Extracto
Aplicaciones
El cáncer de próstata (CaP) se caracteriza por la expresión desregulada de supresor de tumores oncogénicos varios o miRNAs. El objetivo de este estudio fue la identificación y caracterización de miR-let-7c como un supresor tumoral potencial en el CP.
Diseño Experimental
Los niveles de expresión de miR-let-7c se examinaron en humano líneas celulares y tejidos con CaP usando QRT-PCR y
In situ
hibridación. Let-7c se sobreexpresa o suprimida para evaluar los efectos sobre el crecimiento de líneas celulares de CaP humanos. Lentiviral mediada por la re-expresión de let-7c se utilizó para evaluar los efectos sobre xenoinjertos humanos CaP.
Resultados
Se identificaron miR-let-7c como un supresor tumoral potencial en el CP. La expresión de let-7c está regulado por disminución en las células resistentes a la castración cáncer de próstata (CRPC). La sobreexpresión de let-7c disminuyó, mientras que la regulación negativa de let-7c aumento de la proliferación celular, clonogenicidad y anclaje independiente crecimiento de las células de CaP
in vitro
. Supresión de la expresión let-7c mejoró la capacidad de las células de CaP sensibles a los andrógenos de crecer en condiciones de andrógenos privados
in vitro
. La reconstitución de let-7c de suministro intratumoral lentiviral mediada redujo significativamente la carga tumoral en xenoinjertos de células de CaP humanos. Por otra parte, let-7c expresión está regulada negativamente en el CaP muestras clínicas, en comparación con sus tejidos benignos coincidentes, mientras que la expresión de Lin28, un regulador maestro de procesamiento de let-7 miARN, está regulada positivamente en muestras clínicas con CaP.
Conclusiones
Estos resultados demuestran que el micro ARN let-7c está regulado por disminución en el CaP y funciona como un supresor de tumores, y es una posible diana terapéutica para el CaP
Visto:. Nadiminty N, R Tummala, Lou W, Zhu Y, Shi XB, Zou JX, et al. (2012) MicroARN let-7c es downregulated en cáncer de próstata y el crecimiento del cáncer de próstata suprime. PLoS ONE 7 (3): e32832. doi: 10.1371 /journal.pone.0032832
Editor: Gokul M. Das, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos de América
Recibido: 13 Julio, 2011; Aceptado: February 2, 2012; Publicado: 30 Marzo 2012
Derechos de Autor © 2012 Nadiminty et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH CA140468, CA118887, CA109441, el DOD PC080538 (AG) y el DOD PC100502, Sociedad Americana del cáncer-IRG (NN). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia
Introducción
el cáncer de próstata (CaP) es la neoplasia maligna más comúnmente se producen y la segunda causa más frecuente de muerte por cáncer en los hombres en los EE.UU.. La mayoría de los pacientes con CP avanzado responden inicialmente a la terapia de privación de andrógenos, pero la recaída debido al crecimiento de las células de cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC). Importantes esfuerzos se han centrado en la comprensión de los mecanismos implicados en el desarrollo y progresión de la CRPC. MicroARNs (miRNAs) son endógenos pequeños ARN no codificantes que pueden interferir con la expresión de proteínas, ya sea mediante la inducción de la escisión de sus ARNm diana específicas o mediante la inhibición de su traducción. miRNAs maduros son evolutivamente conservados ARN de cadena simple ~22nt derivados de un procesamiento de múltiples etapas de moléculas precursoras más grandes a través de Drosha y Dicer. Finalmente, los miRNAs maduros se incorporan en el complejo RISC junto con sus mRNAs diana que son reconocidos por complementariedad de secuencia en el extremo 3 'UTR [1]. Cada miARN puede apuntar a varios mRNAs diferentes y cada ARNm puede ser el blanco de múltiples miRNAs, generando una intrincada red de regulación de la expresión génica. MiRNAs han demostrado que regulan una lista cada vez mayor de complejos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación, el ciclo celular, la apoptosis y el metabolismo de [2]. Una abrumadora cantidad de nuevas pruebas apuntan a sus funciones como supresores de tumores u oncogenes, que presenta toda una gama de nuevas oportunidades de diagnóstico y terapéuticos [1], [3].
Let-7 codifica una familia conservada evolutivamente de 13 miRNAs homólogas situadas en ubicaciones genómicas con frecuencia eliminan en los cánceres humanos [4]. La expresión de let-7 en líneas celulares de cáncer pulmonar reducida proliferación celular [5] y la tumorigénesis inhibido de las células de cáncer de mama al mismo tiempo reducir las metástasis [6]. La sobreexpresión de let-7 también disminución de la resistencia de células de cáncer de pulmón a la radioterapia [7]. La reducción de expresión de let-7 en los cánceres de pulmón humanos se ha asociado con la supervivencia acortada postoperatorio, lo que sugiere que let-7 puede ser un importante marcador pronóstico en el cáncer de pulmón [8]. Del mismo modo, se encontró que la tasa de supervivencia libre de progresión a los 5 años a ser mayor en los pacientes con cáncer de ovario con un menor HMGA2 /let-7 proporciones en comparación con aquellos con mayores HMGA2 /let-7 proporciones [9]. Existe un vínculo evidente entre la pérdida de let-7 expresión y el desarrollo de los cánceres pobremente diferenciados y agresivos [10]. Let-7 se encontró expresión a ser regulados a la baja en los tejidos de CaP localizado con respecto al tejido zona periférica benigna [11], [12]. Let-7 miembros se han demostrado para regular los niveles de expresión de oncogenes como HMGA2 [5], RAS [13] y Myc [14] junto con genes implicados en el ciclo celular y la regulación de la división celular. Las estrategias terapéuticas se están desarrollando la orientación let-7, utilizando la sobreexpresión Lenti-o-adeno-viral codificada de let-7 o la transfección transitoria de los precursores de doble cadena de let-7 [15], [16]. Por lo tanto, let-7 se muestra prometedor como marcador molecular en ciertos tipos de cáncer y como un agente terapéutico potencial en el tratamiento del cáncer.
Lin28, una proteína de unión al ARN altamente conservada y un regulador maestro de procesamiento de let-7 miARN, es sobreexpresa en tumores primarios humanos [17], [18] y se postula para ser uno de los factores de células madre embrionarias que promueven la oncogénesis y la proliferación de células cancerosas, mediante la represión de la familia let-7 de supresores de tumores [19]. Lin28 se une a los bucles terminales de los precursores de let-7 miRNAs familiares y bloquea su transformación en miRNAs maduros [20], [21]. Lin28 también derepresses c-Myc mediante la represión de let-7 y C-Myc se activa transcripcionalmente Lin28 [22], [23]. Este Lin28 /let-7 /c-Myc bucle puede desempeñar un papel importante en la firma miARN expresión desregulada observado en muchos tipos de cáncer [24].
En este estudio, hemos demostrado que let-7c, una de las miembros de la familia let-7, suprime el crecimiento CaP
in vitro
y
in vivo
. La sobreexpresión de let-7c condujo a la inhibición de la dependiente de anclaje, así como el crecimiento independiente de anclaje de células de CaP. Reexpresión de let-7c en xenoinjertos de células de CaP humanos utilizando inhibe el crecimiento tumoral let-7c lentivirally codificada de manera significativa. Además, la expresión let-7c es downregulated en especímenes clínicos CaP. Nuestros resultados implican que el crecimiento del tumor de próstata está regulada por let-7c y que la reconstitución de let-7 puede tener efectos beneficiosos en el CP por la disminución de la supervivencia y la proliferación de las células tumorales.
Materiales y Métodos
las líneas celulares y reactivos
LNCaP, C4-2B, las células DU145 PC-346C y se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). LNCaP, C4-2B y las células son PC346C receptor de andrógenos (AR) positivo y responder a la suplementación de andrógenos, mientras que las células DU145 son AR negativo y son insensibles a andrógenos. líneas de células LNCaP y LNCaP-S17-IL6 + se generaron en nuestro laboratorio mediante transfección estable de longitud completa de IL-6 ADNc en las células LNCaP y por el tratamiento crónico de las células LNCaP con 5 ng /IL-6 recombinante ml respectivamente. Ambas líneas celulares exhiben autocrina de señalización de IL-6. Los anticuerpos contra la actina y tubulina se adquirieron de Santa Cruz Biotecnologías (Santa Cruz, CA). anticuerpos Lin28 se obtuvieron de Abcam (San Francisco, CA). SYBR Green Supermix iQ era de Bio-Rad. constructo let-7c basados en lentivirus se obtuvo de Sistema Biosciences y Lin28 ORF y construcciones shRNA se obtuvieron de Abrir Biosystems.
análisis de transferencia Western
Las células se lisaron en tampón de alta salinidad que contiene Hepes 50 mM pH 7,9, NaCl 250 mM, EDTA 1 mM, 1% NP-40, PMSF 1 mM, 1 mM Na vanadato, mM NaF 1 y cóctel inhibidor de la proteasa (Roche) como se describió anteriormente [25]. La proteína total se estimó usando la proteína Coomassie reactivo de ensayo (Pierce, Rockford, IL). Igual cantidad de proteína se cargaron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en PBST (1x PBS + 0,1% Tween-20) y se sondaron con anticuerpos primarios en 1% de BSA. La señal fue detectada por ECL (GE Healthcare) después de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP apropiadas.
La medición de PSA
Los niveles de PSA se midieron en los sobrenadantes del cultivo usando ELISA (Estados Biotech Inc , Mountain View, CA) según las instrucciones del fabricante.
real-Time RT-PCR cuantitativa
p>
Northern Blotting
20 g cada uno de los ARN totales de LNCaP, PC-3, las células DU145, LNCaP y LNCaP-S17-IL6 + se realizaron en 15% en geles de urea-PAGE y transferidos a membranas de nylon. Después de la reticulación UV, las membranas se hibridaron con una sonda que reconoce la secuencia madura de let-7c. U6 snRNA se utilizó como control de carga.
miARN hibridación in situ
La hibridación in situ gratis (ISH) se llevó a cabo para determinar los patrones de expresión de let-7c en humanos microarrays clínica tejido que contiene el CP 160 núcleos cada uno de próstatas benignas y cancerosas sin igual. ISH se realizó utilizando el ácido nucleico bloqueado (LNA) y conjugado con let-7c-sonda específica de Exiqon de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Se realizaron ensayos clonogénicos Ensayos
capacidad clonogénico
dependientes de anclaje como se describe anteriormente [28]. Brevemente, las células LNCaP transfectadas con cualquiera de vector vacío o let-7c se sembraron a densidades bajas (400 células /placa) en placas de cultivo de 10 cm. Las placas se incubaron a 37
oC en medios que contenían FBS al 10% o 10% despojada carbón FBS (CS-FBS) y se dejaron en reposo durante 14 días. Al final del experimento, las células se fijaron con metanol, se tiñeron con violeta cristal y se contaron los números de colonias.
Soft-agar Ensayos de formación de colonias
ensayos de formación de colonia
independiente de anclaje eran realizado usando células LNCaP y C4-2B-S17 transfectadas con los plásmidos indicados. Después de la transfección, las células se colocaron en placas en 0,35% de agarosa que recubre una capa de agar 1,2%. Las células fueron alimentados dos veces por semana con RPMI1640 completo y se incubaron a 37
0C durante 2 semanas. Al final del experimento, las colonias se tiñeron con 0,005% violeta cristal y se contaron.
ensayos de crecimiento de la célula
LNCaP, C4-2B, DU145, las células LNCaP-S17 y LN-IL6 + eran transfectadas con plásmidos que expresan let-7c y el número de células viables se determinaron a 0, 24 y 48 h utilizando un contador de células Coulter.
a) total ARN de LNCaP, PC-3, DU145, LNCaP-S17 y LN -IL6 + células se analizaron mediante qRT-PCR. Los resultados se presentan como cambio veces relativa en comparación con los niveles de expresión en LNCaP. Los puntos de datos representan la media ± SD de muestras por triplicado de dos experimentos independientes. B) 20 g de cada uno de los ARN anteriores también se analizaron mediante transferencia de Northern. U6 snRNA se utilizó como control de carga. C) QRT-PCR que muestra la disminución de la expresión let-7c en las células LNCaP que expresan Lin28 comparación con las células LNCaP transfectadas con el vector vacío (Con). blot occidental inserción muestra la expresión de Lin28. D) QRT-PCR que muestra el aumento de la expresión let-7c en las células transfectadas con shRNA C4-2B contra Lin28 comparación con las células transfectadas con C4-2B de control GFP shRNA. blot inserción occidental muestra regulación a la baja de Lin28. Los puntos de datos representan la media ± SD de muestras por triplicado de dos experimentos independientes. Las barras de error indican ± SD (*
p Hotel & lt; 0,05). E) Transferencia Western que muestra los niveles de expresión de Lin28 en células de CaP. Actina se utilizó como control de carga.
La apoptosis mediante ensayos ELISA de detección de muerte celular de
fragmentación del ADN en células LNCaP, DU145, LNCaP-S17 y las células LN-IL6 + transfectadas con plásmidos como se indica en las figuras se evaluó mediante la detección de muerte celular ELISA kit (Roche, Indianapolis, IN) según las instrucciones del fabricante.
Generación de líneas celulares estables
las líneas celulares estables de LNCaP y C4-2B expresando let-7c fueron generados por transfección de plásmidos que contienen los ADNc y selección de clones después de la aplicación de la presión selectiva con los antibióticos apropiados.
a) fueron medidos mediante qRT-PCR en ARN totales niveles relativos de expresión de let-7c extraído de 10 muestras benignas y de próstata humano tumor emparejados. B) Que-7c niveles se midieron utilizando
In situ
hibridación en las TMA contiene 160 núcleos cada una de las biopsias prostáticas benignas y cancerosas sin igual. Se muestran imágenes representativas para los núcleos benignas y cancerosas. La expresión de let-7c fue mayor en próstatas benignas en comparación con próstatas cancerosas. C) los niveles de expresión relativa de Lin28 en el 10 muestras pareadas de próstata humano benignos y tumores. Los niveles de expresión de Lin28 estaban inversamente correlacionados con los de let-7c. Las barras de error indican ± SD (*
p Hotel & lt; 0,05).
LNCaP (A), C4-2B (B), DU145 (C), LN-IL6 + (D células) y LNCaP-S17 (e) fueron transfectadas con let-7c o vector vacío (con) y los números de células se determinaron después de 24 y 48 h. El crecimiento de células de CaP fue suprimida por let-7c. El recuadro muestra los niveles de expresión del plásmido let-7c. F) La muerte celular se analizó en LNCaP, DU145, LNCaP-S17 y LN-IL6 + células transfectadas con let-7c o vector vacío (Con). Let-7c la muerte celular inducida por apoptosis de las células del cáncer de próstata. células G) LNCaP transfectadas con los oligonucleótidos antisentido contra let-7c o oligos revueltos (CON) se cultivaron en FBS y CS-FBS y se determinó el número de células. El recuadro muestra la regulación a la baja de la expresión de let-7c por oligonucleótidos antisentido. células LNCaP con expresión downregulated de let-7c mostraron un crecimiento más rápido en el CS-FBS en comparación con los controles. Los puntos de datos representan la media ± SD de muestras por triplicado de dos experimentos independientes. Las barras de error indican ± SD (*
p Hotel & lt; 0,05).
Animales
6-8 semanas de edad ratones desnudos masculinos se mantuvieron en el Animalario en el Centro Médico de la Universidad de California en Davis. Todos los procedimientos experimentales utilizando animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales institucional de la Universidad de California en Davis. 1-2 × 10
s.c. 6 células /flanco se inyectaron en ambos flancos y los tumores se dejaron crecer. Una vez que los tumores alcanzaron 0,5 cm
3, 1x10
7 IFU (unidades infecciosas) de los lentivirus que contenían el vector vacío con GFP o precursor let-7c se inyectaron por vía intratumoral. Al final de los experimentos, los ratones se sacrificaron y se extirparon los tumores. Se recogieron los sueros para la medición de PSA.
CaP se prepararon muestras de seres humanos
apareadas tejidos tumorales benignas de la próstata y como se describe anteriormente [29]. Las muestras quirúrgicas utilizadas en este estudio fueron sometidos a prostatectomía radical (uno de la cirugía robótica) recogidos en la Universidad Johns Hopkins, de 2002 a 2007. Las muestras fueron seleccionadas del banco de tumores de próstata congelados si los bloques congelados pareadas enriquecidas para las áreas normales y tumorales histológicamente estaban disponibles. Los bloques congelados se cortaron manualmente para enriquecer aún más la histología de interés. Criosecciones (7 micras) se prepararon a partir de cada bloque antes de la extracción de ARN. El contenido de tumor en las muestras de tumor era mayor que 80%, mientras que las muestras normales tenían al menos 60% de contenido de epitelio y sin evidencia de tumor presente. La primera y última secciones para cada bloque fueron H & amp; E manchadas y utilizados para el cálculo% epitelio. El uso de piezas quirúrgicas sin identificación para el análisis molecular fue aprobado por el IRB.
Análisis estadísticos
Los datos se muestran como media ± SD. el grupo de comparación múltiple se realizó mediante ANOVA de una vía seguida por el procedimiento de Scheffe de comparación de medias.
P
. & Lt; 0,05 fue considerado significativo
Resultados
Let-7c se expresa en células de CaP
Nuestros estudios previos utilizando microarrays miARN mostraron que let -7c fue uno de los miRNAs con mayor frecuencia moduladas en células de CaP (datos no publicados). Para determinar los niveles relativos de expresión de let-7c en células de CaP, aislamos ARN totales de LNCaP (dependiente de andrógenos, AR-positivo), PC-3, (, AR-negativos resistentes a la castración) células DU145, así como LNCaP -S17 células que expresan IL-6 [30] y las células LN-IL6 + tratados crónicamente con IL-6 [31]. Los ADNc se analizaron por RT-PCR cuantitativa usando cebadores de amplificación de la forma madura de let-7c (Exiqon) específicamente. Nuestros resultados mostraron que let-7c se expresa en altos niveles en células LNCaP en comparación con los PC-3 y DU145 células refractarios a las hormonas (Fig. 1A). Informes anteriores demostraron que la IL-6 y dejar-7 exhiben regulación recíproca de expresión. células LNCaP-IL6 + y LNCaP-S17 (autocrina de IL-6 señalización) mostraron una reducción en los niveles de let-7c, en consonancia con el informe de que la IL-6 reduce let-7 expresión en células de CaP y que let-7 regula la IL-6 expresión [ ,,,0],18]. Estos resultados también fueron confirmados por transferencia Northern usando una sonda hacia la secuencia madura let-7c (fig. 1B), lo que sugiere que let-7c niveles se reducen en células de CaP más agresivos y resistentes a la castración.
Informes recientes mostró que la expresión de let-7 de la familia de miRNAs es regulada por Lin28, un regulador maestro de procesamiento miARN [18], [20]. Consistente con el hallazgo, se encontró que la sobreexpresión de Lin28 condujo a una reducción en los niveles de let-7c en células LNCaP (Fig. 1C), mientras que la regulación por disminución de Lin28 usando Lin28 shRNA condujo a un aumento en los niveles de let-7c (Fig. 1D) en las células que expresan C4-2B endógeno Lin28 (Fig. 1E). Regulación a la baja o sobreexpresión de Lin28 fue confirmada por Western Blot (recuadro figura 1C & amp;. D). Estos resultados muestran que Lin28 juega un papel crítico en la regulación de la expresión let-7c en células de CaP.
Let-7c expresión está regulada negativamente en el CaP humano
Para determinar si los niveles de let-7c la expresión se downregulated en el CaP clínico, se analizaron los ARN de 10 muestras apareadas con CaP humanos benignos y tumorales mediante RT-PCR cuantitativa. ARN fueron aisladas de tejidos humanos, a transcripción inversa y se somete a QRT-PCR utilizando cebadores let-7c LNA conjugado (Exiqon). Los niveles de let-7c fueron significativamente disminuidos en 8/10 tumores en comparación con sus tejidos emparejados benignas de la próstata (Fig. 2A). También se analizaron dos microarrays de tejidos que contienen biopsias prostáticas benignas y cancerosas, respectivamente, por
In situ
hibridación usando la sonda let-7c-específica madura LNA conjugado (Exiqon). Las imágenes fueron analizados utilizando un microscopio Olympus IX81 y software de los dispositivos DP. Nuestros resultados mostraron que let-7c fue altamente expresado en benigna CaP, mientras que su expresión se downregulated en la próstata cancerosa (Fig. 2B). En conjunto, estos resultados sugieren que la pérdida de expresión de let-7c puede estar asociada con la tumorigénesis de próstata
.
Desde Lin28 es un regulador clave de la expresión let-7c, se analizó la expresión Lin28 en el 10 emparejados muestras benignas de la próstata y tumores por QRT-PCR utilizando cebadores que amplifican específicamente Lin28 ARNm. Se encontraron niveles de expresión de Lin28 ser significativamente elevados en 9/10 pares de muestras coincidentes benignos y tumores de próstata (Fig. 2C). La expresión de Lin28 fue inversamente correlacionada con la expresión de let-7c con un coeficiente de correlación de -0,4, lo que sugiere que la expresión let-7c está regulada principalmente por Lin28 en el CaP humano.
Let-7c disminuye el crecimiento de las células de CaP en Vitro
Para determinar si let-7c afecta el crecimiento de las células de CaP, LNCaP, C4-2B, DU145, LNCaP-S17 y LN-IL6 + células fueron transfectadas con plásmidos que codifican let-7c o vector vacío y celular números se contaron después de 24 y 48 h. El número de células de todas las líneas celulares que sobreexpresan CaP let-7c se redujeron en ~ 40% a las 48 h (Fig. 3A-E). El recuadro muestra los niveles de expresión del plásmido let-7c en estas células. Para determinar si la disminución observada en el crecimiento celular se debe a la muerte celular apoptótica, la fragmentación del ADN se analizó por muerte celular de ELISA de detección. Como se muestra en la Fig. 3F, la apoptosis en células que sobreexpresan let-7c se mejoró en comparación con los controles, lo que sugiere que la inhibición del crecimiento celular inducida por let-7c es en parte debido al aumento de la muerte celular apoptótica.
clonogénico (A) y agar blando formadoras de colonias (B) las capacidades de las células LNCaP-S17 y C4-2B transfectadas con let-7c o vector vacío (con) se ensayaron. Let-7c inhibió el crecimiento celular y la supervivencia en condiciones dependientes de anclaje y -independiente. C) Clonigénicas ensayo de paneles superior e inferior representan los tamaños de colonias de células C4-2B y LNCaP-S17 que expresan de control (vector vacío) o dejar-7c, respectivamente. D) ensayo de agar blando-paneles superior e inferior representan los tamaños de colonias de células LNCaP y C4-2B-S17 que expresan de control (vector vacío) o dejar-7c, respectivamente. E) El número de colonias formadas en el ensayo clonogénico de células que expresan establemente C4-2B let-7c. Let-7c disminuyó el número de colonias formadas por las células de CaP. Los puntos de datos representan la media ± SD de muestras por triplicado de dos experimentos independientes. Las barras de error indican ± SD (*
p Hotel & lt; 0,05).
Además, hemos probado si la regulación a la baja de let-7c mejoraría la capacidad de las células de CaP andrógeno-sensibles a crecer en condiciones de andrógenos-privada. Estamos transfectadas oligonucleótidos antisentido contra let-7c o revueltos oligos de control en las células LNCaP suplementado con FBS o bien FBS tratado con carbón vegetal (CS-FBS) y se controló el crecimiento celular. Los resultados demostraron que la regulación por disminución de let-7c por anti-sentido promovió el crecimiento de células LNCaP dependiente de andrógenos en condiciones de privación de andrógenos (Fig. 3G). Regulación a la baja de let-7c por los oligonucleótidos antisentido se confirmó mediante qRT-PCR (Fig. 3G, recuadro). Estos hallazgos sugieren que el crecimiento resistente a la castración del CP se puede caracterizar por la regulación negativa de la expresión let-7c.
C4-2B (A), PC346C (B) y las células DU145 (C) se inyectaron en ambos flancos de ratones desnudos y los tumores recibieron una única inyección intratumoral de los lentivirus que expresan bien GFP (control) o let-7c. El crecimiento tumoral se monitorizó dos veces por semana durante 3 semanas. Los puntos de datos representan la media ± SD de volumen del tumor (mm
3) de todos los ratones en los puntos de tiempo indicados. D) La secreción de PSA por C4-2B y xenoinjertos PC346C se midió en sueros de ratón por ELISA. La reconstitución de let-7c en los tumores secreción de PSA reducido en los xenoinjertos. Al final de los experimentos, los tejidos tumorales fueron extirpados, ARN totales preparados y sometidos a QRT-PCR para evaluar los niveles de ARNm de let-7c (E) y Lin28 (F). Las barras de error indican ± SD (*
p Hotel & lt; 0,05).
También se analizó la capacidad clonogénico de células de CaP expresar let-7c en ambas condiciones dependientes de anclaje y anclaje independiente . células LNCaP-S17 y C4-2B se transfectaron con let-7c o ensayos vectoriales y de formación de colonias se realizaron vacías. Tanto las células (Fig. 4A) y la capacidad de formación de colonias en agar blando (Fig. 4B) de LNCaP-S17 y C4-2B clonogénicas fueron suprimidos por la sobreexpresión de let-7c. El número de colonias formadas sobre sustratos por las células LNCaP-S17 se redujo de 142 ± 15 a 46 ± 10 y el número de colonias formadas por células C4-2B se redujo de 122 ± 10 a 34 ± 7 (Fig. 4A). Del mismo modo, el número de colonias formadas en agar blando por células LNCaP-S17 se redujo de 82 ± 4 a 15 ± 2 y el número de colonias formadas por células C4-2B se redujo de 61 ± 5 a 21 ± 5 (Fig. 4B ) por la sobreexpresión de let-7c. Además, el tamaño de las colonias formadas por células de control transfectadas fue mayor en comparación con las colonias formadas por let-7c-transfectadas las células (Fig 4C & amp;. D). Estos resultados sugieren que el let-7c pueden inhibir el crecimiento de células en el CP dependiente de anclaje, así como las condiciones -independiente. Estos resultados también fueron confirmados con el ensayo clonogénico en células que expresan establemente C4-2B let-7c (Fig. 4E).
Let-7c Inhibe el crecimiento tumoral de xenoinjertos de células de CaP humano
Hemos generado lentivirus codifica precursor de let-7c BPA de etiquetado utilizando el sistema de expresión lentiVector (Sistema Biosciences). Para determinar si let-7c presenta efectos antiproliferativos sobre xenoinjertos de CaP
in vivo
, inyectamos 2x10
6 C4-2B o PC346C (ambas líneas celulares son AR-positivo) células s.c. en ambos flancos de ratones desnudos masculinos y el desarrollo del tumor monitorizado. Una vez que los tumores alcanzaron el tamaño de 0,5 cm
3, los ratones fueron asignados al azar en dos grupos. Los ratones experimentales recibieron una única inyección intratumoral de lentivirally codificada let-7c, mientras que los ratones de control recibieron lentivirus que expresan GFP. El crecimiento tumoral se monitorizó durante 3 semanas, con las medidas del tumor dos veces por semana. Al final de 3 semanas, los tumores fueron extirpados, ARNs preparados y QRT-PCR llevan a cabo para evaluar los niveles de let-7c en los xenoinjertos. Los resultados mostraron que el crecimiento del tumor de C4-2B (Fig. 5A) y xenoinjertos PC346C (Fig. 5B) se inhibe significativamente en los ratones inyectados con dejar que contiene 7C-lentivirus en comparación con los ratones inyectados con los lentivirus de control. Además, también hemos probado si let-7c pueden suprimir el crecimiento de tumores de xenoinjertos AR-negativos. Hemos inyectado 1x10
6 DU145 células /flanquear por vía subcutánea en ratones desnudos masculinos y realizado experimentos similares con la mitad de los ratones que recibieron una sola inyección intratumoral de lentivirus que codifican let-7c y los otros lentivirus recibir la mitad que codifican el vector vacío. Los resultados mostraron que let-7c tuvo éxito en suprimir el crecimiento de tumores de xenoinjertos de DU145 similares a C4-2B o xenoinjertos PC346C (Fig. 5C). Los niveles de PSA, un gen diana clásico de la AR, secretada por los xenoinjertos AR-positivos se midieron en el suero de ratón utilizando un kit ELISA PSA humano específico y se normalizaron a pesos de los tumores. Los resultados mostraron que la inyección de lentivirus let-7c-expresión reduce la secreción de PSA por los xenoinjertos de tumores de C4-2B y PC346C en comparación con los lentivirus de control (Fig. 5D). QRT-PCR mostró que let-7c niveles se han mejorado en los tumores inyectados con lentivirus let-7c-codificación, mientras que los niveles de Lin28 se redujeron (Figura 5E & amp;. F). Estos hallazgos sugieren que la sobreexpresión de let-7c suprime el crecimiento de tumores de próstata, y que la reconstitución de los niveles de let-7c podrá presentar una estrategia terapéutica atractiva contra el CaP humano.
Discusión
En este estudio, se encontrado que la expresión let-7c está regulado por disminución en células de CaP resistentes a la castración y muestras clínicas. La transfección de lentiviral codificada let-7c inhibió el crecimiento y clonogenicidad de células de CaP al tiempo que mejora la muerte celular apoptótica. Por el contrario, la regulación por disminución de let-7c por oligonucleótidos anti-sentido confiere una ventaja de supervivencia en células de CaP en andrógenos repleta, así como entornos de andrógenos empobrecido. La inyección intratumoral de lentivirally codificado let-7c inhibió el crecimiento del tumor de xenoinjerto PCa, lo que demuestra que las funciones de let-7c como un supresor de tumor que inhibe el crecimiento del tumor de próstata. Estos resultados sugieren que los genes miARN let-7c juega un papel importante en la proliferación celular CaP y puede ser explotada para aplicaciones terapéuticas.
Los mecanismos de supresión del crecimiento del tumor de próstata por let-7c pueden incluir la regulación directa o indirecta de la expresión niveles de oncogenes tales como Myc y Lin28. En un informe reciente, se demostró que let-7c dirige la expresión de la AR a través de la orientación de la expresión de Myc [32]. La AR es un factor de supervivencia clave para las células de tumor de próstata y la reducción de su expresión se ha demostrado para suprimir el crecimiento de tumores de próstata [33]. Como confirmación de estos resultados, la expresión de PSA, uno de los clásicos genes diana de la AR, se encontró que ser suprimida por let-7c en xenoinjertos de C4-2B y células PC346C en este estudio.
Es bien documentado que Lin28 juega un papel importante en la regulación de la expresión let-7c [18], [21]. Esto es consistente con nuestros estudios que muestran que Lin28 suprime la expresión let-7c en células de CaP. La sobreexpresión de Lin28 inhibe la expresión let-7c en las células LNCaP, mientras que desmontables de expresión Lin28 aumentó let-7c en las células C4-2B. Además, hemos demostrado que la sobreexpresión de let-7c reduce los niveles de expresión Lin28 en los tumores de modelos de xenoinjertos PCA (Fig. 5F), lo que indica que existe un bucle de retroalimentación negativa entre Lin28 y let-7c.
varios informes han establecido la importancia del papel de let-7, que muestra que los miembros de la familia let-7 están regulados a la baja en los cánceres de pulmón y que esta regulación a la baja se correlaciona con la supervivencia de los pobres [8]. Un papel supresor de tumores se ha atribuido a la familia let-7 de miRNAs y parece estar indiscutible excepto en casos raros, tales como let-7a, que se ha informado para orientar la caspasa-3 en los cánceres humanos [34], suprimiendo así la susceptibilidad de las células cancerosas a quimioterapéutico inducida por la muerte celular. En el mesotelioma maligno, se encontró let-7b * ser altamente expresado [35] y la regulación al alza de let-7b y let-7i se asoció con la transformación de alto grado en el linfoma [36]. Estos datos contradictorios sobre la desregulación de let-7 en diversos cánceres humanos muestran que miembros de la familia let-7 individuales pueden tener actividades distintas y varían en diferentes células y no simplemente exhibir funciones redundantes.
Un estudio anterior de Dong et Alabama. [37] informó de que let-7a suprime el crecimiento del tumor de próstata mediante la orientación y E2F2 CCND2. Nuestros estudios sugieren que let-7c suprime el crecimiento de tumores de próstata por varias vías incluyendo la regulación de la IL-6, Myc, Lin28 y la AR [32]. Además, la reconstitución directa de let-7c mediante la inyección de lentivirally codificada 7c dejar-en xenoinjertos de tumores establecidos marca un paso importante en la dirección de las estrategias terapéuticas potenciales usando let-7c. A pesar de que miembros de la familia let-7 pueden presentar algunas funciones redundantes, los componentes individuales pueden ser objeto de una diferencia y la regulación específica de tejido en diferentes tipos de células.