanismo de miARN y la metástasis tumoral, el mecanismo no está claro. Lo más importante, pocos estudios se han realizado sobre los mecanismos de regulación GC metástasis por microARN
.
El gen let-7f está situado en 9q22.3, y está implicado en una variedad de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la angiogénesis [36], immunocyte diferenciación [37], la senescencia replicativa [38], la detención del crecimiento [39], la hipertensión arterial pulmonar y la carcinogénesis [23]. Let-7f está regulado por disminución en varios tumores malignos. Un ejemplo muy caracterizado es el carcinoma de células renales, en el que dejó 7f-regulación a la baja dado lugar a una disminución significativa en la calicreína (KLK) la expresión [40]. KLKs también puede ser objetivo de let-7f en el cáncer de ovario [25]. En el cáncer de tiroides papilar, la reducción de expresión de let-7f podría ser un evento molecular esencial en RET /PTC transformación maligna [41]. En el caso de cáncer de mama primario, sin embargo, dejar-7f se upregulated en comparación con tejidos tumorales adyacentes normales [22]. En nuestro estudio, hemos demostrado que let-7F también está regulado por disminución en los tejidos y líneas celulares MC GC con alto potencial metastásico, y hemos explorado aún más el mecanismo por el cual let-7f la invasión tumoral y la metástasis reducida.
MYH9 es el gen de la miosina no muscular de la cadena pesada IIA (NMHCIIA), cuyas mutaciones son responsables de un trastorno complejo llamado enfermedad relacionada con el MYH9, caracterizado por una combinación de diferentes características fenotípicas [42].