Extracto
Fondo
microARNs (miRNAs) han sido implicados en la iniciación y progresión del cáncer a través de su capacidad para afectar a la expresión de genes y proteínas que regulan la proliferación celular y /o muerte celular. Recientemente se encontró la transcripción de los tres miembros de la familia miARN miR-34 para ser regulada directamente por p53. Entre las proteínas diana regulados por miR-34 son proteínas de la vía Notch y Bcl-2, lo que sugiere la posibilidad de un papel de miR-34 en el mantenimiento y la supervivencia de las células madre del cáncer.
Metodología /Principales conclusiones
Hemos examinado los papeles de miR-34 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano p53 mutante MiaPaca2 y BxPC3, y el vínculo potencial de las células madre del cáncer de páncreas. Restauración de miR-34 expresión en las células del cáncer pancreático ya sea por transfección de miR-34 o imita la infección con lentiviral miR-34-MIF downregulated Bcl-2 y Notch 1/2. miR-34 restauración inhibió significativamente el crecimiento clonogénico celular y la invasión, la apoptosis inducida y G1 y G2 /M detención en el ciclo celular, y sensibiliza las células a la quimioterapia y la radiación. Identificamos que las células CD44 + /CD133 + MiaPaca2 están enriquecidas con células progenitoras con altos niveles de Notch /Bcl-2 y la pérdida de miR-34 células iniciadoras del tumor a la droga y tumorsphere o madre de cáncer /. Más significativamente, el miR-34 restauración dio lugar a una reducción del 87% de la población de células iniciadoras del tumor, acompañado por una inhibición significativa del crecimiento tumorsphere
in vitro Opiniones y formación de tumores
in vivo
.
Conclusiones /Importancia
Nuestros resultados demuestran que miR-34 puede restaurar, al menos en parte, el tumor en función de la p53 en las células de cáncer de páncreas humanos deficientes en p53 supresión. Nuestros datos apoyan la idea de que el miR-34 puede estar implicado en cáncer de células madre auto-renovación de páncreas, posiblemente a través de la modulación directa de los objetivos de abajo Bcl-2 y Notch, lo que implica que el miR-34 puede jugar un papel importante en las células madre de cáncer de páncreas auto-renovación y /o la determinación del destino celular. Restauración de miR-34 puede contener una promesa significativa como una terapia molecular novedoso para el cáncer de páncreas humano con la pérdida de p53-miR34, potencialmente a través de la inhibición de las células madre del cáncer de páncreas
Visto:. Ji Q, X Hao, Zhang M, Tang W, Yang H, Li L, et al. (2009) microARN miR-34 inhibe el cáncer de páncreas humano Células Tumorales-iniciador. PLoS ONE 4 (8): e6816. doi: 10.1371 /journal.pone.0006816
Editor: Eric J. Bernhard, Instituto Nacional del Cáncer, Estados Unidos de América
Recibido: 22 Enero, 2009; Aceptado: 5 de Agosto del 2009; Publicado: 28 Agosto 2009
Derechos de Autor © 2009 Ji et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan
Financiación:. Este estudio fue apoyado en parte por subvenciones NIH CA121830-01, CA128220-01 y CA134655-01A1 (L. Xu.), y por el NIH a través de la Universidad de subvención de apoyo del Centro de cáncer de Michigan (P30 CA46592). JTD es un estudiante de la Universidad de Michigan Pregrado Programa de Oportunidades de Investigación (UROP). Los donantes no tuvo ningún papel en el diseño y realización del estudio, en la recogida de datos, análisis e interpretación, y la decisión de publicar, revisión, aprobación, o la preparación del manuscrito
Conflicto de intereses:. Los autores no tienen declaran que no existen conflictos de intereses.
Introducción
Los microARN (miRNA) son una clase conservada de 20-22 nt pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión génica y proteica mediante la unión a ARNm que lleva a la degradación del ARNm o la inhibición de la traducción [1], [2]. miRNAs probable que regulan diversos procesos biológicos, incluyendo la diferenciación de tejidos y el mantenimiento, y tienen funciones que contribuyen en los procesos de enfermedad variados, incluyendo el cáncer [2], [3], [4]. Nuevas evidencias sugieren que los miRNAs también juegan un papel esencial en las células madre de auto-renovación y diferenciación, regulando negativamente la expresión de ciertos genes clave implicados en la auto-renovación y la supervivencia, la llamada "genes de células madre" [1], [2] , [4], [5]. Recientemente, se han encontrado para ser regulada directamente por p53 y la actividad funcional de miR-34 los tres miembros de la familia miR-34 indican un posible papel como un supresor de tumores [6], [7], [8], [9] , [10], [11], [12]. Hemos informado anteriormente de que la proteína Bcl-2 está regulada directamente por el miR-34 [10]. El informe de He y col. indicó que la expresión ectópica de miR-34 induce la detención del ciclo celular en ambas líneas celulares primarias y derivados del tumor, lo que es consistente con la capacidad de miR-34 para regular a la baja un programa de genes que promueven la progresión del ciclo celular [11]. Recientemente hemos demostrado que la expresión de miR-34 se reduce dramáticamente en las células de cáncer gástrico p53 mutante y que la restauración de la expresión de miR-34 inhibió el crecimiento de células de cáncer [6]. La pérdida de miR-34 se ha relacionado con la quimiorresistencia del cáncer [13]. miR-34a se ha informado a participar en la apoptosis mediada por p53 en el cáncer de colon y cáncer de páncreas [8], [9]. Chang et al. informado de que 15 líneas celulares de cáncer pancreático tienen al menos una reducción de 2 veces en la expresión de miR-34a en comparación con la expresión en líneas celulares normales pancreáticos ductales epiteliales [8]. Tomados en conjunto, los estudios publicados sugieren miR-34 miembros de la familia pueden tener la función supresora de tumores p53 aguas abajo de. Además, ya que más del 50% de los cánceres humanos primarios tienen mutaciones inactivación de la función de p53, los resultados proporcionan impulso a explorar la restauración funcional de miR-34 como un enfoque novedoso para inhibir cánceres con p53 de pérdida de función.
Otro posible papel de miR-34 en la iniciación y progresión del cáncer puede ser un enlace a las células iniciadoras de tumores o células madre del cáncer (CSC). Se ha informado de que el miR-34 Notch objetivos, c-Met y Bcl-2, los genes implicados en la auto-renovación y supervivencia de las células madre del cáncer [10], [11], [14]. En la actualidad, los vínculos entre el p53, el objetivo abajo de miR-34 y las células madre del cáncer de páncreas presuntivos son desconocidos. En el presente estudio, hemos examinado los efectos de la restauración funcional de miR-34 por miR-34 imita y lentiviral miR-34a en las células MiaPaca2 de cáncer de páncreas p53 mutante humanos, así como la posible relación con el cáncer de páncreas auto de células madre -renovación. Delinear el papel de miR-34 en la regulación del crecimiento celular y la progresión del tumor y su potencial de enlace a las células iniciadoras de tumores o células madre de cáncer puede proporcionar una base para explorar su potencial como una nueva estrategia de tratamiento.
Materiales Métodos y
cultivo de células y reactivos
líneas celulares de cáncer pancreático humano y la línea celular de fibroblastos de pulmón humano normal WI-38 fueron adquiridos de la American Type Culture Collection y se cultivaron en DMEM (Hyclone, Logan, UT), suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS; Hyclone, Logan, UT). mi
RIDIAN
miARN miR34a, b, c imita y control negativo miARN mímica (NC gráfico), mi
RIDIAN
miR-34 y los inhibidores de controles negativos se obtuvieron de Dharmacon (Chicago, IL) [ ,,,0],6]. Bcl-2 3'UTR plásmido indicador de luciferasa o su mutante se ha informado anteriormente [10]. cebadores y anticuerpos para Western blot QRT-PCR se describen en nuestra reciente publicación [6].
La transfección de miR-34 imita
células
MIAPaCa2 se transfectaron 24 horas después de haber sido sembradas en 6 pocillos platos. imita miARN (100 pmol) en 200 l de, libres de antibióticos libre de suero, el medio se mezcló con 5 l de reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) disueltos en 200 l del mismo medio y se dejaron reposar en la sala temperatura durante 20 min. Las soluciones de transfección 400 l resultantes se añadieron a cada pocillo que contiene 1,6 ml de medio. Seis horas más tarde, los cultivos fueron reemplazados con 2 ml de medio fresco suplementado con 10% de FBS y antibióticos. Por Western blot, las células se recogieron después de un 48 horas más.
Lentiviral miR-34a infección
El virus de la inmunodeficiencia felina (VIF) sistema lentiviral que expresa el miR-34a (miR-34a-MIF) o el control de vectores (MIF), así como un sistema de empaquetamiento lentiviral, se compraron de sistema Biosciences (SBI, Mountain View, CA). células MiaPaca2 y BxPC3 se infectaron con el sistema lentiviral VIF expresar miR-34a (miR-34a-MIF) o el control de vectores (MIF), y se seleccionaron las células infectadas a través de la resistencia a antibióticos (zeocina 50 mg /ml, Invitrogen), ya que recientemente se ha descrito [6].
miR-34 Bcl-2-3'UTR reportero de ensayo
MiaPaca2 células fueron transfectadas en placas de 6 pocillos con 2 g de Bcl-2 3'UTR luciferasa plásmido informador o su mutante [6], [10], y 2 g del plásmido de control de β-galactosidasa, por pocillo, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Las células fueron también co-transfectaron con 100 pmol de cada uno de miR-34 imitan o NC imitar, como se indica, utilizando Lipofectamine 2000. Los ensayos de luciferasa se llevaron a cabo 24 horas después de la transfección usando Bright-Glo Luciferase Assay System (Promega). La actividad de luciferasa se normalizó con respecto a la actividad de ß-galactosidasa detectada por el sistema de ensayo β-galactosidasa (Promega). En cada caso, mutante Bcl-2 3'UTR indica la introducción de alteraciones en los sitios complementarios de semillas de Bcl-2 3'UTR [10].
La formación de colonias y ensayo clonogénico
Para ensayo de formación de colonias, las células fueron transfectadas con el miR-34 imita o NC imitan durante 24 horas, y luego sembradas en una placa de 6 pocillos por triplicado. 0,2 ml de FBS se añadió por pocillo en el día 5. Después de 9-10 días de incubación, las placas se lavaron suavemente con PBS y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta. Las colonias con más de 50 células fueron contadas manualmente. eficiencia de plaqueo se calculó dividiendo el número de colonias formadas en el grupo tratado por que en el control. Para el ensayo de supervivencia clonogénico, las células se transfectaron con miR-34 imita o NC imitan durante 24 horas, y luego se siembran en placas de 6 pocillos por triplicado a la densidad celular deseada (200~10,000 células /pocillo), seguido por la radiación de rayos X . Las curvas de supervivencia celular se representaron usando un modelo lineal-cuadrática y la relación mejora la radiación (ER) se calculó como hemos descrito anteriormente [15], [16], [17].
cuantitativa en tiempo real RT- PCR (QRT-PCR)
QRT-PCR se realizó para determinar los niveles de expresión de los posibles genes miR-34 diana [6]. Veinticuatro horas después de miR-34 transfección sinóptico de las células MiaPaca2 con miR-34 imita (100 pmol por pocillo en placas de 6 pocillos), la expresión de los posibles genes diana se midió por QRT-PCR con SYBR Sistema Green PCR (TaqMan) . Brevemente, el ARN total se extrajo de las células transfectadas utilizando Trizol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La transcripción inversa se realizó usando un kit de transcripción inversa TaqMan (Applied Biosystems). Para QRT-PCR, se aplicó 1 l de cebadores de genes con SYBR Green (Applied Biosystems) en 20 l de volumen de reacción. Los cebadores se diseñaron como: Bcl-2, adelante, 5'-CAT GCT GGG GCC GTA CAG-3 ', inversa, 5'-GAA CCG GCA GCA CCT CAC-3'; HMGA2, adelante, 5'-TTT GTA ATC CCT TCA TCC CAG-3 ', inversa, 5'-TTT CTC CAC CGC CCA C-3'; Notch1, adelante, 5'-ATC AGG CAG CAA ACG GAG-3 ', inversa, 5'-ACG ATG CAC ACA TCT AAC CC-3'; Notch2, adelante, 5'-GGA CCC TGT CAT ACC CTC TT-3 ', inversa, 5'-CAT TAC TCG TCG TTC GTT TT-3'; Notch3, adelante, 5'-TGA TCG TCG CGG TAG TAA TG-3 ', inversa, 5'-CGC CAA TCC CAG GTA GTC A-3'; Notch4, adelante, 5'-TGC GAG GAA GAT ACG GAG TG-3 ', inversa, 5'-CGG GAT CGG AAT GTT GG-3'; β-actina, adelante, 5'-ATG CAG AAG GAG ATC ACT GC-3 ', inversa, 5'-TCA TCC TAG TAG CCG AAG CA-3'. Todas las reacciones con TaqMan PCR Universal Master Mix (Applied Biosystems) se realizaron en el Mastercycler realplex 2 (Eppendorf, Westbury, NY). los niveles de mRNA del gen diana se normalizaron a la actina mRNA de acuerdo con la siguiente fórmula: [2- (C
T
target - C
T
Actina)] x 100%, donde C
T es el ciclo umbral. La expresión relativa se calculó dividiendo la expresión del gen diana normalizada de la muestra tratada con la del control no tratado, con el valor de NC imitan establecer como 1 unidad arbitraria. Para la expresión de genes diana en las células clasificadas, los datos se normalizaron a la de actina (actina establecer = 1000 unidad arbitraria).
caspasa-3 de activación del ensayo
La activación de caspasas en las células transfectadas MiaPaca2 se determinó siguiendo las instrucciones de un kit de ensayo de activación de la caspasa-3 (BioVision, Mountain View, CA). Veinticuatro horas después de la transfección, las células se lisaron y los extractos celulares totales (20 g) se incubaron con 25 M sustrato fluorogénico DEVD-AFC en un tampón de reacción (que contiene DTT 5 mM) a 37 ° C durante 2 hr. liberación proteolítica de AFC se controló a? ex = 405 nm y λem = 500 nm usando un lector de microplacas de fluorescencia (BMG LABTECH, Durham, NC). Relativa activación de la caspasa-3 se calculó mediante la normalización de la señal de fluorescencia en cada muestra tratada con el de NC de control imitan o MIF establecido como 100 unidad arbitraria [16].
citotoxicidad de la célula de ensayo
células
MiaPaca2 fueron transfectadas con miR-34 imitan o NC imitar por 24 hr, se sembraron en placas de 96 pocillos (5.000 células /pocillo), y se trata con agentes quimioterapéuticos diluidas en serie, por triplicado. Después de 96 h de incubación, se añadió 20 l /pocillo de reactivo CCK-8 y se incubó a 37 ° C durante 1-3 horas. La densidad óptica se midió a 450 nm y 650 nm usando un lector de microplacas (BMG LABTECH, Durham, NC). IC
50, la concentración de fármaco que inhibe el crecimiento celular al 50% se calculó mediante GraphPad Prism 5.0 (San Diego, CA) como se describió anteriormente [18].
Análisis
ciclo celular y la apoptosis
Para el ciclo celular y el análisis de la apoptosis por citometría de flujo, las células MIAPaCa2 se transfectaron con el miR-34 imita o NC imitan en placas de 6 pocillos, se trataron con tripsina 24 horas más tarde y se lava con solución salina tamponada con fosfato, y se fija en el 70% de etanol en hielo . Después de la centrifugación, las células se tiñeron con 50 mg /ml de yoduro de propidio y 0,1 mg /ml de RNasa A, y se analizaron por citometría de flujo usando un FACStar Plus ™. Cada histograma se construyó con los datos de al menos 5.000 eventos. Los datos se analizaron para calcular el porcentaje de población de células en cada fase utilizando el software CellQuest, así como el% de células en sub-G1 (Becton Dickinson) [18].
CD44 y CD133 tinción y clasificación de células
células
MIAPaCa2 se incubaron con conjugado con PE CD133 1 anticuerpo anti-humano /CD44 y el anticuerpo anti-humano conjugado con APC (Miltenyi Biotec, Aubum, CA, EE.UU.) en PBS que contenía FBS al 2%. Isotipo de inmunoglobulina de ratón sirvió como control. Por citometría de flujo, las muestras fueron analizadas utilizando un citómetro de flujo FACScan y software CellQuest (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.). Para la clasificación celular por citometría de flujo, se analizaron muestras y ordenados en un BD FACSVantage SE (BD Biosciences). Alícuotas de CD133
+ y CD133
- se evaluaron células clasificadas para la pureza con una máquina y CellQuest software FACSCalibur (BD Biosciences), utilizando conjugado con PE 2 anticuerpo anti-humano CD133 /(Miltenyi Biotec) [19].
cultivo Tumorsphere
Las células MiaPaca2 según se suspendieron en cultivo libre de suero DMEM medio que contiene 1% de suplemento N2, 2% de suplemento B27, 1% antibotic-antimicótico (Invitrogen), 20 ng /ml FGF-2 humano (Sigma), y 100 ng /ml de EGF (Invitrogen), y se sembraron en placas de 24 pocillos ultra-bajas de fijación (Corning) 2.000 células por pocillo. 7-10 días más tarde, se analizaron las placas para tumorsphere formación y se cuantificaron utilizando un microscopio invertido (Olympus) a 100X, 200X, y 400 × aumentos. Para la posterior cuantificación del número de células por tumorsphere, tumorspheres se recogieron con un tamiz de 40 micras (BD Biosciences, San Jose, CA) y se disociaron con tripsina para hacer una suspensión de células individuales. Las células viables se contaron usando exclusión de azul de tripano.
Modelo animal vivo y estudio de la formación de tumores en
De cinco a seis semanas de edad Hembra atímicos NCR-nu /nu ratones desnudos fueron adquiridos de NCI. MiaPaca2 células fueron transfectadas con mímica miR-34a o NC imitan durante 24 horas. Se recogieron las células y se inocularon en ratones desnudos por vía subcutánea (s.c.) en ambos flancos, después de la preparación del alcohol de la piel, utilizando una aguja de calibre 22 estéril con 0,2 ml de suspensión de células de 1 x 10
6 celdas, con sujeción manual. Los tamaños de los tumores se midieron usando un calibre. El volumen del tumor se calculó utilizando la fórmula: (longitud x anchura
2) /2. En el día 38, se recogieron todos los tumores para medir los pesos de los tumores. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por la Universidad de Michigan Directrices para el Uso y Cuidado de los Animales.
El análisis estadístico
ANOVA de dos vías y de dos colas
t
se emplearon: pruebas para analizar la
in vitro
y
in vivo
datos utilizando el software Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA).
P
. & Lt; 0,05 se definió como estadísticamente significativa
Resultados
La expresión de miR-34 en líneas celulares de cáncer de páncreas humano
Hemos examinado una serie de líneas celulares de cáncer de páncreas humano, MIAPaCa2, BxPC3, Capan1, Capan2, Panc-1, y la línea humana de células de fibroblasto pulmonar normal WI-38, por el miR-34a, b, c expresión. También se evaluó en paralelo la expresión de genes y proteínas presunto objetivo regulados por miR-34, utilizando los cebadores y métodos como lo hemos descrito recientemente [6]. células MiaPaca2 y BxPC3 tienen muy bajos niveles de expresión de primaria y maduran miR-34a, b, c, pero los altos niveles de los genes miR-34 diana
BCL2
y
Notch1
, y diferentes niveles de
Notch2-4 gratis (Figura 1). También tienen bajos niveles de expresión de p21 (Figura 1
C
), otro objetivo de ARNm de p53, de acuerdo con el estado de p53 mutante de la línea celular. Sobre la base de estos datos y nuestra observación de que son altamente tumorigénicas y reproducible forman tumorspheres
in vitro
, elegimos las dos líneas celulares para el estudio actual.
Un
, El análisis de transferencia Western.
B Opiniones, QRT-PCR análisis de los niveles relativos de expresión de miR-34.
C
, QRT-PCR análisis de los niveles de expresión de miR-34 genes diana en líneas celulares de cáncer de páncreas humano, así como las células normales de fibroblastos humanos WI-38. Las células se lisaron para extraer el ARN total de QRT-PCR, los datos se normalizaron a la de la actina y los niveles relativos se muestran (actina = 1,000). Nota p21 es un gen diana de p53.
miR-34 restauración mediante transfección de células MiaPaca2 con miR-34 imita
Para investigar los efectos de miR-34 restauración en el cáncer de páncreas células, se transfectaron las células MiaPaca2 con miR-34 imita o no específicos de control miARN mímica (NC gráfico). El análisis de transferencia Western (Figura 2
A
) mostró que la transfección de miR-34 imita downregulated expresión de genes diana, Bcl-2, Notch1 y Notch2 a nivel de proteínas, pero no tuvo ningún efecto sobre la Bcl-xL y MCL -1 expresión, indicando el objetivo de genes knock-down por miR-34 imita afecta a las transcripciones que albergan el miR-34 sitios diana. miR-34a, miR-34b y miR-34c imita todos tenían actividades similares. Figura 2
B Opiniones muestra el QRT-PCR análisis de los posibles genes diana; miR-34 imita inhibieron potentemente
BCL2
y
Notch1
la expresión génica, consistente con los datos de Western blot. Ellos también inhibe la expresión de p21 (Figura 2
B Opiniones), otro de los objetivos de p53, pero tienen un efecto limitado sobre Notch3 y CMET. Curiosamente, la inhibición de la expresión Notch2 a nivel de proteínas por el miR-34 no fue acompañada por la inhibición en el ARNm, de acuerdo con informes anteriores que miARN inhibe la expresión del gen diana post-transcripcional, con o sin la degradación del ARNm [11], [20 ].
Un
, miR-34 regula a la baja la restauración proteínas diana Bcl-2, Notch1 y NOTCH2, no hay efectos sobre MCL-1. células MiaPaca2 fueron transfectadas con miR-34 imita o el control no específico miRNA mimic (NC imitador) (100 pmol por pocillo en placas de 6 pocillos por Lipofectamine 2000) durante 48 horas, a continuación recogen para análisis de transferencia Western.
B Opiniones, en tiempo real, análisis de PCR cuantitativa de los niveles de mRNA de los genes diana potenciales 'después de miR-34 de la transfección en células MiaPaca2 imitan. **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001, Estudiante de
t-test
, n = 2.
C
, Bcl-2 3'UTR luciferasa reportero de ensayo muestra que las transfectadas miR-34 imita son funcionales. células MiaPaca2 fueron co-transfectadas con el Bcl-2 3'UTR informador de luciferasa o su mutante, vector b-gal, junto con cualquiera de miR-34 imita o NC sinóptico. Ensayo de la luciferasa se realizó 24 horas después de la transfección usando Bright Glo-sistema de ensayo de luciferasa. La actividad de luciferasa se normalizó en relación con la actividad de b-gal. barra de error indica s.e.m.
Para evaluar si las transfectadas miR-34 imita son funcionales, se llevó a cabo el ensayo reportero de Bcl-2 3'UTR como hemos descrito recientemente [6], [10]. Los transfectadas miR-34 imita inhibieron la expresión del gen indicador de luciferasa, que es controlado por Bcl-2 3'UTR en la región promotora (Figura 2
C
). Sin embargo, la mutación en la Bcl-2 3'UTR complementaria a la secuencia de semilla de miR-34 abolió este efecto, lo que indica que la actividad observada es específica de secuencia. Los resultados demuestran que el MIR-34 transfectadas son funcionales y confirman que Bcl-2 es un objetivo directo de miR-34, de acuerdo con informes anteriores [8], [10], [21].
Para evaluar los efectos a largo plazo de la restauración de miR-34, que también emplean un sistema lentiviral expresar miR-34a. El sistema lentiviral que expresa el virus de la inmunodeficiencia felina miR-34a (miR-34a-MIF), o el control de vectores (MIF), se utilizó para infectar células MiaPaca2 y BxPC3 y la población de células infectadas fue seleccionado a través de la resistencia a zeocina [6]. Figura S1 muestra la caracterización de los cambios de expresión en las células de miR-34a-MIF. Western blot reveló que la proteína Bcl-2 se redujo reguladas en las células de miR-34a-MIF en comparación con las células de control de vectores MIF (Figura S1
Un
), consistente con QRT-PCR análisis de la Bcl 2 nivel de mRNA (Figura S1
B Opiniones). Bcl-2 3'UTR luciferasa reportero de ensayo mostraron que el miR-34a es funcional en las células de miR-34a-MIF (Figura S1
C
).
miR-34 inhibe la restauración celular MiaPaca2 el crecimiento clonogénico y conduce a la activación de la caspasa-3 y la apoptosis
Después de validar que las transfectadas miR-34 imita eran funcionales, se realizó un ensayo clonogénico para examinar los efectos de miR-34 restauración sobre el crecimiento celular. Como se muestra en la Figura 3
A-B
, miR-34 restauración inhibió significativamente el crecimiento de células clonogénicas, con miR-34a imitar inducir & gt; 80% de inhibición de la formación de colonias en comparación con NC imitan (18,3 ± 3,8 colonias /así frente a 95,3 ± 1,8% colonias /pocillo). Se observaron resultados similares en las células de miR-34a-MIF que crecieron más lentamente que las células de control de MIF, como se indica por tanto la reducción significativa número de Trypan Blue-exclusión de células viables en el ensayo de crecimiento celular (Figura S1
D
) y la reducción de la formación de colonias (Figura S1
e
). También se examinó el efecto de la inhibición de miR-34 endógena sobre el crecimiento celular por mi
RIDIAN
inhibidores de miR-34. Son químicamente mejorados oligonucleótidos que pueden inhibir con eficacia la endógena maduro miR-34 de una sola hebra. inhibidores de miR-34 indujo un aumento de casi 20% en el crecimiento clonogénico en comparación con el control (120,3 ± 2,9 colonias /pocillo vs. 95,3 ± 1,8 colonias /pocillo) (Figura 3
A-B Opiniones). También llevó a cabo un ensayo de invasión celular en las células MiaPaca2 con miR-34 restauración por tanto imitan miR-34a y miR-34a-MIF. miR-34 inhibió significativamente el potencial de invasión de las células MiaPaca2 (Figura S2). Nuestros resultados demuestran que el miR-34 está implicada en el crecimiento celular MiaPaca2; la restauración de miR-34 inhibe el crecimiento clonogénico, y la inhibición de miR-34 endógena por los inhibidores de miR-34 promueve el crecimiento. Nuestros datos son consistentes con la función supresora de tumores informado de miR-34 [6], [8], [9], [11], [22].
MiaPaca2 células fueron transfectadas con el miR-34 o imita inhibidores, 24 horas más tarde las células fueron sembradas en placas de 6 pocillos (200 células /pocillo, por triplicado). Después de 12-14 días de incubación, las placas se lavaron suavemente con PBS y se tiñeron con 0,1% de cristal violeta.
Un
, imágenes representativas de las colonias.
B Opiniones, colonias con más de 50 células fueron contadas.
C
, Restauración de miR-34 conduce a la activación de la caspasa-3. ensayo de activación de la caspasa-3 se llevó a cabo como se describe en en
Materiales y Métodos
. aumento Fold de señal de fluorescencia se calculó dividiendo la señal normalizada en cada muestra tratada con que en el control no tratado. **
P Hotel & lt; 0,01, ***
P Hotel & lt; 0,001, Estudiante de
t-test
, n = 3.
D
, la distribución del ciclo celular de las células transfectadas con MiaPaca2 miR-34 imita. Análisis del ciclo celular se llevó a cabo 1 día después de la transfección. Las células se tiñeron con yoduro de propidio después de la fijación de etanol y se analizaron mediante citometría de flujo.
Dado que la función supresora de tumores p53 está mediada, en parte, a través de inducción de la apoptosis [23], [24], se analizó el efecto de la restauración de miR-34 en la inducción de la apoptosis en las células transfectadas con MiaPaca2 miR-34 imita. Como se muestra en la Figura 3
C
, la transfección transitoria de miR-34 imita resultado en un aumento significativamente la activación de la caspasa-3, una indicación clave de las células que experimentan apoptosis [25]. También se evaluó el efecto de miR-34 imita el ciclo celular. miR-34 imita resultaron en G1 y G2 significativa detención /M y una reducción de células en fase S (Figura 3
D
), consistente con otros informes sobre miR-34 restauración en varios modelos de cáncer [6], [7], [8], [10], [11], [21], [22], [26]. Este efecto sobre el ciclo celular es similar a la de la restauración p53 como se informó anteriormente [23], [24], [27], [28], lo que indica que el miR-34 restauración puede ejercer efectos similares a la restauración de la función supresora de tumores p53, al menos en parte, a la pérdida de las células con p53 de la función.
miR-34 restauración sensibiliza a las células MIAPaCa2 a quimio y radioterapia
a continuación, hemos examinado si el miR-34 podría sensibilizar a la restauración células de cáncer pancreático con un alto nivel de expresión endógena Bcl-2 a la quimioterapia y la radioterapia. Se utilizó el ensayo de citotoxicidad basado en WST-1 como recientemente hemos descrito [6], [18] para evaluar la respuesta de las células para tres agentes quimioterapéuticos, docetaxel, cisplatino y gemcitabina, todos los cuales se utilizan actualmente para la quimioterapia del cáncer de páncreas. Como se muestra en la Figura 4
Un
, miR-34 en las células MiaPaca2 restauración prestados a las células 2-3 veces más sensibles a los agentes quimioterapéuticos, en comparación con las células de control de vectores, sobre la base de los datos de IC50. En los ensayos de apoptosis, la restauración de miR-34a aumentó significativamente gemcitabina o la radiación inducida por la activación de la caspasa-3 (Figura 4
B Opiniones) y las células sub-G1 (Figura 4
C
). También se ha llevado a cabo el ensayo clonogénico, miR-34a imitan sensibilizados células MIAPaCa2 a la radiación de rayos X, con una relación de mejora de la radiación (ER) = 1,3 (Figura 4
D
). Nuestros datos demuestran que el miR-34 restauración puede superar quimio /radioresistance de las células del cáncer pancreático que tienen altos niveles de bajos niveles basales de miR-34-2 y Bcl, y dependen de Bcl-2 para la supervivencia y la resistencia a la terapia.
Un
, miR-34 restauración sensibiliza las células a agentes quimioterapéuticos. El ensayo de citotoxicidad basado en MTT se llevó a cabo usando las células MiaPaca2-miR-34a-MIF y MiaPaca2-MIF estables zeocina-resistentes.
B Opiniones, miR-34 aumenta la restauración de la activación de caspasa-3 inducida por gemcitabina o la radiación de rayos X en las células MiaPaca2. Relativa activación de la caspasa-3 se calculó mediante la normalización de la señal de fluorescencia en cada muestra tratada con la del control imitan o MIF NC 100. *
P
& lt; 0,05, ***
P
& lt; 0,001, de
t-test
, n = 3.
C
, miR-34 aumenta la restauración de la apoptosis inducida por la radiación en MiaPaCa-2 células del Estudiante. Las células fueron transfectadas con mímica miR-34a o NC sinóptico. 24 horas más tarde, las células se sometieron a radiación de rayos X. Las células se recogieron después de otras 48 horas, se tiñeron con yoduro de propidio después de la fijación de etanol, y se analizaron por citometría de flujo para el% de células en fase sub-G1. *
P Hotel & lt; 0,05, prueba t de Student, n = 2.
D
, miR-34 restauración radiosensitized MiaPaCa-2 células. El ensayo clonogénico se llevó a cabo como se describe en
Materiales y Métodos
datos se muestran como media +/- SD /células (n = 3).
CD44 + CD133 + tumorsphere son formadoras y el tumor de células iniciadoras con alta Bcl-2 y la pérdida de la expresión de miR-34
Para investigar el efecto potencial de miR-34 restauración de las células iniciadoras del tumor en la línea celular MiaPaca2, lo primero que examinó el tumor- iniciar célula o población de células madre de cáncer en células MiaPaca2 con diferentes marcadores de superficie celular. Tanto CD44 [29] y CD133 [19], [30] se han utilizado como marcadores para identificar las células madre de cáncer de páncreas de tejidos tumorales humanos. Sin embargo, no hay ningún informe sobre las células madre de cáncer en células MiaPaca2. Se evaluó el estado de CD44 y CD133 en células MiaPaca2 por tinción de inmunofluorescencia y clasificación de FACS. Alrededor de 60% de células CD44 + y son 3-5% de células CD133 + son, sin embargo, sólo 1-2% de las células son CD44 + /CD133 + de doble positivo (Q2 en la figura 5
Un
). Para examinar el potencial de auto-renovación de las células con diferentes perfiles de los marcadores de superficie, se realizó la cultura tumorsphere de las células clasificadas en una placa de cultivo de unión ultrabaja especial con medio condicionado de tumorsphere la cultura [29]. Siete a diez días después, las células MiaPaca2 CD44 + /CD133 + doble positivas creció tumorspheres típicos pero no las células doble negativo CD44- /CD133-, mientras que CD44 + células /CD133- o CD44- /CD133 + de un solo positivos tenido esferas menos y más pequeños (Figura 5
B-C
). Un representante tumorsphere a partir de células CD44 + /CD133 + se muestra en la Figura 5
B Opiniones (inserto). También llevó a cabo un ensayo de dilución limitante del tumor a la iniciación en ratones desnudos usando las células clasificadas, y los datos se resumen en la Tabla 1. CD44- /CD133- células no formaron tumores, mientras que las células 1 × 10
4 CD44 + /CD133 + tumor formado en 4 de cada 4 ratones, 1 × 10
+ células /CD133 + CD44 3 formada tumoral en 2 de 4 ratones, y no hay tumor forman con 1 × 10
2 células. Por lo tanto, nuestros datos demuestran que las células MiaPaca2 de doble positivas CD44 + /CD133 + se enriquecen con células iniciadoras del tumor o células de cáncer de células madre /progenitoras capaces de auto-renovación, pero el /CD133- población de doble negativo CD44- no contiene tales células. Nuestros resultados también sugieren que CD44 /CD133 son marcadores adecuados para las células iniciadoras del tumor en la línea celular MiaPaca2.
Un
, CD44 y CD133 tinción de las células MiaPaca2. MiaPaca2 células se tiñeron por anti-CD44-APC y anti-CD133-PE y ordenados por FACS. Alrededor de 1-2% de las células son CD44 + /CD133 + de doble positivo (Q2).
B-C
, la cultura Tumorsphere de las células clasificadas. Las células clasificadas se cultivaron durante tumorsphere cultivo como se describe en
Materiales y Métodos
. 7-10 días después, se contaron tumorspheres (
B Opiniones). El inserto muestra un tumorsphere representante de CD44 + /CD133 + células MiaPaca2.
C
. La cuantificación del número de células por tumorsphere.